СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ГАЛОФИЛЬНЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ Российский патент 1998 года по МПК C12N1/20 

Изобретение относится к медицинской и микробиологической промышленности и касается способов получения биомассы микроорганизмов, в частности галофильных бактерий,в нескольких аппаратах в условиях стабилизации режимов культивирования.

Известны способы культивирования микроорганизмов, заключающиеся преимущественно для галофильных бактерий в периодическом выращивании на питательной среде, содержащей источники углерода, азота, минеральные соли при аэрации среды и освещении белым светом. Выращивание культуры микроорганизмов осуществляют 72-80 ч (авт.св. СССР N 770184). В развитие этого способа для повышения выхода бактериородопсина на стадии поздней логарифмической фазы периодического выращивания в среду выращивания вносят хлорамфеникол, ингибирующий рост галобактерий (авт.св. СССР N 919353).

Наиболее близким техническим решением к предлагаемому способу является способ культивирования микроорганизмов, в частности галофильных бактерий, в нескольких аппаратах в условиях стабилизации режимов культивирования [1].

Процесс выращивания осуществляют при поддержании концентрации растворенного кислорода на уровне 50-55% от насыщения.

Недостатком данного способа является неэффективный полунепрерывный процесс выращивания галофильных бактерий.

Согласно этому способу, в течение 3 ч осуществляют периодический процесс, затем производят замену части питательной среды в рабочем объеме емкости, причем подаваемая свежая питательная среда содержит посевной материал, который предварительно постоянно выращивают в колбах для обеспечения процесса выращивания в емкости.

Таким образом, процесс является трудоемким и малоэффективным по выходу биомассы галофильных бактерий.

Целью изобретения является интенсификация процессов роста галофильных бактерий и повышение эффективности получения биомассы галофильных бактерий при промышленном производстве как самой биомассы, имеющей самостоятельное применение, так и выделяемого из нее бактериородопсина.

Сущность изобретения заключается в том, что в предлагаемом способе культивирования микроорганизмов, в частности галофильных бактерий, в нескольких аппаратах в условиях стабилизации режимов культивирования среду выращивания непрерывно отбирают из одного аппарата, поток среды выращивания распределяют между группой остальных аппаратов пропорционально объему среды выращивания в этих аппаратах, и соответствующее количество среды выращивания из группы аппаратов отбирают в первый аппарат при поддержании объема среды выращивания в каждом аппарате, обеспечивая замкнутый контур циркуляции среды выращивания между всеми аппаратами, причем величина потока циркуляции среды выращивания, отнесенная к общему объему среды выращивания во всех аппаратах, не менее чем в 10 раз превышает удельную скорость роста микроорганизмов.

Кроме того, в процессе выращивания объем среды выращивания увеличивают путем поочередного заполнения аппаратов, включенных в контур циркуляции среды выращивания, а при выращивании галофильных бактерий увеличение объема среды выращивания осуществляют путем включения в контур циркуляции очередного аппарата при достижении концентрации биомассы в среде выращивания на уровне 2-5 г/л добавления свежей питательной среды и прекращают при снижении концентрации биомассы до уровня 1-3 г/л при достижении заданного объема среды выращивания при заданной концентрации биомассы не менее 2-5 г/л начинают непрерывный отбор среды выращивания при непрерывной подаче питательной среды.

Аналогичным образом способ может быть реализован при выращивании других культур микроорганизмов.

Пример. Галофильные бактерии Halobacterium halobium шт. 353П выращивали на комплексной питательной среде, содержащей на 1 л 250 г хлористого натрия, 20 г сернокислого магния, 2 г хлористого калия, 3 г цитрата натрия, 5 г бактопептона, 2 ферментолизата дрожжей или дрожжевого экстракта, 1 мл глицерина. Процесс выращивания производили при 40^oC и pH среды выращивания 7,3-7,4 в условиях аэрирования и перемешивания посредством барботажа компримированного воздуха и освещения люминесцентными лампами дневного света.

Выращивание осуществляли в периодическом режиме с последующим выходом на стационарный непрерывный режим культивирования.

В среду указанного состава объемом 5 л в освещенной и аэрируемой емкости вводили 0,5 л суспензии, содержащей клетки H.halobium, выращенные на качалочных колбах, с концентрацией, соответствующей оптической плотности суспензии на длине волны 490 нм в кювете толщиной 3 мм на уровне 1,0-1,5. В результате исходная концентрация клеток в среде выращивания составляла 0,2 - 0,4 ед. оптической плотности. При обеспечении необходимости уровня освещенности, аэрации, температуры и pH среды происходил рост культуры. При достижении концентрации биомассы 0,9-1,2 ед. оптической плотности (ед. ОП) объем среды выращивания увеличивали путем подачи свежей питательной среды со скоростью 1-2 л/ч. При этом концентрация биомассы выдерживалась на уровне 0,9 - 1,3 ед. ОП. При достижении максимального рабочего объема емкости, равного примерно 15 л, при помощи циркуляционного насоса подключали вторую емкость, работающую в режиме, аналогичном режиму работы первой емкости, объем среды в которой фиксировали на уровне 13 л, и избыток переливали непрерывно в первую емкость. За счет работы циркуляционного насоса условия выращивания по параметрам среды выращивания в обеих емкостях поддерживали одинаковыми. За счет того, что при подключении второй емкости продолжали подачу свежей питательной среды, объем среды выращивания в первой емкости продолжал увеличиваться. При достижении объема среды в первой емкости 15 л подключали третью емкость параллельно второй (т.е. поток среды выращивания, отбираемый из первой емкости, распределяли между второй и третьей емкостью, и избыток объема в этих емкостях непрерывно возвращали в первую емкость). После очередного достижения объема среды выращивания в первой емкости 15 л подключали следующую емкость параллельно предыдущим. По мере увеличения объема среды выращивания в связанной системе емкостей увеличивали поток питательной среды в первую емкость.

При достижении объема среды выращивания во всех подключенных емкостях до уровня 100-150 (8-12 емкостей) поток подаваемой питательной среды устанавливали 4-6 л/ч.

При достижении заданного объема среды выращивания (100-150 л) начинали отбор среды выращивания, содержащей биомассу галобактерий с концентрацией 0,9-1,2 ед.ОП, из рабочего объема выращивания со скоростью, равной скорости подачи питательной среды, тем самым обеспечивая процесс непрерывного культивирования. Непрерывный процесс осуществляли в течение 20-40 сут.

Скорость протока (отношение скорости подачи питательной среды к рабочему объему среды выращивания) в непрерывном процессе культивирования, равную удельной скорости роста микроорганизмов, поддерживали на уровне 0,02-0,08 1/ч. Регулирование pH и температуры среды осуществляли в среде выращивания в первой емкости. Скорость циркуляции среды выращивания между первой емкостью и параллельно подключенными к ней остальными емкостями (7 - 11 емкостей) устанавливали на уровне 100-500 л/ч и относительная скорость циркуляции (отношение потока циркуляции к общему объему среды выращивания) составляла в различных условиях реализации процесса от 0,6 до 2БО 1/ч.

Таким образом, процесс выращивания галофильных бактерий осуществляли при непрерывной циркуляции среды выращивания между отдельными емкостями. При этом поток среды выращивания из первой емкости распределялся между остальными емкостями пропорционально объему каждой из емкостей (в нашем случае одинаковых емкостей - равномерно). Избыток среды выращивания из этих емкостей возвращался в первую емкость. Регулирование pH подачей едкого натра и температуры через теплообменник осуществляли в первой емкости.

Путем варьирования величины потока, создаваемого циркуляционным насосом, общего объема среды выращивания (количества подключенных емкостей) и скорости протока непрерывного процесса культивирования установлено, что минимально допустимое значение отношения относительной скорости циркуляции к скорости потока (удельной скорости роста микроорганизмов) составляет 10-12, при этом разница между первой и остальными емкостями по температуре достигает 2^oC, а по pH среды выращивания - 0,2-0,3 единицы pH, что является предельно допустимым для выращиваемой культуры и стабильности процесса культивирования. Увеличение этого отношения снижает различие в температуре и pH между первой и остальными емкостями, что обеспечивает стабильный режим процесса культивирования.

Способ культивирования галофильных микроорганизмов заключается в том, что осуществляют культивирование галофильных бактерий в нескольких аппаратах в условиях стабилизации режимов культивирования. Среду выращивания непрерывно отбирают из одного аппарата. Поток среды выращивания распределяют между группой остальных аппаратов пропорционально объему среды выращивания в этих аппаратах. Соответствующее количество среды выращивания группы аппаратов отбирают в первый аппарат при поддержании объема среды выращивания в каждом аппарате, обеспечивая замкнутый контур циркуляции среды выращивания между всеми аппаратами. Величина потока циркуляции среды выращивания, отнесенная к общему объему среды выращивания во всех аппаратах, не менее чем в 10 раз превышает удельную скорость роста микроорганизмов. Предложенный способ позволяет интенсифицировать процесс культивирования и облегчает его обслуживание. Выход биомассы - не менее 50 г/л без введения посевного материала по ходу процесса. 3 з.п.ф-лы.

1. Способ культивирования галофильных микроорганизмов в условиях аэрации и освещения на питательной среде, содержащей источники углерода, азота, фосфора и минеральные соли, отличающийся тем, что процесс культивирования осуществляют одновременно в нескольких аппаратах с циркуляцией среды выращивания между аппаратами, причем среду выращивания непрерывно отбирают из одного аппарата, ее поток распределяют между группой остальных аппаратов пропорционально объему среды выращивания в этих аппаратах и соответствующее количество среды выращивания отбирают в первый аппарат при поддержании постоянного объема среды выращивания в каждом аппарате, обеспечивая замкнутый контур циркуляции среды выращивания между аппаратами. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что величина потока циркуляции среды выращивания, отнесенная к общему объему среды выращивания во всех аппаратах, не менее чем в 10 раз превышает удельную скорость роста микроорганизмов. 3. Способ по пп. 1 и 2, отличающийся тем, что в процессе выращивания объем среды выращивания увеличивают путем поочередного заполнения аппаратов, включенных в контур циркуляции среды выращивания. 4. Способ по пп.1 - 3, отличающийся тем, что увеличение объема выращивания путем включения в контур циркуляции очередного аппарата осуществляют по достижении концентрации биомассы в среде выращивания на уровне 2 - 5 г/л и прекращают по снижении концентрации биомассы на уровне 1 - 3 г/л и при достижении заданного объема среды выращивания при заданной концентрации биомассы не менее 2 - 5 г/л осуществляют непрерывный отбор среды выращивания с биомассой микроорганизмов при непрерывной подаче питательной среды, при этом величина потока циркуляции среды выращивания, отнесенная к общему объему среды выращивания, составляет величину не менее 0,5 1/ч.