СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВЫСОКОАКТИВНОГО ПОСЕВНОГО МАТЕРИАЛА МИКРООРГАНИЗМОВ Российский патент 1999 года по МПК C12N1/00 C12N1/20 C12N1/16 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и может быть использовано на предприятиях пищевой промышленности и сельского хозяйства, связанных с использованием микроорганизмов.

Известный традиционный способ получения посевного материала для производства продуктов микробного синтеза состоит в последовательном выращивании в несколько стадий исходной культуры до получения требуемого титра клеток. Как правило, для выращивания микроорганизмов используются природные компоненты (мелласа, различные виды муки, сусло, пептон и т.д.) неопределенного состава: аминокислоты, минеральные вещества, стимуляторы роста. Несмотря на это среды с неопределенным химическим составом довольно часто обогащаются витаминами, микроэлементами и источниками азота и фосфора в виде неорганических солей [Г. И. Фертман, М.И.Шойхет. Технология продуктов брожения. М.:Высшая школа, 1976, стр. 120-126, 220-224].

Недостатком традиционного способа получения посевного материала состоит в том, что он не устраняет одну из проблем культивирования микроорганизмов - морфолого-физиологическую гетерогеннность. В итоге с помощью традиционного способа нельзя получить высокоактивный посевной материал, т.к. одновременно с размножением продуктивных клеток развиваются малопродуктивные варианты.

Известен способ получения посевного материала микроорганизмов путем снижения уровня множественной гетерогенности микробных популяций. Сущность способа состоит в насильственной дискриминации особей по их прочностным свойствам и отбором элитарных вариантов популяции клеток по этому признаку. Для гибели клеток используется дезинтегрирующее воздействие, например, декомпрессия [Г. А. Гуревич, Б.А.Фихте. Пороговая механическая дезинтеграция как способ однофакторной детергенизации микробных популяций в витальных условиях. В сб. "Биофизика микробных популяций". Тезисы конференции. Красноярск, 1987 г., стр. 110]. Рассмотренный способ принят за прототип.

Недостаток прототипа состоит в том, что он не позволяет регулировать химический состав клеток популяции в нужном для практики направлении, т.е. в сторону увеличения физиологической активности организма. Следовательно, способ по прототипу не позволяет существенно увеличить выход целевого продукта.

Цель изобретения состоит в переводе культуры в новое устойчивое состояние, интегрально характеризуемое повышением физиолого-биохимической активности клеток и, следовательно, увеличение выхода целевого продукта.

Сущность изобретения состоит в получении активности посевного материала микроорганизмов с повышенными физиолого-биохимическими свойствами. Это достигается выращиванием популяции на среде со смешанно-лигандными комплексами биогенных металлов, вызывающих изменение химического состава клеток и увеличение катализа окислительно-восстановительных и других внутриклеточых ферментов, насыщение липидами мембран и т.д. После выращивания культуральная жидкость подвергается замораживанию в интервале температуры от минус 9^oC до минус 20^oC, т.е. в интервале температуры, в котором формируется крупнокристаллический лед, раздавливающий клетки. После замораживания суспензию клеток размораживают при температуре выращивания культуры. Размораживание проводят при непрерывном встряхивании культуры для предотвращения рекристаллизации, вызывающей дополнительную гибель клеток. Затем этими клетками засеивается питательная среда, содержащая смесь комплексов различной композиции, и проводят выращивание культуры до получения требуемого титра клеток.

При замораживании клеток с различным химическим составом, коррелирующим с физиолого-биохимической активностью клеток, имеет место насильственная дискриминация низкопродуктивных клеток, содержащих меньшее количество липидов в мембранах клетки, при одновременном сохранении элитарных по физиологической активности и интенсивности биохимических процессов вариантов клеток популяции.

Смешанно-лигандные комплексы биогенных металлов являются прешественниками внутриклеточных ферментов (цепи электронного транспорта, ферменты сопряжения окисления с фосфолированием и т.д.), и поэтому их действие на организм проявляется в активировании физиологических и биохимических процессов. Активирование метаболизма клеток сопровождается их изменением химического состава. Например, повышается насыщенность мембран липидами. У дрожжей их увеличение составляет не менее чем 25 - 30%, что повышает выживаемость клеток при замораживании из-за повышения текучести мембран. Насыщение липидами мембран увеличивает транспортные функции клеток, облегчая взаимодействие внутриклеточных ферментов с субстратом, что усиливает физиологическую активность организма.

Изменение химической организации клеток сопровождается повышением катализа ферментов метаболизма, обусловливающее увеличение активность биосинтетических реакций и энергетических процессов, что определяет повышение скорости роста клеток и их развитие. При этом важно отметить, что полученная биомасса клеток отличается высокой физиолого-биохимической активностью.

Гетерогенность культуры обусловливает проявление у различных особей неадекватной реакции на действие комплексов. Это находит отражение в выживаемости и функциональной активности клеток.

Смена активного и анабиотического состояний приводит к снижению уровня множественной гетерогенности за счет насильственной дискриминации особей по прочностным свойствам. Дискриминация особей популяции по прочностным свойствам клеток, выращенных на среде с добавкой комплексов с разнохарактерными лигандами, обеспечивает сохранность элитарных по продуктивности вариантов клеточной популяции. Выращенная биомасса клеток в накопительном режиме при использовании активного посевного материала, полученного путем реализации предлагаемого способа, характеризуется высокими физиологическими свойствами и усиленной биосинтетической активностью целевого продукта.

Для снижения доли расходов, идущих на сырье для комплексов, в общей себестоимости производимого целевого продукта используются оптимальные концентрации ростовых факторов в питательных средах [М.Е.Беккер, Г.К.Лиепиньш, Е. П.Райпулис. М.: ВО "Агропромиздат", 1990 г., стр. 110-111]. Изобретение поясняется примерами.

Пример 1 (контроль).

Выращивание хлебопекарных дрожжей Saccharomyces cerevisiae 14 проводили на среде состава: мелласа - 160 г/л, кукурузный экстракт - 1,6 г/л, олеиновая кислота - 0,1 г/л, (NH₄)₂HPO - 0,3 г/л, (NH₄)₂SO₄ - 0,5 г/л, MgSO₄•7H₂O - 0,5 г/л, MnSO₅•5H₂) - 0,05 г/л, ZnSO₄ - 0,03 г/л, FeCl₃•6H₂O - 0,01 г/л.

Засев питательной среды осуществляли дрожжами в количестве 5% от объема среды. Выращивание дрожжей проводили в колбах на 100 мл с объемом среды 25 мл на качалке со 180 об/мин в течение 16 - 17 часов при температуре 29±1^oC. Полученную биомассу замораживали при минус 15^oC, а размораживали при 29^oC при постоянном встряхивании культуры.

Вторую генерацию дрожжей получали на той же среде при выращивании в качалочных колбах на 750 мл с объемом среды 200 мл, которую засевали дрожжами первой генерации.

Зимазная и мальтазная активность составляла соответственно 59 мин и 90 мин.

С этими дрожжами был приготовлен хлеб безопарным способом по следующей рецептуре: пшеничная мука 1-го сорта - 100 г, дрожжи - 2,5 г, NaCl - 1,5 г, количество воды - расчетное, исходя из влажности муки 44,5%. Тесто замешивалось на лабораторной тестомесильной машине в течение 5 мин при частоте вращения 70 об/мин. Брожение теста проводили в термостате при 30±2^oC. Продолжительность брожения теста принимали до достижения максимальной скорости газообразования дрожжами, которая является оптимальной для технологического процесса тестоприготовления, включая расстойку.

Количество образуемого диоксида углерода составляло 180,5 см³/1 г СВ дрожжей.

Пример 2
Приготовление посевного материала пекарских дрожжей Saccharomyces cerevisiae 14 проводили по аналогии с примером 1 (контроль). Отличие состояло в том, что среда вместо солей металлов содержала их комплексные соединения. Композиция и концентрация были следующие (концентрация дана по металлу): сернокислый магний с ниацином и диаммоний фосфатом - 0,052 г/л, сернокислый магний с пиридоксином и фосфатом калия - 0,002 г/л, сернокислый магний с аспарагиновой и глутаминовой кислотами - 0,45 г/л, сернокислый марганец с пантотеновой кислотой и цистеином - 0,001 г/л, сернокислый цинк с парааминобензойной кислотой - 0,2 мкг/л, сернокислый цинк с метионином и серином - 0,03 г/л, хлористое железо с рибофлавином (1,0 мг/л) и цитратом - 0,01 г/л.

Анализ насыщенности клеток липидами показал, что насыщенность их липидами с ненасыщенными жирнокислотными радикалами по сравнению с контролем увеличилась приблизительно на 30%. Зимазная и мальтазная активность составила 44 мин и 66 мин, т.е. по сравнению с контролем активность этих ферментов брожения существенно увеличилась. Количество образуемого диоксида углерода при брожении теста было равно 218,0 см/1 г СВ дрожжей. Следовательно, в сравнении с контролем его выделилось на 21% больше. Это свидетельствует о более высокой активности посевного материала в опыте, чем в контроле.

Пример 3 (контроль).

Продуцент рибофлавина Eremothecium ashbyii 19 смывали водой с твердой агаризованной среды и выращивали на среде состава (в г/л): дрожжевой экстракт - 15 г/л, декстроза - 20 г/л, кукурузный экстракт - 5 г/л, сернокислый магний -0,5 г/л, сернокислый марганец - 0,05 г/л, гидрофосфат калия - 1,5 г/л, pH 6,6. Выращивали на качалке с 220 об/мин в течение 48 часов при температуре 28^oC. После выращивания клетки центрифугировали и их переносили в раствор с 10% глицерина и замораживали при температуре минус 15^oC. После размораживания клетками засевали ту же среду, находящуюся в 750 мл колбе, и выращивали.

Содержание рибофлавина в культуральной жидкости было 1790 мкг/мл.

Пример 4.

Эксперимент проводили по аналогии с примером 3 (контроль). Отличие состояло в том, что смыв с твердой агаризованной среды клеток осуществляли смесью комплексов (концентрация дана по металлу):
сернокислый магний с тиамином и гидрофосфатом калия - 0,000043 г/л,
сернокислый марганец с ниацином и гидрофосфатом калия - 0,051 г/л,
сернокислый магний с пиридоксином и гидрофосфатом калия - 0,0017 г/л,
сернокислый марганец с пантотеновой кислотой и цистеином - 0,001 г/л.

Комплексы магния и марганца вносились в среду вместо их солей.

После выращивания культуральная жидкость подвергалась центрифугированию и биомасса помещалась в раствор смеси комплексов и замораживалась при минус 15^oC. Затем размораживалась, и этой популяцией засеивали ту же среду и проводили процесс в накопительном режиме.

Выход рибофлавина составил 2058 мкг/мл, т.е. на 15% выше уровня контроля.

Пример 5 (контроль).

Объектом исследований служила культура Bacillus stearothermophilis 631, синтезирующая амилазу. После смыва клеток с агаризованной среды 1 мл культуры засеивали среду состава (в г/л): экстракт солода - 10 г/л, пептон - 10 г/л, экстракт дрожжей - 5 г/л, сернокислый аммоний - 2 г/л, гидрофосфат калия - 3,4 г/л, дигидрофосфат калия - 1,1 г/л, сернокислый магний - 0,5 г/л, сернокислый марганец - 0,05 г/л. Выращивание проводили на качалке с 250 об/мин при температуре 37^oC в течение 24 часов. Культуральную жидкость центрифугировали и биомассу помещали в 10% раствор глицерина и замораживали при 20^oC. После размораживания клетки отмывались водой от глицерина и ими засевали ту же среду объема 300 мл, находящуюся в колбах на 2 л. Объем посевного материала составлял 5% от объема питательной среды. Процесс вели в накопительном режиме.

В результате получено содержание общего протеина 1,46 г/л и активность амилазы - 72,4 ед/л.

Пример 6 (контроль).

Эксперимент проводили по аналогии с примером 5 (контроль). Отличие состояло в том, что смыв клеток с твердой среды проводили смесью комплексов магния с пиридоксином и глицином с концентрацией 0,25 г/л и комплесом марганца с пантотеновой кислотой и цистеином с концентрацией 0,05 г/л. Этой суспензией клеток засевали питательную среду и выращивали биомассу, которую замораживали при минус 15^oC. После размораживания клетками 1-ой генерации засеивали питательную среду, содержащую вышеназванные комплексы, и культуру выращивали в накопительном режиме.

Выход общего протеина составил 1,8 г/л с активностью амилазы 162 ед/л. По отношению к контролю опытный посевной материал имел повышенный биосинтез амилазы, активность которой была приблизительно в 23 раза выше этого параметра амилазы контроля.

Изобретение относится к микробиологической промышленности. Культура выращивается на среде с предшественниками ферментов метаболизма, и полученную биомассу замораживают в интервале температуры от минус 9 до минус 20^oС, размораживают и снова выращивают на среде с предшественниками ферментов до требуемого титра клеток. Способ повышает выход продуктов микробиологического синтеза при выращивании культур микроорганизмов. 1 з.п. ф-лы.

1. Способ приготовления активного посевного материала микроорганизмов, состоящий в снижении уровня множественной гетерогенности микробных популяций за счет насильственной дискриминации особей по их прочностным свойствам и отборе клеток по этому признаку, отличающийся тем, что, с целью получения высокоактивного посевного материала микроорганизмов, культуру выращивают на среде со смешенно-лигандными комплексами - предшественниками внутриклеточных ферментов, содержащих биогенный металл и два разнохарактерных лиганда, а полученную биомассу клеток замораживают в интервале температуры от -9 до -20^oC, размораживают при температуре культивирования и снова выращивают на среде с этими комплексами до получения требуемого титра клеток. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что для получения активного посевного материала микроорганизмов выращенную биомассу клеток, находящуюся в питательной среде, подвергают центрифугированию и выделяют биомассу, которую помещают в раствор смешенно-лигандного комплекса и замораживают, после размораживают при температуре выращивания культуры, затем вносят в питательную среду и выращивают до получения требуемого титра клеток.