Изобретение относится к медицине.
Изобретением предлагаются новые производные пептидов, проявляющие противоопухолевую активность, с потенциально улучшенным терапевтическим действием при лечении неопластических заболеваний по сравнению с доластатином-10 и -15 (патент США 4879278, 7 ноября 1989 года; патент США 4816444, 28 марта 1989 года). Кроме того, в отличие от доластатина-10 и -15, который должен быть выделен лабораторным путем из редких натуральных источников, соединения по настоящему изобретению могут быть синтезированы, как подробно описано ниже. Помимо этого доластатин-10 неустойчив к кислотам. Описано, что даже небольшие изменения в структуре могут вызвать полную потерю активности (Biochemical Pharmacology, том 40, N 8, 1859-1864, 1990).
Изобретением также предлагается фармацевтическая композиция с использованием новых производных пептидов.
Соединения по изобретению включают новые пептиды формулы I
где R 1 - алкокси, низший алкил, циклоалкил, фторалкил; аминосульфонил, который может быть замещен алкилом; гидрокси или NR3R4, где каждый R3 и R4 может быть либо водородом, либо алкилом;
R2 - водород, алкил, фторалкил, циклоалкил;
R1-N-R2 вместе могут обозначать 5-членный гетероцикл, который может быть незамещенным или замещенным одним или более заместителями, представляющими собой алкильные группы;
A - остаток валила, изолейцила, лейцила, аллоизолейцила, α-аминоизобутаноила, 3-трет-бутилаланила, 2-трет-бутилглицила, 3-циклогексилаланила, 2-этилглицила, 2- циклогексилглицила, норлейцила, норвалила;
B - остаток N-алкилвалила, -норвалила, -лейцила, -изолейцила, -2-трет-бутилглицила, -3-трет-бутилаланила, -3-циклогексилаланила, -фенилаланила или -2-циклогексилглицила;
D, E, F и G независимо выбирают из группы, состоящей из остатков пролила, гомопролила, гидроксипролила, тиазолидинил-4-карбонила, 1-аминопентил-1-карбонила, валила, 2-трет-бутилглицила, изолейцила, лейцила, 3-циклогексилаланила, фенилаланила, N-метилфенилаланила, тетрагидроизохинолил-2-карбонила, 3-тиазолилаланила, 3-тиенилаланила, гистидила, 1-аминоиндан-1-карбонила, аргинила, 3-пиридилаланила, 3-трет-бутилаланила, 2-циклогексилглицила, норвалила, норлейцила и 3-нафтилаланила;
X - водород, алкил, циклоалкил, -CH2-циклогексил или аралкил;
E и F вместе могут обозначать
где Y - водород или низший алкил; Z - водород или низший алкил; n = 1, 2 или 3; V - кислород или сера; M - водород, низший алкил, аралкил, циклогексил или -CH2-циклогексил; Q - водород; R - водород или низший алкил; или R и Q могут вместе образовывать связь; U - водород, низший алкил, фенил или циклоалкил; W - водород, низший алкил или фенил;
u, v и w независимо равны 0 или 1; и
K - гидрокси, алкокси, фенокси, бензилокси или замещенная или незамещенная аминогруппа;
или их соли с физиологически совместимыми кислотами.
Наиболее предпочтительны пептиды формулы I, где R1-N-R2 - 5-членный гетероцикл формулы
который может быть незамещенным или замещенным одним или более заместителями, представляющими собой алкильные группы.
В частности, предпочтительны пептиды формулы I, где K - аминогруппа формулы R5-N-R6, в которой R5 - водород, низший алкил, низший алкокси, бензил; R6 - водород, низший алкил, фенил, C5-циклоалкил, бензил, незамещенный или замещенный трижды низшей алкоксигруппой, бифенил, тиадиазолил, замещенный низшим алкилом или -CH2R7-пятичленный гетероарил, где R7 - водород, бензил, а гетероарил выбран из группы: тиазол, тиофен и оксазол.
Причем особенно предпочтительны пептиды формулы I, где u, v и w равны 0, а K не является гидрокси, бензилокси, фенокси или алкоксигруппой; или пептиды формулы I, где u и v равны 0 и K не обозначает гидрокси- или алкоксигруппу; либо пептиды формулы I, где u, v и w равны 1 и K - гидрокси-, алкокси-, фенокси- или бензилоксигруппа, или пептиды формулы I, где u и v равны 1, w равно 0 и K - гидрокси-, алкокси-, фенокси- или бензилоксигруппа; либо пептиды формулы I, где u равно l, v и w равны 0 и K - гидрокси-, алкокси-, фенокси- или бензилоксигруппа.
Все предложенные производные пептида общей формулы I обладают опухоль-ингибирующей активностью.
Согласно изобретению предложена также фармацевтическая композиция, обладающая опухоль-ингибирующей активностью, включающая активное вещество и носитель, в которой в качестве активного вещества она содержит пептиды формулы I в эффективном количестве.
Один подкласс соединений изобретения включает соединения формулы I, в которых R1-N-R2 - 5-членный гетероцикл формулы
который может быть незамещен или замещен одним или более заместителями, независимо выбранными из алкила (предпочтительно C1-C4).
Другой подкласс соединений изобретения включает соединения формулы I, где K - аминогруппа формулы R5-N-R6, в которой R5 - водород или гидрокси, или C1-C7-алкокси, или бензилокси, или C1-C7-алкил, который может быть замещен одним или более атомами фтора, или C3-C7-циклоалкил, или бензил, который может иметь до трех заместителей, независимо выбранных из CF3, нитро, C1-C7-алкилсульфонила, C1-C4-алкокси, фенокси, бензокси, галогена или C1-C4-алкила; R6 - водород, C1-C7-алкил, который может быть замещен одним или более атомами фтора, или C3-C7-циклоалкил, или фенил (который может иметь до трех заместителей, независимо выбранных из CF3, нитро, галогена, CONHBzl, CON(Bzl)2, C1-C4-алкила, который может образовывать циклическую систему, C1-C4-алкокси, фенокси, бензокси или C1-C7-алкилсульфонила), или бензил (который может иметь до трех заместителей, независимо выбранных из CF3, нитро, галогена, CONHBzl, CON(Bzl)2, C1-C4-алкила, который может образовывать циклическую систему, C1-C4-алкокси, фенокси, бензокси или C1-C7-алкилсульфонила), или нафтил (который может иметь до двух заместителей, независимо выбранных из CF3, нитро, галогена, CONHBzl, CON(Bzl)2, C1-C4-алкила, C1-C4-алкокси, фенокси, бензокси или C1-C7-алкилсульфонила), или бензгидрил (который может иметь до двух заместителей, независимо выбранных из CF3, нитро, галогена, CONHBzl, CON(Bzl)2, C1-C4-алкила, C1-C4-алкокси, фенокси, бензокси или C1-C7-алкилсульфонила), или бифенил (который может иметь до двух заместителей, независимо выбранных из CF3, нитро, галогена, CONHBzl, CON(Bzl)2, C1-C4-алкила, C1-C4-алкокси, фенокси, бензокси или C1-C7-алкилсульфонила), или трифенилметил (который может иметь до трех заместителей, независимо выбранных из CF3, нитро, галогена, CONHBzl, CON(Bzl)2, C1-C4-алкила, C1-C4-алкокси, фенокси, бензокси или C1-C7-алкилсульфонила), или бензгидрилэтил (который может иметь до двух заместителей, независимо выбранных из CF3, нитро, галогена, CONHBzl, CON(Bzl)2, C1-C4-алкила, C1-C4-алкокси, бензокси, фенокси или C1-C7-алкилсульфонила), или бензгидрилметил (который может иметь до двух заместителей, независимо выбранных из CF3, нитро, галогена, CONHBzl, CON(Bzl)2, C1-C4-алкила, C1-C4-алкокси, бензокси, фенокси или C1-C7-алкилсульфонила), или нафтилметил (который может иметь до двух заместителей, независимо выбранных из CF3, нитро, галогена, CONHBzl, CON(Bzl)2, C1-C4-алкила, C1-C4-алкокси, бензокси, фенокси или C1-C7-алкилсульфонила), или аценафтил (который может иметь до двух заместителей, независимо выбранных из CF3, нитро, галогена, CONHBzl, CON(Bzl)2, C1-C4-алкила, C1-C4-алкокси, бензокси, фенокси или C1-C7-алкилсульфонила), или аценафтилметил (который может иметь до двух заместителей, независимо выбранных из CF3, нитро, галогена, CONHBzl, CON(Bzl)2, C1-C4-алкила, C1-C4-алкокси, бензокси, фенокси или C1-C7-алкилсульфонила), или пиридил (который может иметь до двух заместителей, независимо выбранных из CF3, нитро, галогена, CONHBzl, CON(Bzl)2, C1-C4-алкила, C1-C4-алкокси, бензокси, фенокси или C1-C7-алкилсульфонила), или пиколил (который может иметь до двух заместителей, независимо выбранных из CF3, нитро, галогена, CONHBzl, CON(Bzl)2, C1-C4-алкила, C1-C4-алкокси, бензокси, фенокси или C1-C7-алкилсульфонила), или бензотиазолил (который может иметь до двух заместителей, независимо выбранных из CF3, нитро, галогена, CONHBzl, CON(Bzl)2, C1-C4-алкила, C1-C4-алкокси, бензокси, фенокси или C1-C7-алкилсульфонила), или бензоизотиазолил (который может иметь до двух заместителей, независимо выбранных из CF3, нитро, галогена, CONHBzl, CON(Bzl)2, C1-C4-алкила, C1-C4-алкокси, бензокси, фенокси или C1-C7-алкилсульфонила), или бензопиразолил (который может иметь до двух заместителей, независимо выбранных из CF3, нитро, галогена, CONHBzl, CON(Bzl)2, C1-C4-алкила, C1-C4-алкокси, бензокси, фенокси или C1-C7-алкилсульфонила), или бензоксазолил (который может иметь до двух заместителей, независимо выбранных из CF3, нитро, галогена, CONHBzl, CON(Bzl)2, C1-C4-алкила, C1-C4-алкокси, бензокси, фенокси или C1-C7-алкилсульфонила), или флуоренил (который может иметь до двух заместителей, независимо выбранных из CF3, нитро, галогена, CONHBzl, CON(Bzl)2, C1-C4-алкила, C1-С4-алкокси, бензокси, фенокси или C1-C7-алкилсульфонила), или аминофлуоренил (который может иметь до двух заместителей, независимо выбранных из CF3, нитро, галогена, CONHBzl, CON(Bzl)2, C1-C4-алкила, C1-C4-алкокси, бензокси, фенокси или C1-C7-алкилсульфонила), или пиримидил (который может иметь до двух заместителей, независимо выбранных из CF3, нитро, галогена, COOEt, CONHBzl, CON(Bzl)2, C1-C4-алкила, который может образовывать циклическую систему, C1-C4-алкокси, бензокси, фенокси или C1-C7-алкилсульфонила), или 5-членный гетероарил [который может иметь до трех заместителей, независимо выбранных из CF3, нитро, галогена, циано, COOMe, COOEt, тиометила, тиоэтила, тиофенила, пиколила, ацетила, -CH2COOEt, CONH2, CONHBzl, CON(Bzl)2, C1-C4-алкила, C3-C6-циклоалкила, C3-C4-алкилена, образующего бициклическую систему с гетероциклом, C1-C4-алкокси, бензокси, фенокси, фенила (который может иметь до четырех заместителей, независимо выбранных из нитро, CF3, галогена или C1-C4-алкила), бензила (который может иметь до четырех заместителей, независимо выбранных из нитро, CF3, галогена, C1-C4-алкила, нафтила, C1-C7-алкилсульфонила, фенилсульфонила или C1-C4-диалкиламино)], или -CHR7-5-членный гетероарил (который может иметь до двух заместителей, независимо выбранных из CF3, нитро, галогена, CONHBzl, CON(Bzl)2, COOMe, COOEt, COOCH(CH3)2, CONH2, COOBzl, C1-C4-алкила, C1-C4-алкокси, бензокси, фенокси, фенила, бензила, нафтила или C1-C7-алкилсульфонила [R7 - водород, линейный или разветвленный C1-C5-алкил, бензил; или R7 и R5 вместе образуют группу -(CH2)3 или -(CH2)4-]).
Этот подкласс включает соединения формулы I, где u, v и w независимо равны 0 или 1; R1, R2 и X - низший алкил, A и F - аминокислоты низшего алкила, B - N-низшая алкилированная аминокислота низшего алкила, D, E, G и K имеют вышеприведенные значения. С учетом вышесказанного, одна группа таких соединений может быть поэтому изображена формулой II
R1R2N-CXH-CO-A-D-Pro-Pro-(F)v-(G)w-K,
а другая - формулой III
R1R2N-CXH-CO-A-D-Pro-Pro-(F)v-(G)w-K.
B другом подклассе соединений предлагаемого изобретения R5-N-R6 вместе могут образовывать структуры, выбранные из группы, состоящей из
которые могут быть незамещенными или замещенными одним или более заместителями, независимо выбранными из группы, состоящей из CF3, нитро, галогена, оксо, циано, N, N-диметиламино, CONHBzl, CON(Bzl)2, C1-C6-алкила, C3-C6-циклоалкила, C3-C4-алкилена, образующего бициклическую систему с гетероциклом, C1-C4-алкокси, фенокси, бензокси, нафтила, пиримидила, COOEt, COOBzl, C3-C6-циклоалкила, пиролидинила, пиперидинила, тиенила, пирролила, -CH2-CO-NCH(CH3)2, -CH2-CO-N(CH2)4, -CH2-CO-N(CH2)4O, бензила (который может иметь до трех заместителей, независимо выбранных из нитро, галогена, CF3, тиометила или соответствующего сульфоксида или сульфона, тиоэтила или соответствующего сульфоксида или сульфона, C1-C4-алкила и C1-C4-алкокси) и фенила (который может иметь до трех заместителей, независимо выбранных из нитро, галогена, CF3, тиометила, тиоэтила, C1-C4-алкила и C1-C4-алкокси).
Предпочтительны соединения формулы I, в которых заместители имеют следующие значения:
R1 - этил, метил, 2-фторэтил, 2,2-дифторэтил, 2,2,2-трифторэтил, 2-фторизопропил, трифторизопропил, изопропил, пропил, бутил, пентил, циклопропил, циклопентил, морфолиносульфонил, трет-бутиламино-сульфонил, метиламиносульфонил, NH2, N(CH3)2, N(CH2CH3)2, N[CH(CH3)2]2;
R2 - водород, метил, этил, 2-фторэтил, 2,2-дифторэтил, 2,2,2-трифторэтил, 2-фторизопропил, трифторизопропил, изопропил, пропил, бутил, циклопропил;
или R1-N-R2 вместе обозначают один из остатков, приведенных на фиг. 1;
A, B, D, E, F, G и X имеют вышеприведенные значения;
u, v и w независимо равны 0 или 1;
A и B вместе обозначают элементы по фиг. 2-6;
F и G вместе обозначают элементы по фиг. 7-11;
E и F вместе обозначают элементы по фиг. 12, 13;
R1R2N-CHX-CO и A вместе обозначают элементы по фиг. 14-17;
R5 - водород, метил, этил, 2-фторэтил, 2,2-дифторэтил, трифторизопропил, пропил, изопропил или элементы по фиг. 18;
R6 - водород, метил, этил, 2-фторэтил, 2,2-дифторэтил, трифторэтил, трифторизопропил, пропил, изопропил, трет-бутил или элементы по фиг. 19-27;
R5-N-CHR7-5-членный гетероарил обозначает элементы по фиг. 28;
R5-N-R6 вместе обозначают элементы по фиг. 29-33;
K - гидрокси, алкокси (предпочтительно C1-C4), фенокси или бензокси.
Более предпочтительны соединения, в которых заместители имеют следующие значения:
R1 - этил, метил, 2-фторэтил, 2,2-дифторэтил, 2,2,2-трифторэтил, 2-фторизопропил, трифторизопропил, изопропил, пропил, циклопропил, бензилоксикарбонил, метилоксикарбонил, лактил, метиламиносульфонил, тозил, уреил, мезил, N(CH3)2, амидино, метокси, бензил, 4-феноксибензил, 4-бензилоксибензил или 3,4,5-триметоксибензил;
R2 - водород, метил, этил, 2-фторэтил, 2,2-дифторэтил, 2,2,2-трифторэтил, изопропил, пропил, бутил, циклопропил, формил, ацетил, пропионил, пивалоил, бензоил или бензил;
R1-N-R2 вместе обозначают
A, B, D, E, F, G и X имеют вышеприведенные значения;
E и F вместе обозначают
R1R2N-CHX-CO и A вместе обозначают элементы по фиг. 34, 35;
K - гидрокси, C1-C4-алкокси или бензилокси;
R5 - водород, метил, этил, 2-фторэтил, 2,2-дифторэтил, пропил, изопропил, циклопропил, циклопентил, циклогексил, бензил, 4-феноксибензил, 4-бензилоксибензил или 3,4,5-триметоксибензил;
R6 - водород, метил, этил, 2-фторэтил, 2,2-дифторэтил, пропил, изопропил, трет-бутил, циклопропил, циклопентил, циклогексил, бензил, 4-феноксибензил, 4-бензилоксибензил, 3,4,5-триметоксибензил, фенил, 4-феноксифенил, 4-бензилоксифенил, 3,4,5-триметоксифенил или элементы по фиг. 36-38;
R5-N-CHR7-5-членный гетероарил обозначает
R5-N-R6 вместе обозначают элементы по фиг. 39-41.
Эти примеры иллюстрируют, но не ограничивают объем настоящего изобретения.
Пептиды формулы I состоят предпочтительно из L-аминокислот, однако они могут содержать одну или более D-аминокислот.
Новые соединения могут присутствовать в виде солей с физиологически приемлемыми кислотами, такими как хлористоводородная кислота, лимонная кислота, винная кислота, молочная кислота, фосфорная кислота, метансульфокислота, уксусная кислота, муравьиная кислота, малеиновая кислота, фумаровая кислота, яблочная кислота, янтарная кислота, малоновая кислота, серная кислота, L-глутаминовая кислота, L-аспарагиновая кислота, пировиноградная кислота, слизевая кислота, бензойная кислота, глюкуроновая кислота, щавелевая кислота, аскорбиновая кислота и ацетилглицин.
Новые соединения могут быть получены известными методами в химии пептидов. Так, пептиды могут быть синтезированы последовательным присоединением аминокислот либо путем конденсации соответствующих пептидных фрагментов. При осуществлении последовательной конденсации, начиная с C-конца, пептидную цепь удлиняют постепенно с помощью одной аминокислоты за один раз. При соединении фрагментов можно связывать фрагменты различной длины, и фрагменты в свою очередь могут быть получены путем последовательной конденсации аминокислот или из самих себя посредством присоединения фрагментов.
Как при последовательном наращивании цепи, так и при конденсации фрагментов необходимо связать звенья путем образования амидной связи. Для этой цели пригодны ферментативные и химические способы.
Химические способы получения амидной связи описаны подробно в работах Müller, Methoden der organischen Chemie, т. XV/2, c. 1-364, Thieme Verlag, Stuttgart 1974; Stewart, Young, SOlid Phase Peptide Synthesis, c. 31-34, 71-82, Pierce Chemical Company, Rockford, 1984; Bodanszky, Klausner, Ondetti, Peptide Synthesis, c. 85-128, John Wiley & Sons, New York, 1976, и других стандартных работах по химии пептидов. Особое предпочтение отдается азидному способу, способу симметричных и смешанных ангидридов, активных сложных эфиров, полученных in situ или предварительно, использованию уретан-защищенных N-карбоксиангидридов аминокислот и образованию амидной связи с использованием связующих агентов (активаторов), особенно дициклогексилкарбодиимида (DCC), диизопропилкарбодиимида (DIC), 1-этоксикарбонил-2-этокси-1,2-дигидрохинолина (EEDQ), хлоргидрата 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (EDCI), н-пропанфосфонового ангидрида (PPA), N,N-бис(2-оксо-3-оксазолидинил)-имидофосфорилхлорида (BOP-Cl), бром-трис-пирролидинфосфония гекса-фторфосфата (PyBrop), дифенилфосфорилазида (DPPA), реагента Кастро (BOP, PyBop), O-бензотриазолил-N,N,N',N'-тетраметилурониевых солей (HBTU), диэтилфосфорилцианида (DEPCN), 2,5-дифенил-2,3-дигидро-3-оксо-4-гидрокситиофендиоксида (реагента Стеглиха; HOTDO) и 1,1'-карбонилдиимидазола (CDI). Связующие реагенты могут быть использованы в отдельности или в сочетании с такими присадками, как N,N-диметил-4-аминопиридин (DMAP), N-гидроксибензотриазол (HOBt), N-гидроксибензотриазин (HOOBt), N-гидроксисукцинимид (HOSu) или 2-гидроксипиридин.
В то время, как в ферментативном пептидном синтезе обычно можно манипулировать защитными группами, в химическом синтезе обратимая защита реакционноспособных групп, не реагирующих при образовании пептидной амидной связи, необходима для обоих реагентов. Для осуществления химического пептидного синтеза предпочтительны три традиционных метода введения защитных групп: бензилоксикарбонила (Z), трет-бутоксикарбонила (Boc) и 9-фторенилметоксикарбонила (Fmoc). В каждом случае идентифицируют защитную группу на α-аминогруппе звена, удлиняющего цепь. Подробный обзор аминокислотных защитных групп приведен в работе Müller, Methoden der organischen Chemie, т. XV/1, с. 20-906, Thiemer Verlag, Stuttgart, 1974. Звенья, используемые для образования пептидной цепи, могут быть подвергнуты взаимодействию в растворе, в суспензии или с применением метода, аналогичного описанному Merrifield в J.Amer.Chem.Soc. 85 (1963) 2149. Особенно предпочтительными методами являются те, в которых пептиды собирают последовательно, либо путем связывания фрагментов с использованием метода защитных групп Z, Вое или Fmoc, причем один реагент в указанном методе Merrifield связан с нерастворимым полимерным носителем (далее называется также полимером). Это обычно приводит к тому, что пептид собирается последовательно на полимерном носителе с использованием метода защитных групп Boc или Fmoc, растущая пептидная цепь ковалентно связывается у C-окончания с нерастворимыми полимерными частицами. Этот метод дает возможность отделить реагенты и побочные продукты фильтрацией и по этой причине отпадает необходимость в перекристаллизации промежуточных продуктов.
Защищенные аминокислоты могут быть соединены с любыми пригодными полимерами, которые должны быть просто нерастворимыми в используемых растворителях и должны иметь устойчивую физическую форму, которая облегчает проведение фильтрации. Полимер должен содержать функциональную группу, к которой первая защищенная аминокислота может быть присоединена надежно ковалентной связью. Для этой цели пригодно большое количество разнообразных полимеров, например целлюлоза, поливиниловый спирт, полиметакрилат, сульфонированный полистирол, сополимер хлорметилированного стирола/дивинилбензола (смола Merrifield), смола 4-метилбензгидриламина (MBHA-смола), фенилацетамидометил-смола (Pam-смола), п-бензилокси-бензил-спирт-смола, бензгидриламин-смола (BHA-смола), 4-(гидроксиметил) бензоилокси-метил/смола, смола Breipohl et al. (Tetrahedron Letters 28 (1987) 565; поставляется фирмой BACHEM), 4-(2,4-диметоксифениламинометил)-фенокси-смола (поставляется фирмой Novabiochem) или o-хлортритил-смола (поставляется фирмой Biohellas).
Для пептидного синтеза в растворе пригодны все растворителя, которые инертны в реакционных условиях, особенно вода, N,N-диметилформамид (DMF), диметилсульфоксид (DMSO), ацетонитрил, дихлорметан (DCM), 1,4-диоксан, тетрагидрофуран (THF), N-метил-2-пирролидон (NMP) и смеси указанных растворителей. Пептидный синтез на полимерном носителе может быть осуществлен во всех инертных органических растворителях, в которых не растворяются используемые аминокислотные производные; однако предпочтительны растворители, дополнительно приводящие к набуханию полимеров, такие как DMF, DCM, NMP, ацетонитрил и DMSO, а также смеси этих растворителей. После завершения синтеза пептид отщепляют от полимерной смолы. Условия отщепления различных типов полимеров раскрыты в литературе. Наиболее часто используемыми реакциями отщепления являются реакции катализируемыми кислотой и палладием, особенно отщепление в жидком безводном фтороводороде, в безводной трифторметансульфокислоте, в разбавленной или концентрированной трифторуксусной кислоте, палладий-катализируемое отщепление в THF или смесях THF-DCM в присутствии слабого основания, такого как морфолин, или расщепление в смесях уксусной кислоты, дихлорметана и трифторэтанола. В зависимости от выбранных защитных групп они могут быть удержаны или аналогичным образом отщеплены в условиях отщепления полимера. Частичное освобождение от защитных групп пептида целесообразно, когда необходимо осуществить определенные реакции для получения производных. Пептиды, диалкилированные у N-концевого азота, могут быть получены либо путем введения соответствующих N,N-диалкиламинокислот в растворе, либо на полимерном носителе, или же путем восстановительного алкилирования пептида, связанного с полимером, в смеси DMF/1% уксусной кислоты с NaCNBH3 подходящими альдегидами. Различные аминокислоты неприродного происхождения, а также различные неаминокислотные составляющие, раскрываемые в данном описании, могут быть получены из выпускаемых промышленностью реагентов, либо синтезированы из промышленнодоступных реагентов с использованием известных способов. Например, аминокислоты, составляющие фрагменты с остатками R1 и R2, могут быть получены в соответствии с работой E. Wüsch, Houben Weyl, Meth. d. Org. Chemie, Bd. XV, 1, р. 306 following, Thieme Verlag Stuttgart 1974, и литературными ссылками в ней. Пептиды с мостиками γ- или δ-лактама могут быть получены путем включения соответствующих дипептидных звеньев, соединенных мостиковой связью с лактамом (R.Freidinger, J. Org. Chem. Soc. (1982) 104-109) в пептидную цепь. Пептиды с тиазол-, оксазол-, тиазолин- или оксазолинсодержащими дипептидными фрагментами могут быть получены путем включения соответствующих дипептидных звеньев (P. Jouin et al., Tetrahedron Letters (1992), 2807-2810; P.Wipf et al., Tetrahedron Letters (1992), 907-910; W.R. Tully, J.Med.Chem. (1991), 2065; Synthesis (1987), 235) в пептидную цепь.
Соединения изобретения могут быть использованы для ингибирования или иного лечения твердых опухолей (например, опухолей легких, молочной железы, ободочной кишки, простаты, мочевого пузыря, прямой кишки или эндометриальных опухолей) или гематологических злокачественных образований (например, лейкемий, лимфом) путем введения соединения в организм млекопитающего. Введение может быть осуществлено любым способом, являющимся общепринятым в фармацевтике, предпочтительно в онкологии с помощью агентов, включая пероральные и парентеральные способы, такие как подкожный, внутривенный, внутримышечный и внутрибрюшинный путь введения. Соединения могут быть введены по отдельности или в виде фармацевтических композиций, содержащих соединение формулы I вместе с фармацевтически приемлемым носителем, подходящим для желаемого пути введения. Такие фармацевтические композиции могут быть комбинированными продуктами, то есть могут также содержать другие терапевтически активные компоненты.
Дозировка, вводимая млекопитающему, содержит эффективное опухоль-ингибирующее количество активного компонента, которое зависит от традиционных факторов, включая биологическую активность конкретного используемого соединения, способ введения, возраст, здоровье и массу тела реципиента, природу и состояние симптомов, частоту лечения, введение других терапевтических препаратов, а также искомый эффект. Обычная суточная доза составляет приблизительно 5-250 мг на 1 кг массы тела при пероральном введении и приблизительно 1-100 мг на 1 мг массы тела при парентеральном введении.
Новые соединения могут вводиться в традиционных твердых или жидких формах, например таблетках без оболочки или с пленочным покрытием, капсулах, порошках, гранулах, суппозиториях или растворах. Они изготавливаются традиционным способом. Для этой цели активные вещества могут быть переработаны с применением традиционных фармацевтических носителей, таких как связующие таблеток, наполнители, консерванты, дезинтеграторы таблеток, регуляторы текучести, пластификаторы, смачивающие агенты, диспергаторы, эмульгаторы, растворители, композиции пролонгированного действия, антиоксиданты и/или газы-вытеснители (см. Н.Sucker et al.: Pharmazeutische Technologie, Thieme-Verlag, Stuttgart, 1978). Формы для введения, полученные таким путем, обычно содержат 1-90% по массе активного вещества.
Следующие примеры предназначены для иллюстрации изобретения. Протеиногенные аминокислоты даны в примерах в сокращении с использованием известного трехбуквенного кода. Другие обозначения следующие: TFA - трифторуксусная кислота, Ас - уксусная кислота, Et - этил, Bu - бутил, Me - метил, Bzl - бензил.
А. Общие методики.
I. Пептиды, заявленные в п.1 формулы изобретения, либо синтезированы классическим способом синтеза в растворе с использованием стандартного Z- и Boc-метода, описанного выше, либо получены стандартными методами твердофазного синтеза на полностью автоматическом синтезаторе модели 431A, поставляемом фирмой APPLIED BIOSYSTEMS. Аппарат использует различные синтетические циклы для методов защитных групп Boc и Fmoc.
а). Синтетический цикл для метода защитной группы Boc:
1. 30% трифторуксусная кислота в DCM - 1 x 3 мин.
2. 50% трифторуксусная кислота в DCM - 1 x 1 мин.
3. Промывка DCM - 5 x 1 мин.
4. 5% диизопропилэтиламин в DCM - 1 x 1 мин.
5. 5% диизопропилэтиламин в NMP - 1 x 1 мин.
6. Промывка NMP - 5 х 1 мин.
7. Добавление предварительно активированной защищенной аминокислоты (активация с помощью 1 эквивалента DCC и 1 эквивалента HOBt в NMP/DCM); образование пептидной связи (1-ая часть) - 1 х 30 мин.
8. Добавление DMSO в реакционную смесь до тех пор, пока не останется 20% DMSO по объему.
9. Образование пептидной связи (2-ая часть) - 1 x 16 мин.
10. Добавление 3,8 эквивалента диизопропилэтиламина в реакционную смесь.
11. Образование пептидной связи (3-я часть) - 1 x 7 мин.
12. Промывка DCM - 3 x 1 мин.
13. Если превращение неполное, повторяют стадию образования пептидной связи (возврат к 5).
14. 10% уксусный ангидрид, 5% диизопропилэтиламин в DCM - 1 x 2 мин.
15. 10% уксусный ангидрид в DCM - 1 x 4 мин.
16. Промывка DCM - 4 x 1 мин.
17. Возврат к l.
BOP-Cl и PyBrop используют в качестве реагентов взаимодействия аминокислоты вслед за N-метиламинокислотами. Время реакции соответственно возрастает. При синтезе в растворе использование либо Вос-защищенных аминокислотных NCA (N-трет-бутилоксикарбонил-аминокислота-N-карбокси-ангидридов), либо Z-защищенных аминокислотных NCA (N-бензилоксикарбо-ниламинокислота-N-карбокси-ангидридов), соответственно, является наиболее благоприятным для такого типа реакции.
б). Синтетический цикл для метода защитной группы Fmoc:
1. Промывка DMF - 1 x 1 мин.
2. 20% пиперидин в DMF - 1 x 4 мин.
3. 20% пиперидин в DMF - 1 x 16 мин.
4. Промывка DMF - 5 x 1 мин.
5. Добавление предварительно активированной аминокислоты (активирование 1 эквивалентом TBTU и 1,5 эквивалентами DIPEA в DMF); образование пептидной связи - 1 x 61 мин.
6. Промывка DMF - 3 x 1 мин.
7. Если превращение не завершено, повторяют образование пептидной связи (возврат к 5).
8. 10% уксусный ангидрид в DMF - 1 x 8 мин.
9. Промывка DMF - 3 x 1 мин.
10. Возврат к 2.
BOP-Cl и PyBrop используют в качестве реагентов для взаимодействия аминокислот вслед за N-метиламинокислотами. Время реакции соответственно возрастает.
II. Восстановительное алкилирование N-концевого азота.
Пептид-полимер, полученный в соответствии со стадиями AIа и AIб, освобождают от N-концевой защиты (стадия 2-4 в AIб или 1-6 в AIa) и затем подвергают взаимодействию с 3-кратным молярным избытком альдегида или кетона в DMF/1% уксусной кислоте с добавлением 3 эквивалентов NaCNB-H3. По завершении реакции (негативный тест Кайзера) полимер промывают несколько раз водой, изопропанолом, DMF и дихлорметаном.
III. Обработка пептид-полимеров, полученных в соответствии со стадиями Iа и II.
Пептид-полимер сушат при пониженном давлении и переносят в реакционный сосуд аппарата TEFLON HF (поставляемого фирмой PENINSULA). После добавления акцептора, предпочтительно анизола (1 мл/г полимера), а в случае тиольных триптофансодержащих пептидов, с целью отщепления индолформильной группы, предпочтительно этандитиола (0,5 мл/г полимера), осуществляют конденсирование во фтороводороде (10 мл/г полимера), охлаждая смесь жидким N2. Смесь оставляют нагреваться до температуры 0oC и перемешивают при этой температуре в течение 45 мин. Затем фтороводород упаривают при пониженном давлении и остаток промывают этилацетатом для удаления оставшегося акцептора. Пептид экстрагируют 30%-ной уксусной кислотой и фильтруют, после чего фильтрат лиофилизуют.
IV. Обработка пептид-полимеров, полученных на стадиях Iб и II.
Пептид-полимер сушат при пониженном давлении и затем подвергают одной из методик отщепления, приведенных в табл. 1, в зависимости от аминокислотного состава (Wade, Tregear, Howard Florey Fmoc Workshop Manual, Melbourne 1985).
Суспензию пептид-полимера в пригодной смеси TFA перемешивают при комнатной температуре в течение указанного времени, после чего полимер отфильтровывают и промывают TFA и DCM. Фильтрат и промывные жидкости концентрируют и пептид осаждают путем добавления диэтилового эфира. После охлаждения в ледяной бане осадок отфильтровывают, растворяют в 30%-ной уксусной кислоте и лиофилизуют.
V. Когда используют о-хлортритил-полимер (поставляемый фирмой Biohellas), суспензию пептид-полимера в смеси уксусная кислота/трифторэтанол/дихлорметан (1:1:3.) перемешивают при комнатной температуре в течение 1 ч. Затем полимер отфильтровывают отсасыванием и тщательно промывают раствором для отщепления. Объединенные фильтраты концентрируют в вакууме и обрабатывают водой. Осажденное твердое вещество удаляют фильтрацией или центрифугированием, промывают диэтиловым эфиром и сушат при пониженном давлении.
VI. Очистка и идентификация пептидов.
Очистку осуществляют гель-хроматографией (SEPHADEX G-10, 0-15/10% HOAc, SEPHADEX LH20/MeOH) c использованием или без использования последующей хроматографии под средним давлением (стационарная фаза: HD-SIL С-18, 2-45 мкм, 100 
подвижная фаза: градиент с A=0,1% TFA/MeOH, B=0,1% TFA/H2O).
Чистоту полученных продуктов определяют аналитической ЖХВД (стационарная фаза: 100 2,1 мм VYDAC С-18, 5 л, 300 
подвижная фаза: CH3CN/H2O градиент, забуферено с помощью 0,1% TFA, 40oC). Характеристики получают с помощью аминокислотного анализа и масс-спектроскопией с бомбардировкой тяжелыми ядрами.
Б. Конкретные примеры.
Пример 1 (SEQ ID NO: 1).
N,N-диметил-Val-Val-N-метил-Val-Pro-Pro-Val-Phe-NH2
1,98 г Fmoc-RINK-полимера (замещение 0,46 ммоля/г), соответствующие порции 0,84 ммоля, подвергают взаимодействию, как в стадии AIб, с использованием 1,26 ммоля каждого из нижеприведенных соединений:
Fmoc-Phe-OH Fmoc-N-метил-Val-OH
Fmoc-Val-OH Fmoc-Val-OH
Fmoc-Pro-OH Fmoc-Val-OH
Fmoc-Pro-OH.
Аминокислоту вслед за N-метиламинокислотой связывают с PyBrop в качестве реагента связывания. После завершения синтетических циклов пептид-полимер подвергают освобождению от N-концевой защиты (стадии 2-4 в AIб) и далее подвергают взаимодействию с водным раствором формальдегида, как в AII, после чего сушат при пониженном давлении. Полученный полимер подвергают TFA-отщеплению, как в стадии АIV. Неочищенный продукт (590 мг) очищают гель-фильтрацией (SEPHADEX-LH-20). Выход составляет 295 мг.
Пример 2 (SEQ ID NO: 2).
4,11 г полимера-Fmoc-Pro-п-алкоксибензилового спирта (замещение 0,73 ммоля/г), соответствующие порции 3 ммоля, подвергают взаимодействию, как в стадии АIб, с использованием 4,5 ммоля каждого из нижеприведенных соединений:
Fmoc-N-MeVal-OH
Fmoc-Val-OH
Fmoc-Val-OH.
Аминокислоту вслед за N-метиламинокислотой в данном случае подвергают взаимодействию с применением двойной защиты с помощью PyBrop или Bop-Cl при повышении времени реакции. После завершения синтеза пептид-полимер подвергают освобождению от N-концевой защиты (стадии 2-4 в АIб) и далее взаимодействию с водным раствором формальдегида, как в стадии АII, после чего сушат при пониженном давлении. Пептид-полимер, полученный таким путем, подвергают TFA-расщеплению, как в стадии АIV. Сырой продукт (750 мг) используют непосредственно для дальнейшего взаимодействия. 100 мг этого соединения подвергают взаимодействию с 45 мг (S)-2-[1-амино-2-фенилэтил]тиазола и 230 мг PyBop с добавлением 192 мкл DIPEA в DMF при комнатной температуре в течение 2 дней. Реакционную смесь очищают гель-хроматографией (SEPHADEX-LH-20, метанол) и фракции продукта объединяют. Получают 83 мг продукта.
В соответствии с примерами 1 и 2 были получены и могут быть получены соединения, приведенные в табл. 2.
Примеры для получения характеристик с помощью масс-спектроскопии в отношении синтезированных новых соединений приведены в табл. 3.
В табл. 4 указана последовательность соединений, полученных в соответствии с примерами 1 и 2.
Перечисление последовательностей.
(1) Общая информация
(i) Заявитель
(A) BASF Aktiengesellschaft
(B) улица: Carl-Bosch-Strasse 38
(C) город: Ludwigshafen
(E) страна: Германия
(F) индекс: W-6700
(G) телефон: 0621/6048526
(H) телефакс: 0621/6043123
(l) телекс: 1762175170
(ii) Название изобретения: новые пептиды, их получение и их применение
(iii) Число последовательностей: 57
(iv) Машиночитаемый носитель:
(А) тип носителя: дискета, 3,5 дюйма, 2 х двойная плотность
(В) компьютер: IBM AT-совместимый, процессор 80286
(С) оперативная система: MS-DOS версия 5.0
(D) программное обеспечение: WordPerfect версия 5.1
(2) Информация о последовательности SEQ ID NO: 1:
(i) Характеристики последовательности:
(А) длина: 9 аминокислот
(B) тип: аминокислотный
(D) топология: линейная
(ii) Молекулярный тип: пептид
(xi) Описание последовательности: SEQ ID NO: 1:
(2) Информация о последовательности SEQ ID NO: 2:
(i) Характеристики последовательности:
(А) длина: 5 аминокислот
(B) тип: аминокислотный
(D) топология: линейная
(ii) Молекулярный тип: пептид
(xi) Описание последовательности: SEQ ID NO: 2:
(2) Информация о последовательности SEQ ID NO: 3:
(i) Характеристики последовательности:
(А) длина: 7 аминокислот
(B) тип: аминокислотный
(D) топология: линейная
(ii) Молекулярный тип: пептид
(xi) Описание последовательности: SEQ ID NO: 3:
(2) Информация о последовательности SEQ ID NO: 4:
(i) Характеристики последовательности:
(А) длина: 7 аминокислот
(B) тип: аминокислотный
(D) топология: линейная
(ii) Молекулярный тип: пептид
(xi) Описание последовательности: SEQ ID NO: 4:
(2) Информация о последовательности SEQ ID NO: 5:
(i) Характеристики последовательности:
(А) длина: 7 аминокислот
(B) тип: аминокислотный
(D) топология: линейная
(ii) Молекулярный тип: пептид
(xi) Описание последовательности: SEQ ID NO: 5:
(2) Информация о последовательности SEQ ID NO: 6:
(i) Характеристики последовательности:
(А) длина: 7 аминокислот
(B) тип: аминокислотный
(D) топология: линейная
(ii) Молекулярный тип: пептид
(xi) Описание последовательности: SEQ ID NO: 6:
(2) Информация о последовательности SEQ ID NO: 7:
(i) Характеристики последовательности:
(А) длина: 7 аминокислот
(B) тип: аминокислотный
(D) топология: линейная
(ii) Молекулярный тип: пептид
(xi) Описание последовательности: SEQ ID NO: 7:
(2) Информация о последовательности SEQ ID NO: 8:
(i) Характеристики последовательности:
(А) длина: 7 аминокислот
(B) тип: аминокислотный
(D) топология: линейная
(ii) Молекулярный тип: пептид
(xi) Описание последовательности: SEQ ID NO: 8:
(2) Информация о последовательности SEQ ID NO: 9:
(i) Характеристики последовательности:
(А) длина: 7 аминокислот
(B) тип: аминокислотный
(D) топология: линейная
(ii) Молекулярный тип: пептид
(xi) Описание последовательности: SEQ ID NO: 9:
(2) Информация о последовательности SEQ ID NO: 10:
(i) Характеристики последовательности:
(А) длина: 7 аминокислот
(B) тип: аминокислотный
(D) топология: линейная
(ii) Молекулярный тип: пептид
(xi) Описание последовательности: SEQ ID NO: 10:
(2) Информация о последовательности SEQ ID NO: 11:
(i) Характеристики последовательности:
(А) длина: 7 аминокислот
(B) тип: аминокислотный
(D) топология: линейная
(ii) Молекулярный тип: пептид
(xi) Описание последовательности: SEQ ID NO: 11:
(2) Информация о последовательности SEQ ID NO: 12:
(i) Характеристики последовательности:
(А) длина: 6 аминокислот
(B) тип: аминокислотный
(D) топология: линейная
(ii) Молекулярный тип: пептид
(xi) Описание последовательности: SEQ ID NO: 12:
(2) Информация о последовательности SEQ ID NO: 13:
(i) Характеристики последовательности:
(А) длина: 7 аминокислот
(B) тип: аминокислотный
(D) топология: линейная
(ii) Молекулярный тип: пептид
(xi) Описание последовательности: SEQ ID NO: 13:
(2) Информация о последовательности SEQ ID NO: 14:
(i) Характеристики последовательности:
(А) длина: 7 аминокислот
(B) тип: аминокислотный
(D) топология: линейная
(ii) Молекулярный тип: пептид
(xi) Описание последовательности: SEQ ID NO: 14:
(2) Информация о последовательности SEQ ID NO: 15:
(i) Характеристики последовательности:
(А) длина: 7 аминокислот
(B) тип: аминокислотный
(D) топология: линейная
(ii) Молекулярный тип: пептид
(xi) Описание последовательности: SEQ ID NO: 15:
(2) Информация о последовательности SEQ ID NO: 16:
(i) Характеристики последовательности:
(А) длина: 7 аминокислот
(B) тип: аминокислотный
(D) топология: линейная
(ii) Молекулярный тип: пептид
(xi) Описание последовательности: SEQ ID NO: 16:
(2) Информация о последовательности SEQ ID NO: 17:
(i) Характеристики последовательности:
(А) длина: 6 аминокислот
(B) тип: аминокислотный
(D) топология: линейная
(ii) Молекулярный тип: пептид
(xi) Описание последовательности: SEQ ID NO: 17:
(2) Информация о последовательности SEQ ID NO: 18:
(i) Характеристики последовательности:
(А) длина: 6 аминокислот
(B) тип: аминокислотный
(D) топология: линейная
(ii) Молекулярный тип: пептид
(xi) Описание последовательности: SEQ ID NO: 18:
(2) Информация о последовательности SEQ ID NO: 19:
(i) Характеристики последовательности:
(А) длина: 6 аминокислот
(B) тип: аминокислотный
(D) топология: линейная
(ii) Молекулярный тип: пептид
(xi) Описание последовательности: SEQ ID NO: 19:
(2) Информация о последовательности SEQ ID NO: 20:
(i) Характеристики последовательности:
(А) длина: 6 аминокислот
(B) тип: аминокислотный
(D) топология: линейная
(ii) Молекулярный тип: пептид
(xi) Описание последовательности: SEQ ID NO: 20:
(2) Информация о последовательности SEQ ID NO: 21:
(i) Характеристики последовательности:
(А) длина: 6 аминокислот
(B) тип: аминокислотный
(D) топология: линейная
(ii) Молекулярный тип: пептид
(xi) Описание последовательности: SEQ ID NO: 21:
(2) Информация о последовательности SEQ ID NO: 22:
(i) Характеристики последовательности:
(А) длина: 6 аминокислот
(B) тип: аминокислотный
(D) топология: линейная
(ii) Молекулярный тип: пептид
(xi) Описание последовательности: SEQ ID NO: 22:
(2) Информация о последовательности SEQ ID NO: 23:
(i) Характеристики последовательности:
(А) длина: 4 аминокислоты
(B) тип: аминокислотный
(D) топология: линейная
(ii) Молекулярный тип: пептид
(xi) Описание последовательности: SEQ ID NO: 23:
(2) Информация о последовательности SEQ ID NO: 24:
(i) Характеристики последовательности:
(А) длина: 5 аминокислот
(B) тип: аминокислотный
(D) топология: линейная
(ii) Молекулярный тип: пептид
(xi) Описание последовательности: SEQ ID NO: 24:
(2) Информация о последовательности SEQ ID NO: 25:
(i) Характеристики последовательности:
(А) длина: 4 аминокислоты
(B) тип: аминокислотный
(D) топология: линейная
(ii) Молекулярный тип: пептид
(xi) Описание последовательности: SEQ ID NO: 25:
(2) Информация о последовательности SEQ ID NO: 26:
(i) Характеристики последовательности:
(А) длина: 4 аминокислоты
(B) тип: аминокислотный
(D) топология: линейная
(ii) Молекулярный тип: пептид
(xi) Описание последовательности: SEQ ID NO: 26:
(2) информация о последовательности SEQ ID NO: 27:
(i) Характеристики последовательности:
(А) длина: 5 аминокислот
(B) тип: аминокислотный
(D) топология: линейная
(ii) Молекулярный тип: пептид
(xi) Описание последовательности: SEQ ID NO: 27:
(2) Информация о последовательности SEQ ID NO: 28:
(i) Характеристики последовательности:
(А) длина: 7 аминокислот
(B) тип: аминокислотный
(D) топология: линейная
(ii) Молекулярный тип: пептид
(xi) Описание последовательности: SEQ ID NO: 28:
(2) Информация о последовательности SEQ ID NO: 29:
(i) Характеристики последовательности:
(А) длина: 5 аминокислот
(B) тип: аминокислотный
(D) топология: линейная
(ii) Молекулярный тип: пептид
(xi) Описание последовательности: SEQ ID NO: 29:
(2) Информация о последовательности SEQ ID NO: 30:
(i) Характеристики последовательности:
(А) длина: 6 аминокислот
(B) тип: аминокислотный
(D) топология: линейная
(ii) Молекулярный тип: пептид
(xi) Описание последовательности: SEQ ID NO: 30:
(2) Информация о последовательности SEQ ID NO: 31:
(i) Характеристики последовательности:
(А) длина: 4 аминокислоты
(B) тип: аминокислотный
(D) топология: линейная
(ii) Молекулярный тип: пептид
(xi) Описание последовательности: SEQ ID NO: 31:
(2) информация о последовательности SEQ ID NO: 32:
(i) Характеристики последовательности:
(А) длина: 4 аминокислоты
(B) тип: аминокислотный
(D) топология: линейная
(ii) Молекулярный тип: пептид
(xi) Описание последовательности: SEQ ID NO: 32:
(2) Информация о последовательности SEQ ID NO: 33:
(i) Характеристики последовательности:
(А) длина: 6 аминокислот
(B) тип: аминокислотный
(D) топология: линейная
(ii) Молекулярный тип: пептид
(xi) Описание последовательности: SEQ ID NO: 33:
(2) Информация о последовательности SEQ ID NO: 34:
(i) Характеристики последовательности:
(А) длина: 5 аминокислот
(B) тип: аминокислотный
(D) топология: линейная
(ii) Молекулярный тип: пептид
(xi) Описание последовательности: SEQ ID NO: 34:
(2) Информация о последовательности SEQ ID NO: 35:
(i) Характеристики последовательности:
(А) длина: 5 аминокислот
(B) тип: аминокислотный
(D) топология: линейная
(ii) Молекулярный тип: пептид
(xi) Описание последовательности: SEQ ID NO: 35:
(2) Информация о последовательности SEQ ID NO: 36:
(i) Характеристики последовательности:
(А) длина: 7 аминокислот
(B) тип: аминокислотный
(D) топология: линейная
(ii) Молекулярный тип: пептид
(xi) Описание последовательности: SEQ ID NO: 36:
(2) информация о последовательности SEQ ID NO: 37:
(i) Характеристики последовательности:
(А) длина: 7 аминокислот
(B) тип: аминокислотный
(D) топология: линейная
(ii) Молекулярный тип: пептид
(xi) Описание последовательности: SEQ ID NO: 37:
(2) Информация о последовательности SEQ ID NO: 38:
(i) Характеристики последовательности:
(А) длина: 7 аминокислот
(B) тип: аминокислотный
(D) топология: линейная
(ii) Молекулярный тип: пептид
(xi) Описание последовательности: SEQ ID NO: 38:
(2) Информация о последовательности SEQ ID NO: 39:
(i) Характеристики последовательности:
(А) длина: 7 аминокислот
(B) тип: аминокислотный
(D) топология: линейная
(ii) Молекулярный тип: пептид
(xi) Описание последовательности: SEQ ID NO: 39:
(2) Информация о последовательности SEQ ID NO: 40:
(i) Характеристики последовательности:
(А) длина: 7 аминокислот
(B) тип: аминокислотный
(D) топология: линейная
(ii) Молекулярный тип: пептид
(xi) Описание последовательности: SEQ ID NO: 40:
(2) Информация о последовательности SEQ ID NO: 41:
(i) Характеристики последовательности:
(А) длина: 7 аминокислот
(B) тип: аминокислотный
(D) топология: линейная
(ii) Молекулярный тип: пептид
(xi) Описание последовательности: SEQ ID NO: 41:
(2) Информация о последовательности SEQ ID NO: 42:
(i) Характеристики последовательности:
(А) длина: 6 аминокислот
(B) тип: аминокислотный
(D) топология: линейная
(ii) Молекулярный тип: пептид
(xi) Описание последовательности: SEQ ID NO: 42:
(2) Информация о последовательности SEQ ID NO: 43:
(i) Характеристики последовательности:
(А) длина: 7 аминокислот
(B) тип: аминокислотный
(D) топология: линейная
(ii) Молекулярный тип: пептид
(xi) Описание последовательности: SEQ ID NO: 43:
(2) Информация о последовательности SEQ ID NO: 44:
(i) Характеристики последовательности:
(А) длина: 6 аминокислот
(B) тип: аминокислотный
(D) топология: линейная
(ii) Молекулярный тип: пептид
(xi) Описание последовательности: SEQ ID NO: 44:
(2) Информация о последовательности SEQ ID NO: 45:
(i) Характеристики последовательности:
(А) длина: 5 аминокислот
(B) тип: аминокислотный
(D) топология: линейная
(ii) Молекулярный тип: пептид
(xi) Описание последовательности: SEQ ID NO: 45:
(2) Информация о последовательности SEQ ID NO: 46:
(i) Характеристики последовательности:
(А) длина: 6 аминокислот
(B) тип: аминокислотный
(D) топология: линейная
(ii) Молекулярный тип: пептид
(xi) Описание последовательности: SEQ ID NO: 46:
(2) Информация о последовательности SEQ ID NO: 47:
(i) Характеристики последовательности:
(А) длина: 7 аминокислот
(B) тип: аминокислотный
(D) топология: линейная
(ii) Молекулярный тип: пептид
(xi) Описание последовательности: SEQ ID NO: 47:
(2) Информация о последовательности SEQ ID NO: 48:
(i) Характеристики последовательности:
(А) длина: 6 аминокислот
(B) тип: аминокислотный
(D) топология: линейная
(ii) Молекулярный тип: пептид
(xi) Описание последовательности: SEQ ID NO: 48:
(2) Информация о последовательности SEQ ID NO: 49:
(i) Характеристики последовательности:
(А) длина: 6 аминокислот
(B) тип: аминокислотный
(D) топология: линейная
(ii) Молекулярный тип: пептид
(xi) Описание последовательности: SEQ ID NO: 49:
(2) Информация о последовательности SEQ ID NO: 50:
(i) Характеристики последовательности:
(А) длина: 6 аминокислот
(B) тип: аминокислотный
(D) топология: линейная
(ii) Молекулярный тип: пептид
(xi) Описание последовательности: SEQ ID NO: 50:
(2) Информация о последовательности SEQ ID NO: 51:
(i) Характеристики последовательности:
(А) длина: 7 аминокислот
(B) тип: аминокислотный
(D) топология: линейная
(ii) Молекулярный тип: пептид
(xi) Описание последовательности: SEQ ID NO: 51:
(2) Информация о последовательности SEQ ID NO: 52:
(i) Характеристики последовательности:
(А) длина: 6 аминокислот
(B) тип: аминокислотный
(D) топология: линейная
(ii) Молекулярный тип: пептид
(xi) Описание последовательности: SEQ ID NO: 52:
(2) Информация о последовательности SEQ ID NO: 53:
(i) Характеристики последовательности:
(А) длина: 5 аминокислот
(B) тип: аминокислотный
(D) топология: линейная
(ii) Молекулярный тип: пептид
(xi) Описание последовательности: SEQ ID NO: 53:
(2) Информация о последовательности SEQ ID NO: 54:
(i) Характеристики последовательности:
(А) длина: 5 аминокислот
(B) тип: аминокислотный
(D) топология: линейная
(ii) Молекулярный тип: пептид
(xi) Описание последовательности: SEQ ID NO: 54:
(2) Информация о последовательности SEQ ID NO: 55:
(i) Характеристики последовательности:
(А) длина: 6 аминокислот
(B) тип: аминокислотный
(D) топология: линейная
(ii) Молекулярный тип: пептид
(xi) Описание последовательности: SEQ ID NO: 55:
(2) Информация о последовательности SEQ ID NO: 56:
(i) Характеристики последовательности:
(А) длина: 7 аминокислот
(B) тип: аминокислотный
(D) топология: линейная
(ii) Молекулярный тип: пептид
(xi) Описание последовательности: SEQ ID NO: 56:
(2) Информация о последовательности SEQ ID NO: 57:
(i) Характеристики последовательности:
(А) длина: 7 аминокислот
(B) тип: аминокислотный
(D) топология: линейная
(ii) Молекулярный тип: пептид
(xi) Описание последовательности: SEQ ID NO: 57:
Сокращения имеют значения, приведенные на фиг. 42-71.
Окончание -NH2 означает: что C-концевая аминокислота находится в ее амидной форме.
Соединения изобретения могут быть проверены на противоопухолевую активность традиционными методиками, например, описанными ниже.
А. Методика in vitro.
Цитотоксичность может быть измерена с использованием стандартной методики для линий адгезивных клеток, такой как с использованием тетразолиевой пробы на микрокультуре (MTT). Детали данного анализа опубликованы (Alley, МС et al. , Cancer Research, 48: 589-601, 1988). Экспоненциально растущие культуры опухолевых клеток, таких как клетки НТ-29 карциномы ободочной кишки или LX-1 опухоли легкого, используют с тем, чтобы получить культуры клеток в микроплатах. Клетки высевают при концентрации 5000- 20000 клеток на лунку в 96-луночных планшетах (в 150 мкл среды) и выращивают в течение ночи при температуре 37oC. Добавляют испытуемые соединения при 10-кратных разбавлениях, варьирующихся от 10-4 M до 10-10 М. Затем клетки инкубируют в течение 48 ч. Для определения количества жизнеспособных клеток в каждую лунку добавляют краситель MTT (50 мкл 3 мг/мл раствора 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолийбромида в солевом растворе). Эту смесь инкубируют при температуре 37oC в течение 5 ч, после чего в каждую лунку добавляют 50 мкл 25%-ного додецилсульфата натрия (SDS), pH 2. После инкубации в течение ночи спектральную поглощательную способность каждой лунки при 550 нм регистрируют с использованием планшет-ридера твердофазного иммуноферментного анализа. Вычисляют значения для средних стандартных отклонений +/- от данных из репликативных лунок, используя формулу % О/К (% отношения обработанных клеток к контрольным).
Концентрация испытуемого соединения, которая дает О/К, равную 50%-ному ингибированию роста, обозначается как IC50 (ингибирующая рост на 50% концентрация).
Б. Методика in vivo.
Соединения изобретения могут быть далее испытаны в любом из различных доклинических анализов на активность in vivo, что является показателем клинической пригодности. Такие анализы осуществляют на бесшерстных мышах, которым трансплантирована ("ксенотрансплантирована") опухолевая ткань, предпочтительно человеческого происхождения, что хорошо известно в данной области техники. Испытуемые соединения оцениваются на их противоопухолевую эффективность после введения ксенотрансплантатнесущим мышам. Более конкретно, человеческие опухоли, выращенные на бесшерстных мышах (бестимусных мышах с мутацией по гену nude), трансплантируют новых реципиентных животных с использованием опухолевых фрагментов, которые имеют размер около 50 мг. День трансплантации обозначен как день 0. Через 6-10 дней мышей обрабатывают испытуемым соединением, вводимым внутривенно или внутрибрюшинно в виде инъекции, в группах по 5-10 мышей на каждую дозу. Соединения назначают ежедневно в течение 5 дней, 10 дней или 15 дней при дозировке 10-100 мг/кг массы тела. Диаметр опухолей и массы тела измеряют дважды в неделю. Объемы опухолей вычисляют с использованием диаметров, измеренных кронциркулем Верниера, и формулы
(длина x ширина2)/2 + мг массы опухоли
Средние массы опухолей вычисляют в отношении каждой лечебной группы, а значения О/К определяют в отношении каждой группы относительно нелеченых контрольных опухолей.
Новые соединения изобретения проявляют хорошую активность in vitro в вышеупомянутых системах анализов и противоопухолевую активность в вышеупомянутой системе in vivo.
Ниже приводятся данные по характеристике свойств полученных соединений.
В частности, приведены сведения о масс-спектроскопии пептидов (см. табл. 3). С помощью методики А, которая раскрыта в материалах заявки, эти соединения были проанализированы на противоопухолевую активность. Результаты этого анализа представлены в табл. 5. Далее была изучена цитотоксичность этих пептидов с помощью окрашивания кристаллическим фиолетовым (см. табл. 6). Некоторые из соединений были протестированы в доклиническом анализе для определения противоопухолевой активности in vivo. В табл. 8 даны соответствующие сведения.
Соли заявленных соединений можно получить путем обработки пептидов эквивалентным количеством кислоты и концентрированием осадка. В табл. 8 приведены данные, полученные для указанных солей.
Таким образом, материалы, содержащиеся в описании, показывают наличие противоопухолевой активности у пептидов согласно изобретению. Кроме того, они содержат достоверные данные, подтверждающие пригодность заявленного способа для лечения онкологических заболеваний у млекопитающих. Поскольку новые соединения в испытаниях in vivo не проявили токсичности, их можно считать малотоксичными или слаботоксичными.
Соединения этого изобретения могут быть проанализированы на противоопухолевую активность с помощью обычных методик, например, приведенных ранее.
А. Методика in vitro, приведенная выше.
Результаты анализа противоопухолевой активности соединений приведены в табл. 5.
Далее соединения по изобретению анализировались на противоопухолевую активность с помощью количественного анализа кристаллического фиолетового на цитотоксичность.
Этот анализ проводили в соответствии с методом, описанным Flick Н. and Gifford G.E., J. Immunol. Meth. 68, 167-175 (1984). Протеины жизнеспособного монослоя клеток окрашивались после экспозиции в цитотоксичном лекарстве и колориметрически измерялось количество. Тестируемые клетки (СХ-1, клон карциномы человека) помещали в 96-ячеистую лунку микротитровальной пластинки при плотности 2-3•103 клеток/лунку и культивировали при стандартных условиях культивирования (RPMI с 10%-ной фетальной сывороткой теленка и 1% необязательных аминокислот) при 37oC и 5% CO2 в течение 1 дня. Затем клетки подвергали воздействию тестируемыми соединениями в нескольких концентрациях. Контроль инкубировали в среде отдельно. После дальнейшей инкубации в течение 72 ч культуральную среду перемешивали путем встряхивания и добавляли 58 мкл окрашенного кристаллического фиолетового в каждую лунку. После окрашивания в течение 20 мин окрашенный раствор сливали и пластинки отмывали сильной струей воды до тех пор, пока весь несвязанный краситель удалится.
Оставшийся нерастворимый кристаллический краситель растворяли, добавляя 100 мкл раствора, содержащего 50% этанола и 0,1% уксусной кислоты к каждой лунке. Монослой каждой лунки определяют с использованием микротитровальных пластинок ELISA счетчик при 540 нм (Titertec Multiscan, Flow. Lab. Mechenheim). Концентрация тестируемого соединения, которая дает Т/C 50% ингибирование роста, была обозначена как ID50. Результаты анализа цитотоксической активности описываемых соединений приведены в табл. 6.
Методика in vivo.
Далее соединения согласно изобретению тестировались в доклиническом анализе для определения активности in vivo, которая показывает их клиническую пригодность. Анализ проводили на бесшерстных мышах, которым были трансплантированы (ксенотрансплантированы) опухолевые ткани, предпочтительно человеческой природы, как это хорошо известно из данной области техники. Тестируемые соединения оценивали на их противоопухолевую эффективность после введения мышам, несущим ксенотрансплантат. Более конкретно, опухоли молочной железы человека (МХ-1), которые были выращены у бесшерстных мышей (бестимусных мышей с мутацией в гене nude) трансплантировали в новых мышей реципиентов. День трансплантации обозначали как 0 день. Спустя 6-10 дней мышей обрабатывали тестируемыми соединениями, которые вводили внутривенно, при каждой дозе использовали группы в 5-10 мышей. Соединения давали каждый день, в течение 3 недель, при дозе 1-100 мг/кг веса тела. Диаметр опухоли и вес тела измеряли дважды в неделю. Размер опухоли определяли с использованием диаметра, измеренного циркулем Верниера, и формулы
(длина x ширина2)/2 = mm3 объем опухоли (фиг. 72).
Значение массы опухоли рассчитано для каждой обработанной группы и Т/С значение определялось для каждых соответствующих необработанных контрольных опухолей.
На фиг. 72 дана противоопухолевая активность на примере опухоли молочной железы (соединения примера 1).
Второй пример показывает мышей, которые были обработаны соединением примера 234, 25 мг/кг три раза в неделю в течение трех недель. Все опухоли в обработанной группе исчезли, в то время как в контроле опухоли выросли такими большими, что мыши погибли. Невыросшие опухоли наблюдались у обработанных мышей.
Регресс опухоли наблюдали при дозах, которые не были токсичными для лошадей (фиг. 73).
На фиг. 73 дана противоопухолевая активность на примере соединения 234.
Сравнительное изучение соединения примера 234 и его гидрохлорида in vivo и in vitro. Цитотоксичность in vitro приведена в табл. 7.
Активность in vivo против MX-l, человеческих карцином молочной железы ксенотрансплантированных (s.c.) бесшерстным мышам.
На фиг. 74 дана противоопухолевая активность соединений по изобретению in vitro против МХ-1, человеческой карциномы молочной железы.
Свободные амиды и их гидрохлориды показали одинаковую биологическую активность.
Аналогичные соединения тестировались in vivo.
Другие соединения были также исследованы на модели MX-l, как описано ниже. Соединения были изучены i.v.
Соединения, которые имели хорошую активность на МХ-1 модели, были также тестированы на дополнительных моделях in vivo. Влияние на рост опухоли описываемых соединений, тестируемых in vivo, приведено в табл. 8.
Эти данные показывают, что новые соединения обладают свойствами хороших ингибиторов роста опухоли.
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| АНАЛОГ ДОЛОСТАТИНА | 1993 |
|
RU2132334C1 |
| ДЛИТЕЛЬНО ДЕЙСТВУЮЩЕЕ ПРОИЗВОДНОЕ АДРЕНОМЕДУЛЛИНА | 2016 |
|
RU2825663C2 |
| ДЛИТЕЛЬНО ДЕЙСТВУЮЩЕЕ ПРОИЗВОДНОЕ АДРЕНОМЕДУЛЛИНА | 2016 |
|
RU2738416C2 |
| ПРОИЗВОДНЫЕ ПОЛИПЕПТИДА, ОБЛАДАЮЩИЕ ИНСУЛИНОТРОПНОЙ АКТИВНОСТЬЮ, ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ, СПОСОБЫ УСИЛЕНИЯ ДЕЙСТВИЯ ИНСУЛИНА, СПОСОБЫ ЛЕЧЕНИЯ ДИАБЕТА | 1993 |
|
RU2128663C1 |
| СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ОЛИГОПЕПТИДОВ | 1994 |
|
RU2136697C1 |
| ПЕПТИДЫ, ИЛИ ИХ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИ ПРИЕМЛЕМЫЕ КИСЛОТЫ, ИЛИ СОЛИ, ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ, ОБЛАДАЮЩАЯ АНТАГОНИСТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ ПО ОТНОШЕНИЮ К БОМБЕЗИНУ, СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ РАКА У МЛЕКОПИТАЮЩИХ | 1994 |
|
RU2114118C1 |
| Стабильные при хранении ферментные препараты, их получение и применение | 2018 |
|
RU2783163C2 |
| ПЕПТИДЫ ГЛЮКАГОНОВОГО СУПЕРСЕМЕЙСТВА, ОБЛАДАЮЩИЕ АКТИВНОСТЬЮ ОТНОСИТЕЛЬНО ЯДЕРНЫХ ГОРМОНАЛЬНЫХ РЕЦЕПТОРОВ | 2011 |
|
RU2604067C2 |
| НОВЫЕ АГОНИСТЫ NPR-B | 2010 |
|
RU2636738C2 |
| НОВЫЕ АГОНИСТЫ NPR-B | 2010 |
|
RU2557290C2 |
Использование: в медицине, поскольку новые пептиды обеспечивают потенциально улучшенные терапевтические возможности лечения неопластических заболеваний. Сущность изобретения: производные пептида общей формулы I: R1R2N-CH(X) CO-A-B-D-(E)u-(F)v-(G)w-K, где R1 - AlkO, (низш.) Alk, FAlk, цикло Alk, аминосульфонил, последний может быть замещен Alk, OH или NR3R4, где каждый R3 и R4 может быть водородом, либо алкилом; R2 - водород, Alk, FAlk, цикло Alk, R1 и R2 вместе - 5-членный гетероцикл, A - остаток аминокислот в выбранный из: Val, Ile, Leu, алло-Ile, α-аминоизобутаноила, 3-трет-бутил Ala, 2-трет-бутил Gly, 3-циклогексил Ala, 2-этил Gly, 2-циклогексил Gly, Nle, NVal; B - остаток: N-Alk-Val, NVal, Leu, Ile, 2-трет-бутил Gly, 3-трет-бутил Ala, 3-циклогексил Ala, Phe, 2-циклогексил Gly; D, E, F и G, независимо, выбирают из группы, содержащей: Pro, гомо Pro, гидрокси Pro, тиазолидинил-4-карбонила, 1-аминопентил-1-карбонила, Val, 2-трет-бутил Gly, Ile, Leu, 2-циклогексил Ala, Phe, N-метил Phe, тетрагидроизохинолил-2-карбонила, 3-тиазолил Ala, 3-тиенил Ala, His, 1-аминоиндолил-1-карбонила, Arg, 3-пиридил Ala, 3-трет-бутил Ala, 2-циклогексил Gly, NVal, NLeu и 3-нафтил Ala; X - водород, алкил, циклоалкил -CH2-циклогексил или арилалкил; E и F вместе - пятичленное гетероциклическое кольцо, содержащее азот и/или кислород, серу; u, v и w - равны, независимо, 0 или 1; K - OH, AlkO, фенокси, бензилокси, замещенная или незамещенная аминогруппа, или их соли с физиологически совместимыми кислотами; фармацевтическая композиция, содержащая носитель и активное вещество формулы I в эффективном количестве. 2 с. и 8 з.п. ф-лы, 8 табл., 74 ил.
где R1 - алкокси, низший алкил, циклоалкил, фторалкил, аминосульфонил, который может быть замещен алкилом; гидрокси или NR3R4, где каждый R3 и R4 может быть либо водородом, либо алкилом;
R2 - водород, алкил, фторалкил, циклоалкил;
R1-N-R2 вместе могут обозначать 5-членный гетероцикл, который может быть незамещенным или замещенным одним или более заместителями, представляющими собой алкильные группы;
А - остаток валила, изолейцила, лейцила, аллоизолейцила, α-аминоизобутаноила, 3-трет-бутилаланила, 2-трет-бутилглицила, 3-циклогексилаланила, 2-этилглицила, 2-циклогексилглицила, норлейцила, норвалила;
В - остаток N-алкил-валила, -норвалила, -лейцила, -изолейцила, -2-трет -бутилглицила, 3-трет -бутилаланила, 3-циклогексилаланила, -фенилаланила или -2-циклогексилглицила;
D, Е, F и G независимо выбирают из группы, состоящей из остатков пролила, гомопролила, гидроксипролила, тиазолидинил-4-карбонила, 1-аминопентил-1-карбонила, валила, 2-трет-бутилглицила, изолейцила, лейцила, 3-циклогексилаланила, фенилаланила, N-метилфенилаланила, тетрагидроизохинолил-2-карбонила, 3-тиазолилаланила, 3-тиенилаланила, гистидила, 1-аминоиндолил-1-карбонила, аргинила, 3-пиридилаланила, 3-трет-бутилаланила, 2-циклогексилглицила, норвалила, норлейцила и 3-нафтилаланила;
Х - водород, алкил, циклоалкил, -СН2-циклогексил или арилалкил;
Е и F вместе могут обозначать
где Y - водород или низший алкил;
Z обозначает водород или низший алкил;
n = 1, 2 или 3;
V - кислород или сера;
М - водород, низший алкил, арилалкил, циклогексил или -СН2-циклогексил;
Q - водород;
R - водород или низший алкил;
или R и Q могут вместе образовывать связь;
U - водород, низший алкил, фенил или циклоалкил;
W - водород, низший алкил или фенил;
u, v и w независимо равны 0 или 1;
К - гидрокси, алкокси, фенокси, бензилокси или замещенная или незамещенная аминогруппа,
и их соли с физиологически совместимыми кислотами.
который может быть незамещенным или замещенным одним или более заместителями, представляющими собой алкильные группы.
R5 - N - R6,
в которой R5 - водород, низший алкил, низший алкокси, бензил;
R6 - водород, низший алкил, фенил, С5-циклоалкил, бензил, незамещенный или замещенный трижды низшей алкоксигруппой, бифенил, тиадиазолил, замещенный низшим алкилом или -СН2R7 - пятичленным гетероарилом, где R7 - водород, бензил, а гетероарил выбран из группы; тиазол, тиофен, оксазол.
| US, 4816444А, кл | |||
| Способ восстановления хромовой кислоты, в частности для получения хромовых квасцов | 1921 |
|
SU7A1 |
| US, 4879278A, кл | |||
| Устройство для сортировки каменного угля | 1921 |
|
SU61A1 |
| Wunseh E., Houben Weye, Meth | |||
| d | |||
| Org | |||
| Chemie, Bd | |||
| XV, 1, p | |||
| Телефонно-осведомительный аппарат | 1921 |
|
SU306A1 |
| Freidinger R., J.Org | |||
| Chem | |||
| Soc., 1982, 104-109 | |||
| Join P.et.al., Tetrahedron Letters (1992), 22807 - 2810 | |||
| Sucker H.et.al | |||
| Pharmazeutische Technologie, Thieme - Verlag, Stuttgart, 1978. | |||
