Способ получения биомассы метанокисляющих микроорганизмов и линия для ее производства Российский патент 2021 года по МПК C12P21/00 C12N1/20 C12M1/02 C12M1/04 C12M1/36 

Изобретение относится к области микробиологии, более конкретно к способу получения биомассы метанокисляющих микроорганизмов и линии для ее производства. Изобретение может найти применение в промышленном производстве биопротеина в виде биомассы аэробных микроорганизмов для биотехнологических целей при использовании в качестве органического сырья газообразного субстрата, например, природного метансодержащего газа, а в качестве метанокисляющих микроорганизмов культур таких, как Methylococcus capsulatus, Methylococcus, Methylosinus, Methylomonas, Methylocystis и др.

Использование микроорганизмов как биологических агентов для получения биомассы и ее производных является важной составной частью биотехнологии. Решение проблемы производства биопротеина микробиологическим путем является перспективным направлением, поскольку микроорганизмы отличаются высоким содержанием белка, сбалансированного по аминокислотному составу. Высокую интенсивность микробного метаболизма характеризует скорость образования белка у бактерий, которая значительно выше, чем у растений и животных.

Метанотрофные бактерии в оптимальных условиях ферментации активно усваивают метан природного газа, быстро размножаются и наращивают свою массу, богатую ценным белком, набором аминокислот, витаминами и иными биологически активными веществами. В восьмидесятых годах в институте ВНИИсинтезбелок (ныне ГосНИИсинтезбелок) была создана технология получения из этой биомассы отличного белково-витаминного кормового продукта с общеизвестным отечественным наименованием - гаприн. В результате выделения активных культур метанотрофов, а также достижения определенных успехов в разработке технологии непрерывного культивирования, стало возможным получать сравнительно высокие урожаи бактерий при таких скоростях протока, которые обеспечивают экономически приемлемую продуктивность процесса.

Развитие производства биопротеина в России позволит обеспечить независимость от импорта белка для кормовых целей и создать национальный источник микробного белка, не подверженный климатическим воздействиям (см. Комплексную программу развития биотехнологий в Российской Федерации на период до 2020 года (утв. Правительством РФ от 24 апреля 2012 г. №1853п-П8). При этом развитие микробиологической промышленности в целом, и конкретно технологии непрерывного культивирования биопротеина, во многом определяется совершенствованием комплекса необходимых мероприятий, связанных с разработкой способов и систем ферментации, проектированием эффективных конструкций биореакторов, разработкой и приобретением соответствующих штаммов бактерий, созданием необходимой засевной культуры и пригодной питательной среды.

Анализ известных технических решений и научно-технической литературы в области производства БВК и кормового белка из микроорганизмов указывает на перспективы в создании биотехнологических производств с использованием крупномасштабных ферментационных установок для получения биопротеина и широкой гаммы биопродуктов при его дальнейшей переработке (см., например, публикации: Ручай, Н. С, Гребенникова И. А. «Технология микробного синтеза» Курс лекций по специальности «Биотехнология». - Минск: БГТУ, 2014; Нетрусов А.И. «Микробиология». Ч. 1 // Биологический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова, Лекции ученых МГУ (VK.COM/TEACHINMSU); Винаров А.Ю., Гордеев Л.С., Кухаренко А.А., Панфилов В.И. под ред. В.А. Быкова. «Ферментационные аппараты для процессов микробиологического синтеза». - М.: ДеЛи Принт, 2005; Андреев А.А., Брызгалов Л.И. «Производство кормовых дрожжей». - М.: 1986 г.; Талонов К.П. «Процессы и аппараты микробиологических производств» - М.: Лег. и пищ. пром-ть, 1981 г. и др. источники).

Из уровня техники, отраженного в патентных базах РФ и других стран, известны технические решения, связанные с созданием новых способов ферментации микроорганизмов, систем, аппаратов и установок для их культивирования (см., например, патенты RU: 2064016, 2021350, 161690, 161691, 2580646, 786326, 2678425, 2562146,2626592, 2050788,2266676,2580646, 2144952, 2352626, 160091,2 699 293,2 654 109; патенты US: 3957585, 4204042, 4656138, 4752564; патенты ЕР: 1419234, GB 1353008, KZ 30516, Евразийский патент №001948 и др.).

Исследование патентной ситуации в отношении заявленного объекта направлено на выявление ближайших аналогов в областях, связанных с получением БВК и биопротеина в широком смысле и, более конкретно, кормового белка в виде биомассы метанокисляющих или метанассимилирующих аэробных микроорганизмов при использовании в качестве органического сырья природного метансодержащего газа.

Известен способ получения биомассы, включающий выращивание микроорганизмов, например дрожжей, на питательной среде, содержащей в качестве источника углерода парафиновые углеводороды, стимуляторы роста, необходимые для роста минеральные соли, отбор культуральной среды, разделение ее на фракции: твердую - дрожжи и жидкую, возврат жидкой фракции на начальную стадию выращивания, дозревание дрожжей, дополнительное разделение дрожжей на жидкую и твердую дрожжевую фракции и высушивание дрожжей. С целью увеличения выхода биомассы при одновременном улучшении ее качества, культуральную среду перед разделением ее на фракции и полученную после разделения жидкую фракцию выдерживают при кислом значении рН (2,7-3,5), а после дозревания (при рН 2,7-5,5)дрожжевую суспензию нагревают до 62-68°С в течение 5-15 мин (см. патент РФ 506613, опубл. 12.05.1976).

Недостатком известного технического решения является тот факт, что снижение рН до 2,7-3,5 возвращаемой отработанной культуральной жидкости позволяет снизить уровень посторонней микрофлоры в процессе, однако не препятствует накоплению продуктов, ингибирующих процесс выращивания. Кроме того, такая обработка возвращаемой культуральной жидкости приведет к значительному повышению расхода аммиачной воды для стабилизации рН процесса.

Известна технологическая линия производства кормовых дрожжей. Линия включает блок выращивания дрожжей с раздельным отбором дрожжевой суспензии и после дрожжевой бражки, последовательно соединенные с ним блоки флотационного сгущения, нагрева сгущенной суспензии, ее окончательного концентрирования и сушки дрожжей. Особенностью известного технического решения является соединение, блока флотационного сгущения с блоком выращивания, линией возврата отфлотированной последрожжевой бражки, а между блоками флотационного сгущения и окончательного концентрирования дрожжей установлен блок нагрева дрожжевой суспензии, причем блок ее нагрева выполнен в виде смесителя с горячей водой или последрожжевой бражки, а блок окончательного концентрирования дрожжевой суспензии - в виде отстойника (см. патент РФ №2266676, опублик. 27.12.2005).

К недостаткам известного технического решения следует отнести выполнение блока нагрева дрожжевой суспензии в виде смесителя с горячей водой и, учитывая, что флотационное разделение не позволяет обеспечить относительно высокую степень сгущения, дополнительное сгущение с горячей водой еще более снижает концентрацию сгущенной биомассы, следствием чего является увеличение нагрузки на последующие стадии производства кормовых дрожжей.

Известен способ получения биомассы метанокисляющих бактерий, предусматривающий выращивание их в ферментере в условиях аэрации на питательной среде, содержащей метан в качестве источника углерода, источники азота, фосфора, минеральные соли и микроэлементы, выделение биомассы из культуральной жидкости, частичный возврат отработанной культуральной жидкости на стадию выращивания, обезвоживание и сушку биомассы. Особенностью известного способа является то, что выращивание биомассы проводят в режиме переменного аэрирования с целью активации молекулярного кислорода путем использования восстановленного кофермента NAD-H (никотинамидадениндинуклеотида) с выдерживанием биомассы по времени без подачи кислорода и с подачей кислорода в соотношении от 1:4 минут до 1:6 минут, причем метан подается в максимально турбулентную аэрированную зону ферментера непрерывно (см. патент РФ №2 699 293, опублик. 04.09.2019).

Недостатком известного способа является усложнение технологического процесса получения биомассы метанокисляющих бактерий, связанное с использованием восстановленного кофермента и периодичностью подачи в биомассу кислорода в поминутном режиме. С учетом того, что даже при концентрации биомассы 7-8 г/л, исчерпание кислорода в среде происходит в течение 20-30 сек, так что окисление метана без кислорода становится невозможным. Таким образом, процесс будет периодически находится в анаэробных условиях, с повышенным пенообразованием и повышенным выделением продуктов метаболизма в культуральную жидкость. Это не позволит обеспечить высокие показатели процесса получения биомассы, кроме того, повышенные концентрации продуктов метаболизма в отработанной культуральной жидкости (ОКЖ) потребуют снижения количества возвращаемой ОКЖ.

Наиболее близким техническим решением, к предложенному, является способ получения биомассы метанокисляющих микроорганизмов, включающий их непрерывное выращивание на водно-минеральной питательней среде при подаче метансодержащего газа и газа, содержащего свободный кислород, с использованием отработанной среды после концентрирования биомассы, и ее сушку (см. патент РФ №2064016, опублик. 20.07.1996-прототип).

Особенность известного способа состоит в том, что процесс выращивания микроорганизмов осуществляют при давлении в среде выращивания, выше атмосферного, с частичным использованием в процессе выращивания отработанной среды после концентрирования биомассы, при этом скорость подачи компонентов питания микроорганизмов в процесс и отбора суспензии, содержащей биомассу, из процесса непрерывного выращивания микроорганизмов, устанавливают пропорционально потоку, подаваемому для стабилизации рН среды выращивания. Отношение потока возвращаемой в процесс выращивания отработанной среды, после концентрирования, к потоку отбираемой из процесса суспензии устанавливают так, чтобы обеспечить максимальное значение потока, подаваемого для стабилизации рН среды выращивания, а давление в среде выращивания устанавливают на уровне, минимальном, для обеспечения оптимальной концентрации растворенного кислорода в среде выращивания, но не ниже давления, необходимого для транспортировки и энергетической утилизации отходящих из процесса газовых потоков. Устройство, реализующее известный способ, включает средства для приготовления питательной среды, биореактор для выращивания микроорганизмов с использованием метансодержащего и кислородсодержащего газов, средства для концентрации и сушки биомассы.

В известном техническом решении одним из существенных признаков является частичное использование в процессе выращивания микроорганизмов отработанной среды после концентрирования биомассы, которое зависит от отношения потока возвращаемой в процесс выращивания отработанной среды к потоку отбираемой из процесса суспензии. Упомянутое отношение зависит от ряда влияющих на процесс выращивания микроорганизмов факторов, таких как, рН среды выращивания, количество растворенного кислорода, рабочего давления и др. По указанным причинам устройство для реализации известного способа отличается сравнительно сложной системой автоматического управления параметрами процесса получения биомассы метанокисляющих микроорганизмов. Кроме того, в известном техническом решении состав отработанной среды, возвращаемой в процесс выращивания, по содержанию органических веществ, может колебаться в значительных пределах (в пересчете на химическое потребление кислорода). Поскольку в отработанной среде содержится значительное количество сопутствующей микрофлоры, необходимо учитывать соответствие состава отработанной среды и используемой культуры, что возможно при условии дополнительной очистки отработанной среды до начала процесса нитрификации при меньших значениях величины химического потребления кислорода.

Задача, на решение которой направлено изобретение, состоит в повышении технико-экономической эффективности и конкурентоспособности способа производства биомассы метанокисляющих микроорганизмов культур, например, Methylococcus capsulatus, с возможностью оптимизации процесса культивировании белковой массы по показателям продуктивности готового продукта и экологичности его производства.

Технический результат, достигаемый при решении поставленной задачи, заключается в устранении недостатков известных технических решений, увеличении эффективности и продуктивности промышленного производства биопротеина при снижении затрат, связанных, в том числе, с потреблением очищенной воды на единицу готовой продукции. Указанное снижение затрат достигается возвратом отработанной среды или отработанной культуральной жидкости (ОКЖ) после концентрирования биомассы в питательную среду при промышленном выращивания микроорганизмов. Дополнительный технический результат состоит в значительном снижении сбросов жидких технологических отходов при производстве биопротеина.

Указанный технический результат достигается тем, что в способе получения биомассы метанокисляющих микроорганизмов, включающем их непрерывное выращивание на водно-минеральной питательней среде при подаче метансодержащего газа и газа, содержащего свободный кислород, с использованием отработанной среды после концентрирования биомассы, и ее сушку, согласно изобретению, после концентрирования биомассы отработанную среду отделяют и охлаждают до температуры 30-32°С, затем подвергают непрерывной аэробной ферментации, в условиях асептического культивирования сопутствующей микрофлоры, с последующим разделением на биомассу сопутствующей микрофлоры и жидкую фазу, которую возвращают в водно-минеральную питательную среду для непрерывного выращивания биомассы метанокисляющих микроорганизмов и покрытия расхода свежей воды.

Кроме того, условия асептического культивирования сопутствующей микрофлоры на стадии аэробной ферментации могут обеспечиваться механической и бактериологической стерилизацией воздуха, служащего источником кислорода, а отделенная биомасса сопутствующей микрофлоры может быть частично или полностью направлена на инактивацию и сушку биомассы после ее концентрирования.

Указанный технический результат достигается также тем, что в линии для производства биомассы метанокисляющих микроорганизмов по любому из пп.1,2,, содержащей блок для приготовления водно-минеральной питательной среды, блок выращивания чистой культуры со средствами ввода чистой культуры метанокисляющих микроорганизмов, блок непрерывного выращивания микроорганизмов, включающий средства для подачи метансодержащего газа и газа, содержащего свободный кислород, необходимых для роста микроорганизмов в соответствии с потребностями выбранной культуры, блок концентрирования биомассы, выполненный с возможностью использования отработанной среды и блок сушки биомассы, согласно изобретению, блок концентрирования биомассы снабжен двумя выходами, первый из которых соединен через блок инактивации с входом блока сушки биомассы, а второй соединен через блок охлаждения отработанной среды, блок аэробной ферментации, в условиях асептического культивирования сопутствующей микрофлоры, и блок разделения на биомассу сопутствующей микрофлоры и жидкую фазу, с входом блока непрерывного выращивания биомассы метанокисляющих микроорганизмов, совмещенным с входом для покрытия расхода свежей воды, причем блок разделения снабжен двумя дополнительными выходами для соединения с дополнительными входами блока концентрирования биомассы метанокисляющих микроорганизмов и блока аэробной ферментации.

Такое выполнение способа получения биомассы метанокисляющих микроорганизмов и линии для ее производства обеспечивают решение поставленной задачи, с достижением указанного технического результата благодаря тому, что блок концентрирования биомассы выполнен с возможностью непрерывного раздельного отбора отработанной среды или отработанной культуральной жидкости для образования контура ее принудительного возврата в блок непрерывного промышленного выращивания метанокисляющих микроорганизмов через последовательно соединенные блоки: блок охлаждения отработанной среды, преимущественно, до температуры 30-32°С, оптимальной для интенсификации роста сопутствующей микрофлоры, блок аэробной ферментации в условиях асептического культивирования сопутствующей микрофлоры и блок разделения на биомассу сопутствующей микрофлоры и жидкую фазу, для покрытия ею расхода свежей воды. При этом, блок разделения снабжен двумя дополнительными выходами для соединения с дополнительными входами блока концентрирования биомассы метанокисляющих микроорганизмов и блока аэробной ферментации. Наличие в контуре принудительного возврата ОКЖ блока ее охлаждения до указанной температуры обеспечивает оптимальные условия для биологической обработки ОКЖ в блоке аэробной ферментации с помощью сопутствующей микрофлоры, блока разделения, обеспечивающих очистку в непрерывном режиме на стадии аэробной ферментации до начала процесса нитрификации ОКЖ без контакта с окружающей средой.

Состав ОКЖ, в зависимости от режимов выращивания на стадии промышленного выращивания метанокисляющей культуры, по общему содержанию органических веществ в пересчете на химическое потребление кислорода (ХПК), может колебаться от 700 до 3000 мг/л. При этом в ОКЖ содержится основное количество сопутствующей микрофлоры, образующейся при выращивании используемой культуры. В итоге процесс биологической обработки ОКЖ на следующей стадии ферментации представляет собой непрерывный аэробный процесс, когда в качестве источника кислорода используется воздух, прошедший механическую и бактериологическую очистку или кислород. В результате, используемые культуры микроорганизмов для окисления органических веществ, содержащихся в обрабатываемой ОКЖ, соответствуют составу сопутствующей микрофлоры, при выращивании производственной культуры в блоке промышленного выращивания метанокисляющих микроорганизмов.

В соответствии с изобретательским замыслом, блок дополнительной стадии аэробной ферментации представляет собой закрытый биореактор любой известной конструкции, имеющий незначительную энергоемкость и функционирующий в условиях асептического культивирования сопутствующей микрофлоры. При этом, глубина очистки ОКЖ на стадии аэробной ферментации ведется, как было указано, до начала процесса нитрификации, обычно до ХПК в диапазоне значений 100-200 мг/л. Для обеспечения стабильного качества очистки ОКЖ, например, в случае резкого повышения содержания органических веществ в исходной ОКЖ, предусмотрена возможность подачи дополнительной биомассы из блока разделения в блок аэробной ферментации.

Предложенное выполнение линии для производства биомассы метанокисляющих микроорганизмов, как было указано, устраняет недостатки известных технических решений в части сброса избыточной ОКЖ. Указанные недостатки свойственны также технологиям производства кормового белка гаприн, включающим последовательное соединение блоков производства чистой культуры микроорганизмов, приготовления растворов минерального питания, производственной ферментации, концентрирования биомассы, инактивации и сушки готового продукта. Реализация предложенного технического решения напрямую связана с увеличением эффективности и продуктивности промышленного производства, с одновременным снижением себестоимости целевого продукта, благодаря введению в технологическую линию контура возврата отработанной среды через блок аэробной ферментации в блок промышленного выращивания метанокисляющих микроорганизмов.

На Фиг. 1 приведена блок-схема линии для производства биомассы метанокисляющих микроорганизмов или кормового белка.

Линия для производства кормового белка содержит блок 1 для производства чистой культуры метанокисляющих или метанассимилирующих микроорганизмов для начального выращивания засевной биомассы и запуска промышленного ферментера. При этом, для получения микробной биомассы используется непатогенная и конкурентно способная, по отношению к применяемым видам метанокисляющих бактерий, культура вида Methylococcus capsulatus, Methylococcus, Methylosinus, Methylomonas, Methylocystis и др. Линия для производства кормового белка содержит блок 2 для раздельного приготовления и непрерывной подачи раствора питательной среды (минерального питания) на вход блока 3 для промышленного выращивания микроорганизмов (произволственный ферментер). Блок 2 включает средства для подготовки минеральной питательной среды путем растворения в свежей или очищенной воде минеральных солей до нужных концентраций и в определенных соотношениях, соответствующих используемой культуре метанассимилирующих микроорганизмов. В состав питательной среды входят соли магния, калия, железа, марганца, натрия, кальция и др., при этом рН среды поддерживают на требуемом уровне, например, с использованием аммиачной воды и сульфата натрия, которые одновременно являются, соответственно, источниками азота и серы. Блоки 1 и 2, соответственно, включают технические средства для производства чистой культуры метанассимилирующих микроорганизмов и приготовления стерильного раствора питательной среды (емкости, трубопроводную арматуру, дозаторы, датчики и измерители давления температуры и состава сред, запорные и регулирующие вентили, насосы и пр.). В частном случае, выход блока 1 может быть соединен с одним из входов блока 2, как это показано на Фиг. 1. Выход блока 2, в свою очередь, соединен с одним из входов блока 3 для промышленного выращивания микробной белковой массы в соответствии с потребностями выбранной культуры на принятых режимах выращивания микроорганизмов. На другие входы блока 3 промышленного ферментера также поступают дополнительные компоненты для организации процесса биосинтеза в культуральной жидкости. В известных промышленных ферментерах это свежая вода, жидкие элементы минерального питания, метансодержащий и кислородсодержащий газы, необходимые для роста микроорганизмов в рабочем объеме блока 3 (входы компонентов показаны условно стрелками). В соответствии с предложенной блок -схемой выход блока 3 соединен через блок 4 концентрирования биомассы, блок 5 инактивации, блок 6 сушки биомассы, блок 7 грануляции, блок 8 фасовки с блоком 9 упаковки готового продукта.

Блок 4 концентрирования биомассы выполнен с возможностью непрерывного отбора отработанной культуральной жидкости. Для этого блок 4 снабжен дополнительным выходом для отбора и принудительной подачи ОКЖ через блок 10 охлаждения, блок 11 аэробной ферментации меньшей производительности и блок 12 разделения, на дополнительный вход блока 3 промышленного выращивания микроорганизмов в покрытие расхода свежей воды. Выполнение блока 4 концентрирования биомассы с возможностью непрерывного раздельного отбора ОКЖ обеспечивает функционирование контура, обеспечивающего полный возврат ОКЖ в блок 3 для промышленного выращивания микроорганизмов. Контур возврата ОКЖ формируется путем соединения дополнительного выхода блока 4 концентрирования биомассы через циркуляционный насос (цн), блок 10 охлаждения, блок 11 стадии аэробной ферментации и блок 12 разделения, с дополнительным входом блока 3 для промышленного выращивания микроорганизмов в покрытие расхода свежей воды. Выращенная при этом биомасса может подаваться, по одному варианту, на стадию промышленной ферментации в блок 3, обеспечивая работу внешнего контура циркуляции, или, по другому варианту, после разделения бактериальной суспензии в блоке 12 - на дополнительный вход блока 4 концентрирования биомассы. По третьему варианту часть сгущенной биомассы через дополнительный выход блока 12 разделения направляется обратно на дополнительный вход в блок 11 аэробной ферментации для стабилизации качества биологической обработки ОКЖ, например, в случае резкого повышения в ней содержания органических веществ. В случае снижения концентрации биомассы сопутствующей микрофлоры, связанной со снижением концентрации органических загрязнений в ОКЖ, поступающей на вторую стадию ферментации, выход блока 11 может быть соединен напрямую с дополнительным входом блока 3. Конструктивное выполнение блоков 1-12 может быть новым или содержать известные конструктивные решения для биотехнологических систем и устройств.

Функционирование предложенной линии для производства кормового белка осуществляется следующим образом.

Производство белковой массы из метансодержащего сырья в предложенной линии для производства кормового белка связано с выполнением ряда стадий, в которых происходит подготовка необходимых составляющих для выращивания биомассы метанокисляющих микроорганизмов и ее переработки в целевой продукт.Стадии подготовки засевной биомассы и функционирование блока 2 для раздельного приготовления и непрерывной подачи растворов питательных солей, а также метансодержащего и кислородсодержащего газов в блок 3 промышленного производства метанокисляющих микроорганизмов, в соответствии с потребностями выбранной культуры, обеспечивают выращивание биомассы на принятых режимах. Как было указано, в качестве органического сырья может использоваться газообразный субстрат, например, природный метансодержащий газ, а в качестве микроорганизмов - культуры Methylococcus capsulatus, Methylococcus, Methylosinus, Methylomonas, Methylocystis и др.

Подготовка кислородсодержащего (воздуха) и углеродсодержащего сырья (метана) осуществляется в дополнительных блоках, включающих средства для разделения воздуха на кислород и азот, очистки метансодержащего природного газа и их дозированной подачи в блок 3 промышленного производства метанокисляющих микроорганизмов (не показаны). В большинстве случаев используется природный газ - метан и/или метансодержащие газы, содержащие не менее 90% метана. В отношении использования кислородсодержащего газа необходимо учитывать следующее условие - содержание в газе кислорода, должно обеспечивать оптимальные удельные значения в отношении текущей и прогнозируемой концентрации микроорганизмов в культуральной жидкости ферментера блока 3. Непрерывный процесс выращивания биомассы микроорганизмов осуществляется в условиях аэрации и многократного циклического перемешивания ферментационной среды. В процессе циркуляции и турбулизации культуральной жидкости в блоке 3 происходит многократный захват и растворение в жидкости кислорода воздуха, обеспечивается выравнивание концентраций питательных компонентов в ферментационном объеме и отвод газообразных продуктов метаболизма (в частности, СО₂), которые вместе с остаточными количествами не растворившихся газов выводятся из блока 3. Отходящие газы, выделяющиеся в процессе выращивания микроорганизмов, могут быть направлены в блоки 5, 6, соответственно, инактивации и сушки биомассы после ее концентрирования для снижения расхода свежего газа и дополнительного повышения эффективности промышленного производства биопротеина.

Как было указано, в блок 3 промышленного производства метанокисляющих микроорганизмов, кроме метана (природный газ) и кислорода (воздух), непрерывно подается водный раствор аммиака, фосфорная кислота, растворы элементов минерального питания и биологически обработанная отработанная среда для разбавления. При этом количество используемой биологически обработанной отработанной среды для разбавления культуральной жидкости составляет не менее 90-95% от общей потребности предприятия в технологической воде. Скорость жидкостного протока в биореакторе блока 3 поддерживается равной удельной скорости роста бактерий (режим хемостата), что обеспечивает постоянную концентрацию биомассы в процессе культивирования. Суспензия бактериальной биомассы, в жидкой фазе которой содержатся экзоцеллюлярные продукты метаболизма и продукты окисления гомологов метана, непрерывно выводится из блока 3 и направляется в блок 4 концентрирования для отделения биомассы от жидкой фазы. Технологическая вода, получаемая в условиях промышленного производства из природных источников, должна пройти необходимую очистку и обеззараживание до установленных требований. Отработанная среда выращивания содержит продукты метаболизма микроорганизмов, часть которых, при определенных концентрациях, ингибирует процесс роста микроорганизмов. В отработанной среде также имеются продукты окисления гомологов метана, содержащихся в природном газе, которые оказывают ингибирующее влияние на рост основной культуры метанокисляющих бактерий.

Особенностью метанокисляющих бактерий является высокая чувствительность к концентрации указанных органических веществ в жидкой фазе, на которых развивается сопутствующая микрофлора, частично снижающая в процессе своего роста их уровень. Практически, технологически интересный рост чистой культуры без сопутствующей микрофлоры, для которой питанием являются органические соединения, содержащиеся в жидкой фазе, невозможен. Видовой состав сопутствующей микрофлоры зависит от режимов выращивания основной культуры и содержания гомологов метана в природном газе. В связи с этим, в промышленных ферментационных установках культивируются примерно 70-90% основной культуры и 30-10% сопутствующей микрофлоры. По этой причине снижение уровня продуктов метаболизма в возвращаемой культуральной жидкости, в результате ее обработки в блоках 10, 11 и 12, позволяет обеспечить возможность полного использования обработанной культуральной жидкости в блоке 3 без снижения эффективности процесса.

Непрерывный отбор отработанной культуральной жидкости из блока 4 концентрации осуществляется через дополнительный выход, с принудительной подачей ОКЖ, и последовательно соединенные блок 10 охлаждения, блок 11 дополнительной стадии аэробной ферментации меньшей производительности и блок 12 разделения на дополнительный вход блока 3 для промышленного выращивания микроорганизмов в покрытие расхода свежей воды. Часть культуральной жидкости, в составе сгущенной бактериальной биомассы, после блока 4 концентрации направляется через блок 5 инактивации, блок 6 сушки, блок 7 грануляции и блок 8 фасовки на блок 9 упаковки готового продукта - кормового белка, содержащего более 70% протеина, для отправки потребителю.

В известных технических решениях отделенная отработанная среда или ОКЖ составляет до 95% от исходного потока через биореактор. Как было указано, ОКЖ содержит экзоцеллюлярные продукты метаболизма и фоновые концентрации минеральных солей. Кроме того, необходимо учитывать, что в ОКЖ содержится до 70 -100 мг/л фосфора (требуемая степень очистки до ПДК в водоеме 2 мг/л), азот аммонийный 40 -100 мг/л (ПДК в водоеме 0,5 мг/л), сульфаты - больше 100 мг/л (ПДК в водоеме 100 мг/л). Поэтому очистка ОКЖ для ее утилизации является не только сложной технически, но и весьма затратным мероприятием. Кроме того, при выделении фосфора образуется достаточно большое количество осадка, утилизация которого также является проблемой. Обычно концентрация биомассы в суспензии на выходе биореактора составляет величину 1,5-3,0%, в зависимости от режима его работы. Таким образом, в случае крупного промышленного производства биопротеина, стоимость 1 м³ свежей воды является величиной большей, в 3-4 раза, чем стоимость 1 м³ природного газа, что при прямоточном режиме, значительно влияет на себестоимость производства кормового белка.

С целью исключения накопления экзоцеллюлярных продуктов метаболизма и продуктов окисления гомологов метана, при возврате в процесс выращивания биомассы, ОКЖ подвергается биологической обработке в блоке 11, являющимся биореактором аэробной ферментации второй или дополнительной ступени. В отличие от известного метода двух стадийной ферментации, когда ферментер второй ступени используется для повышения производительности ферментационного процесса в целом, дополнительная ступень аэробной ферментации, в предложенном техническом решении, используется для снижения концентрации органических соединений до концентрации, позволяющей вернуть обработанную ОКЖ в основной процесс без ущерба для его продуктивности. При этом микроорганизмы, обеспечивающие конверсию экзоцеллюлярных продуктов и продуктов окисления гомологов метана, представлены бактериями, являющимися сопутствующими культурами основного процесса.

Целесообразность использования предложенного функционирования контура возврата ОКЖ в блок 3 можно пояснить следующим образом. На первой или основной стадии промышленной ферментации осуществляется прямоточный режим выращивания метанокисляющих микроорганизмов, поэтому концентрация сопутствующей биомассы коррелируется с уровнем продуктов метаболизма в блоке 3. Учитывая, что для сопутствующих бактерий используемая температура выращивания основной культуры (41-43°С) не является оптимальной для сопутствующей культуры, их скорость роста будет ниже удельной скорости роста основной культуры. Поэтому сопутствующие бактериальные культуры вымываются из процесса ферментации первой ступени, что снижает их эффективность для снижения образующихся продуктов метаболизма. В этой ситуации, некоторое увеличение уровня сопутствующей микрофлоры, за счет рециркуляции ее со второй стадии ферментации в блоке 11, позволяет дополнительно снизить уровень продуктов -метаболизма в процессе ферментации первой ступени и, тем самым, повысить продуктивность процесса выращивания основной культуры в предложенной линии для производства кормового белка.

Для интенсификации роста сопутствующей микрофлоры на стадии аэробной ферментации в блоке 11 температура процесса должна удерживаться, как было указано, преимущественно, на уровне 30-32°С. Для локализации возможных флуктуаций режимов выращивания на первой ступени промышленной ферментации в блоке 3 и дополнительного повышения эффективности конверсии продуктов метаболизма и окисления гомологов метана, на второй стадии аэробной ферментации в блоке 11, предусмотрен внешний контур циркуляции. Данный контур обеспечивает поступление бактериальной суспензии от блока 11 на вход блока 12 разделения, через дополнительный выход которого часть отделенной биомассы возвращается на ферментацию второй ступени в блок 11 через дополнительный вход, как показано на Фиг. 1. Указанная схема работы линии для производства кормового белка позволяет, при резком изменении концентрации продуктов метаболизма в ОКЖ, повысить концентрацию биомассы на второй стадии ферментации и обеспечить постоянство остаточных продуктов метаболизма в ОКЖ, подаваемой на первую стадию промышленной ферментации блока 3. Такое техническое решение позволяет оптимизировать процесс промышленного получения белковой массы метанокисляющих микроорганизмов при соответствующем изменении режимов асептического культивирования сопутствующей микрофлоры. С целью исключения возможности внесения в процесс на второй стадии ферментации посторонней микрофлоры система «первая ферментация - выделение биомассы после первой стадии ферментации - вторая ферментация» должна быть защищена известными методами, исключающими термическую обработку ОКЖ.

Состав ОКЖ, в зависимости от режимов функционирования биореактора, на первой стадии выращивания производственной культуры в блоке 3, по общему содержанию органических веществ в пересчете на химическое потребление кислорода (ХПК), может колебаться от 700 до 3000 мг/л. Как было указано, процесс биологической обработки ОКЖ, на второй стадии ферментации в блоке 11, представляет собой непрерывный аэробный процесс - прямоточный или с внешним контуром циркуляции биомассы. В качестве источника кислорода используется воздух, прошедший механическую и бактериологическую очистку или кислород. Режим эксплуатации блока 11, потребность в кислороде, та или иная степень рециркуляции биомассы, определяются величиной концентрации органических веществ в обрабатываемой ОКЖ. Используемые культуры микроорганизмов для окисления органических веществ, содержащихся в обрабатываемой ОКЖ, соответствуют составу сопутствующей микрофлоры при выращивании производственной культуры в биореакторе блока 3 первой ступени. Глубина очистки ОКЖ на второй стадии ферментации ведется до начала процесса нитрификации, обычно до ХПК 100-200 мг/л. Конструктивно блок 11 второй ступени аэробной ферментации представляет собой герметичный биореактор известной конструкции с незначительной энергоемкостью.

В настоящее время синтез кормового белка из природного газа является приоритетным направлением развития биотехнологической промышленности в России и за рубежом. Предложенное выполнение способа получения биомассы метанокисляющих микроорганизмов и линии для ее производства обеспечивают повышение эффективности и продуктивности промышленного производства биомассы микроорганизмов с характеристиками целевого продукта, соответствующего свойствам перспективного продукта гаприн, в том числе, за счет снижения затрат, связанных с кардинальным снижением потребления очищенной воды на единицу готовой продукции и соответствующего уменьшения количества сбросов жидких отходов.

Проведенный анализ уровня техники и существа известных технических решений свидетельствуют о том, что предложенный способ получения биомассы метанокисляющих микроорганизмов и линия для производства биопротеина относятся к новым объектам, имеющим изобретательский уровень и промышленную применимость в микробиологической промышленности, сельском хозяйстве, здравоохранении и других отраслях экономики.

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Предложен способ получения биомассы метанокисляющих микроорганизмов и линия для его осуществления. Способ включает выращивание биомассы с использованием отработанной среды после концентрирования биомассы и ее сушку. После концентрирования биомассы отработанную среду отделяют и охлаждают, подвергают аэробной ферментации с последующим разделением на биомассу сопутствующей микрофлоры и жидкую фазу. Жидкую фазу возвращают в питательную среду для выращивания биомассы. Линия содержит блок для приготовления питательной среды, блок выращивания чистой культуры, блок непрерывного выращивания микроорганизмов, блок концентрирования биомассы и блок сушки биомассы. Блок концентрирования биомассы снабжен двумя выходами, первый из которых соединен через блок инактивации с входом блока сушки биомассы, а второй соединен с входом блока непрерывного выращивания биомассы метанокисляющих микроорганизмов. Изобретения обеспечивают увеличение эффективности и продуктивности промышленного производства биопротеина при снижении потребления очищенной воды на единицу готовой продукции. 2 н. и 1 з.п. ф-лы, 1 ил.

1. Способ получения биомассы метанокисляющих микроорганизмов, включающий их непрерывное выращивание на водно-минеральной питательней среде при подаче метансодержащего газа и газа, содержащего свободный кислород, с использованием отработанной среды после концентрирования биомассы, и ее сушку, отличающийся тем, что после концентрирования биомассы отработанную среду отделяют и охлаждают до температуры 30-32°С, затем подвергают непрерывной аэробной ферментации в условиях асептического культивирования сопутствующей микрофлоры с последующим разделением на биомассу сопутствующей микрофлоры и жидкую фазу, которую возвращают в водно-минеральную питательную среду для непрерывного выращивания биомассы метанокисляющих микроорганизмов и покрытия расхода свежей воды.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что условия асептического культивирования сопутствующей микрофлоры на стадии аэробной ферментации обеспечиваются механической и бактериологической стерилизацией воздуха, служащего источником кислорода, а отделенная биомасса сопутствующей микрофлоры частично или полностью направлена на инактивацию и сушку биомассы после ее концентрирования.

3. Линия для производства биомассы метанокисляющих микроорганизмов способом по любому из пп.1, 2, содержащая блок для приготовления водно-минеральной питательной среды, блок выращивания чистой культуры со средствами ввода чистой культуры метанокисляющих микроорганизмов, блок непрерывного выращивания микроорганизмов, включающий средства для подачи метансодержащего газа и газа, содержащего свободный кислород, необходимых для роста микроорганизмов в соответствии с потребностями выбранной культуры, блок концентрирования биомассы, выполненный с возможностью использования отработанной среды, и блок сушки биомассы, отличающаяся тем, что блок концентрирования биомассы снабжен двумя выходами, первый из которых соединен через блок инактивации с входом блока сушки биомассы, а второй соединен через блок охлаждения отработанной среды, блок аэробной ферментации в условиях асептического культивирования сопутствующей микрофлоры и блок разделения на биомассу сопутствующей микрофлоры и жидкую фазу с входом блока непрерывного выращивания биомассы метанокисляющих микроорганизмов, совмещенным с входом для покрытия расхода свежей воды, причем блок разделения снабжен двумя дополнительными выходами для соединения с дополнительными входами блока концентрирования биомассы метанокисляющих микроорганизмов и блока аэробной ферментации.