МУЛЬТИЭНЗИМНАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ЖИВОТНОВОДСТВА Российский патент 1998 года по МПК C12N9/24 C12N9/28 A23K1/165 

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к разработке биотехнологической продукции - мультиэнзимной композиции (МЭК), которая позволяет увеличить долю нелущеного ячменя, вводимого в комбикорма или полнорационные смеси для сельскохозяйственных животных и птицы.

Ячмень разной технологической подготовки (лущеный и нелущеный) относится к традиционным фуражным культурам, но из-за некоторых специфических особенностей имеет ограничения в использовании. Например, нормы ввода в комбикорм для птицы разных возрастных групп лущеного ячменя составляют от 40 до 50%, нелущеного от 15 до 40%. Ограничения ввода ячменя, особенно нелущеного, связаны с высоким, по сравнению с другими зерновыми, содержанием клетчатки (в 2,5 раза), небольшим содержанием энергии, низкой доступностью лизина и присутствием β - глюкана (полисахарида коллоидного типа), которые приводят к снижению поедаемости корма, скорости роста, эффективности конверсии питательных веществ и образованию липкого помета.

В ячмене важнейший источник энергии - крахмал - находится в эндосперме, окруженном клеточной стенкой, состоящей в основном из β -глюкана и арабиноксилана. Это специфические углеводы, характеризуются высокой вязкостью, в результате чего в пищеварительном тракте моногастричных животных образуются высоковязкие растворы, увеличивающие объем и массу химуса и замедляющие скорость прохождения корма, что ведет к нарушению процессов пищеварения.

Следует отметить, что лущение таких культур, как ячмень, овес, позволяют значительно уменьшить содержание клетчатки, но содержание β -глюканов при этом не меняется, т.к. они покрывают крахмал эндосперма.

Разработан способ увеличения доли нелущеного ячменя в составе комбикормовой продукции (до 60 - 70%) для сельскохозяйственных животных и птицы путем использования комплексного ферментного препарата (МЭК), способствующего разрушению β -глюканов и компонентов клетчатки и снятию проблем, связанных с повышенной вязкостью кишечного содержимого.

Известны мультиэнзимные композиции (МЭК-ЦГАП-Л и МЭК-ЦГАП), содержащие целлюлозу, β -глюканазу, амилазу, протеазу, лизоцим, ксиланазу, предназначенные для введения в комбикорма, содержащие до 40 - 50% ячменя 30 - 40% пшеницы и тритикале и 15 - 20% ржи. (1).

Обогащение комбикормов для бройлеров этими композициями в дозах 0,05 - 0,1% повышает использование в организме птицы белков на 4 - 6%, жира на 5 - 7%, энергии на 5 - 8% и продуктивность на 12 - 15%.

Однако, авторы рекомендуют использовать композиции в комбикормах, содержащих до 40 - 50% ячменя, что ограничивает их применение при более высоком содержании фуражного зерна (60 - 70%).

Фирма Хехст (Германия) разработала комплексный препарат Хостазим C на основе Trichoderma reesei для снятия фактора " β -глюкана" в ячменьсодержащих кормах, что позволяет использовать более дешевые рационы при производстве птицы (2). Использование Хостазима C, по данным фирмы, обеспечивает разрушение компонентов клетчатки в комбикормах, содержащих до 52% ячменя, причем не указан технологический способ подготовки ячменя (лущеный или нелущенный), как и в предыдущем аналоге, что существенно для процессов ферментолиза зерна в пищеварительном тракте животных и птицы.

Задача авторов заключается в создании препарата комплексного действия, эффективного в составе комбикормов, содержащих более повышенное содержание нелущеного ячменя (60 - 70%), исключающего дополнительную дорогостоящую предобработку лущения зерна.

Известно (3, 4), что для максимальной деструкции природных полимеров типа целлюлозы, гемицеллюлозы, лигнина, β -глюканов и др. необходимо совместно воздействие эндо- и экзоферментов, т.к. ферменты эндогенного действия преимущественно осуществляют деполимеризацию макромолекул субстрата (питательных веществ), а экзогенного, в основном, отщепляют концевые остатки фрагментов макромолекул частично гидролизованного субстрата. Причем, бактерии синтезируют, в основном, эндоферменты, а микроскопические грибы - ферменты экзогенного действия.

Целью предлагаемого изобретения является создание препарата комплексного действия, сбалансированного по наличию ферментов грибного и бактериального происхождения, эффективно расщепляющего производные целлюлозы - β -глюканы, ксиланы, арабиноксиланы и др. зерна ячменя, составляющего основу промышленных комбикормов (до 60 - 70%).

Для разработки комплексного препарата были использованы грибные целлюлазы из наиболее продуктивных штаммов Trichoderma reesei (Tr.reesei) и Trichoderma viride (Tr.viride), отличающиеся разными уровнями активности β -глюканаз и ксиланаз, а также препарат бактериального происхождения из Bacillus subtilis (Bac.subtilis), продуцирующий, наряду с амилазой, ферменты β -глюканазного действия (табл.1).

Характеристику препаратов проводили согласно методам, принятым в микробиологической промышленности (3, 5, 6, 7, 8, 9).

Поставленная цель достигается тем, что в качестве компонентов МЭК используют ферментные целлюлолитические препараты с содержанием экзо- β -глюканазы 450 - 800 ед/г, эндо- β -глюканазы 300 - 500 ед/г и ксиланазы на уровне 700 - 900 ед/г и ферментный препарат из Bac.subtilis с содержанием экзо- β -глюканазы не ниже 200 ед/г и эндо - β -глюканазы на уровне 50 - 100 ед/г. Использование высокоактивных препаратов с наличием необходимых ферментов создает предпосылки разработать комплексный препарат, содержащий систему грибных и бактериальных целлюлаз с определенным соотношением глюканаз и ксиланаз, позволяющих эффективно разрушать природные полимеры зерна ячменя.

Таким образом, предлагается мультиэнзимная композиция, отличается тем, что она содержит целлюлолитический препарат их Trichoderma reesei или Trichoderma viride и амилолитический - из Bacillus subtilis при следующем соотношении активностей ферментов

Из таблицы 1 видно, что целловиридин Г20х (образцы 2, 3) по уровню β -глюканаз и ксиланазы значительно уступает препарату целловиридин-5000 при одном и том же уровне общей целлюлолитической активности. Следует отметить, что существенным преимуществом препарата из Tr.reesei (образцы 4, 6) и Tr. viride (образец 1) является наличие высокого уровня активности эндо- β -глюканазы, катализирующей процесс деполимеризации вязких ячменных субстанций.

К преимуществам препарата из Tr.reesei относится закономерность пропорциональности активностей эндо- и экзоферментов, что объясняется специфическими свойствами продуцента и направленным биосинтезом. В связи с этим для создания МЭК выбран препарат, получаемый преимущественно на основе Tr.reesei. Препарат из Tr.viride может быть использован при условии содержания в нем β -глюканазы не менее 450 ег/г.

В качестве источника бактериальных ферментов использован амилосубтилин ГЗх.

Для оценки эффективности предлагаемой мультиэнзимной композиции было изготовлено 5 образцов МЭК с различным соотношением ферментов.

Образцы готовили на лабораторной установке "Эрвека" методом сухого смешивания, при частоте перемешивания 30 об/мин в течение 30 мин.

Характеристика образцов МЭК представлена в табл.2.

Образец МЭК ЦГАП (МЭК-1) по уровню ферментативных активностей и их соотношений соответствует ближайшему аналогу (1), образцы МЭК-2, МЭК-3, МЭК-4 соответствуют по соотношению грибной ксиланазы и β -глюканазы заявленному составу композиций, образцы МЭК-5 и МЭК-6 по соотношению активностей ферментов, определяющих сущность изобретения, отличаются от заявляемого решения.

Преимущества предлагаемого решения по сравнению с ближайшим аналогом представлены в примерах 1, 2, 3, 4, 5.

Пример 1. Эффективность действия заявляемой композиции в процессах разрушения β -глюкана нелущеного ячменя (таблица 3). Содержание β -глюкана в ячмене определяли методом, рекомендованным Ермаковой Р.А. (10).

Результаты табл. 3 подтверждают преимущества заявляемой композиции по эффективности гидролиза β -глюкана: степень разрушения β -глюкана в вариантах 3, 4, 5 на 14,80 - 16,15% выше, чем в варианте 1 с использованием аналога. Образцы МЭК-5 и МЭК-6, в которых соотношения КсА и экзо- β -ГлА находятся за пределами заявляемого решения, уступают вариантам 3, 4, 5. Увеличение степени гидролиза β -глюкана в вариантах 6, 7 составляет 8,10% и 5,20%.

Пример 2. Эффективность заявляемой композиции в процессах деструкции полисахаридов зерна ячменя и комбикормов на основе ячменя, оценивали по методу, основанному на последовательном определении продуктов гидролиза углеводов с использованием реактива ДНС (11, 12). Из анализа представленных данных (табл. 4) следует, что гидролиз углеводов зерна ячменя протекает с большей интенсивностью в вариантах 3, 4, 5 (МЭК-2, МЭК-3, МЭК-4), чем в варианте 2 с ближайшим аналогом и вариантах 6, 7 (МЭК-5, МЭК-6). Связанное с этим увеличение количества редуцирующих сахаров объясняется синергическим действием β -глюканазы, ксиланазы в оптимальных соотношениях и амилазы, причем, доступность и атакуемость крахмальных зерен амилазами обусловливается первоначальным ферментативным разрушением некрахмальных полисахаридов, обволакивающих крахмалосодержащие субстанции в зерне. В вариантах -2, 5, 6, где соотношение КсА и экзо- β -ГлА отличаются от заявляемых, показатели снижения содержания гемицеллюлоз и целлюлозы уступают соответствующим величинам в оптимальных вариантах.

Так, содержание гемицеллюлоз в вариантах 3, 4, 5 снижается на 1,26 - 1,52%, против 0,45% (ближайший аналог) - 1,07 - 1,02% (варианты 6, 7); уменьшение содержания целлюлозы составляет соответственно 0,45 - 0,57% против 0,14 - 0,31 - 0,35%.

Образцы МЭК вводили в состав комбикорма ячменно-пшеничного типа в количестве 0,1 - 0,2% ( в зависимости от величины экзо - β -ГлА) к массе комбикорма. Комбикорм включал в %%: ячмень - 69,7; шрот соевый - 12,0; сухое обезжиренное молоко - 2,0; рыбную муку - 3,0; отруби пшеничные - 5,0; дрожжи кормовые - 3,0; жир животный кормовой - 2,0; фосфат обесфторенный - 1,2; мел - 0,9; соль поваренную - 0,9; премикс КС-3.

1 кг комбикорма содержал: кормовых единиц - 1,23; обменной энергии - 13,60 МДЖ; сырого протеина - 182,00 г; лизина - 9,6 г; метионина+цистина - 5,9 г; сырой клетчатки - 35,6 г; кальция - 9,7 г; фосфора - 7,7 г; железа - 122,5 мг; меди - 88,0 мг; цинка - 120,5 мг; марганца - 92,0 мг; кобальта - 0,55 мг; йода - 1,55 мг; витаминов: A - 59500 ME; D - 6000 ME; E - 42,0 мг; B1 - 3,0 мг; B2 - 15,2 мг; B3 - 17,5 мг; B4 - 1,4 мг; B5 - 45,0 мг; B12 - 34,0 мг.

Результаты ферментолиза комбикорма представлены в таблице 5.

В данных табл. 5, иллюстрирующих эффективность ферментолиза ячменно-пшеничного комбикорма, просматривается тенденция, аналогичная процессу гидролиза полисахаридов ячменя (табл.4). Результаты по увеличению содержания сахаров и снижение количества углеводов в вариантах 3 - 7 превосходят значения соответствующих показателей для ближайшего аналога (вариант 2).

Максимальное увеличение содержания редуцирующих сахаров на 4,59 - 4,77%, обусловленное ферментативной деструкцией гемицеллюлоз, целлюлозы и крахмала, отмечено в вариантах с оптимальными (заявляемым) соотношением КсА и экзо- β -глюконазы (вар. 3, 4, 5). Этот показатель уступает оптимальным и составляет 2,97 - 3,07%.

Пример 4. Одним из существенных показателей эффективности МЭК является снижение вязкости водных полимеров в организме животного, что способствует устранению клейкости помета, и тем самым нормализации пищеварительных процессов. Эффективность МЭК в процессах разжижения комбикормов на основе ячменя оценивали по изменению вязкости водных вытяжек из комбикорма, ферментированного образцами МЭК. Процесс ферментации вытяжек проводили по 7 вариантам. Дозировка МЭК составляла 0,1 - 0,2% к сухой массе комбикорма.

Результаты представлены в табл. 6. Из данных следует, что снижение вязкости в наибольшей степени - на 29,3; 31,0 и 32,3 отн. % - отмечено в результате ферментации комбикорма с использованием заявляемой композиции МЭК в оптимальных соотношениях (вар. 3 - 5) ферментов. Использование МЭК-4 и МЭК-5 также способствует снижению вязкости на 21,3 - 19,7 отн. %, что превышает эффект действия ближайшего аналога (вар. 2), но уступает результатам в оптимальных вариантах. По мнению специалистов, 30% снижение вязкости β -глюкана ячменя в растворе - необходимое условие для классификации ферментных препаратов, предназначенных к использованию в рационах (с высоким содержанием ячменя) для сельскохозяйственных животных и птицы (13).

Далее, в примерах 5, 6, 7 представлена эффективность заявляемой композиции в составе комбикормов с повышенным содержанием ячменя, использованных при кормлении кур-несушек, цыплят-бройлеров и выращивании поросят.

Пример 5. Комбикорм для кормления кур-несушек имел состав, представленный в табл.6А.

Испытания МЭК проводили в опытных условиях экспериментального хозяйства ВНИИТИП на 4-х группах птицы по 100 голов в каждой.

Эффективность ферментированных комбикормов оценивали по основных зоотехническим показателям:
- сохранности поголовья, %;
- яйценоскости на среднюю несушку, шт.;
- затратам корма на 10 яиц и 1 кг яичной массы;
- переваримости питательных веществ корма.

Как следует из таблицы 7, сохранность поголовья кур за период опыта была высокой и не зависела от изучаемых факторов (отход по болезни Марека).

Яйценоскость кур в вариантах 2 и 3 составила 200,03 и 197,71 шт., что превысило яйценоскость в контрольном варианте и в варианте 4, отличающимся от заявляемого.

Преимущество заявленной композиции проявляется и в анализе данных затрат корма на 10 яиц: если в оптимальных вариантах затраты составляют 1,50-1,52 кг, то в контроле (вар. 1) этот показатель равен 1,67 кг, что превышает затраты корма во всех 3-х остальных группах птицы. Аналогичная закономерность отмечена в данных по затратам корма на 1 кг яичной массы.

Снижение затрат корма в заявляемых вариантах объясняется лучшим усвоением питательных веществ, что связано с высокой доступностью и переваримостью питательных веществ и снятием фактора β -глюкана.

Так, в вариантах 2 и 3 величина этого показателя для клетчатки составляет 37,66 - 36,42% против 27,97% (вар. 1) и 34,41% (вар. 4). Переваримость протеина в оптимальных вариантах (вар. 2, 3) составляет 89,86% и 89,35%, что превышает значение этого показателя в вар. 1 и 4. В силу этого повышается использование азота и кальция, что является положительным фактором минерального обмена.

Пример 6. Эффективность МЭК при кормлении цыплят-бройлеров.

Рецепты экспериментальных комбикормов представлены в табл. 8.

Эффективность МЭК представлена в табл. 9.

Как следует из представленных зоотехнических показателей для цыплят-бройлеров, получивших комбикорм с образцами МЭК, наилучшие результаты получены в вариантах с МЭК-2 и МЭК-4: данные по средней живой массе (1 гол) (1760 г и 1558 г), по среднесуточному приросту (27,0 г и 12,5 отн.%), затраты корма на 1 кг прироста (2,52 кг и 2,94 кг) подтверждают преимущества заявленной композици МЭК перед ближайшим аналогом (вар. 1) и вариантом (4), отличающимся от заявленного.

Пример 7. Эффективность МЭК в рационах для кормления поросят до 60-дневного возраста и доращивания свиней с 60 до 120 дней проверена в опытном хозяйстве ВИЖ.

Использовали комбикорм следующего состава: Результаты по оценке эффективности МЭК представлены в табл. 11, 12.

Рассмотрение данных табл. 11 позволяет судить о преимуществе заявляемого состава МЭК (вар. 1, 2) перед ближайшим аналогом (вар. 1) и образцом сравнения (вар. 4), которое подтверждается рядом зоотехнических показателей: увеличение среднесуточного прироста поросят (обеих групп) до 105,3 - 113,0 отн. % по сравнению с контролем (вар. 1); снижение затрат комбикорма со 100% в контроле (вар. 1) до 97,4 отн. % (гр. 1) - 90,9 - 92,9 отн. % (гр. 2).

Результаты табл. 12 дополняют данные эффективности действия МЭК в составе комбикормов: повышение степени перевариваемости основных компонентов корма - органических веществ: сырого протеина, сырого жира, сырой клетчатки, БЭВ в заявляемых вариантах (2, 3) - МЭК-2, МЭК-3 по сравнению с контролем МЭК-1 (вар. 1) обеспечивает в этих же вариантах снижение затрат корма и увеличение прироста (табл. 11).

Пример 8. Эксперимент по сравнительной оценке эффективности способов обработки (ферментативной и механической) нелущеного ячменя проведен при выращивании поросят 13 - 104 дн. возраста на фоне комбикормов СК-3 (с 13 - 42 дн. ), СК-4 (с 43 - 60 дн), СК-5 (с 61 - 104 дн.). Комбикорма имели состав, представленный в табл. 13.

Результаты эксперимента представлены в табл. 14.

Данные табл. 14 убедительно доказывают, что введение МЭК в комбикорма с нелущеным ячменем (60 - 48%) устраняет необходимость механической обработки нелущеного ячменя - лущение зерна. Значения основных зоотехнических показателей - среднесуточного прироста и затрат корма на 1 кг прироста в вариантах с МЭК превышают соответствующие показатели в варианте с нелущеным ячменем (контроль-1) и даже в варианте с лущеным ячменем (контроль-2).

Лучшие результаты обеспечивает заявляемая композиция МЭК-3. При выращивании поросят в возрасте 13 - 60 дн. среднесуточный прирост возрастает на 14,9% против контроля-1 (нелущеный ячмень) и на 8,7% против контроля-2 (лущеный ячмень), а затраты корма снижаются соответственно до 86,5%. МЭК-1 (ближайший аналог) уступает по эффективности заявляемому, что выражается в более низких показателях среднесуточного прироста - 108,5 - 102,2% и экономии кормов - 91,2 - 99,5%.

Таким образом, предложенная мультиэнзимная композиция позволяет, прежде всего, повысить, в сравнении с ближайшими аналогами, уровень нелущеного ячменя в комбикормах до 60 - 70% для сельскохозяйственных животных и птицы, а также исключить из технологического процесса подготовки фуражного сырья операцию лущения, превосходящую по стоимости в 2 - 2,5 раза введение МЭК. Применение комбикормов с использованием предлагаемой композиции обеспечивает при этом улучшение зоотехнических показателей: прирост живой массы, повышение яйценоскости, сохранность поголовья, усвояемость питательных веществ корма и, кроме того, позволяет частично или полностью заменить ценное фуражное зерно (пшеница, кукуруза) нелущеным ячменем.

Литература
1. Комбикормовая промышленность, 1996, N 1, с. 32.

2. Информационные материалы фирмы "Хехст" (Германия).

3. Биоорганическая химия, 1980, т. 6, N 8.

4. Ферментные препараты в пищевой промышленности. М. Пищевая промышленность, 1975, с. 76 - 78, 325 - 351.

5. ТУоп МЭК-СХ-2, 1996 г.

6. J. biochem., 1985, v. 22, p. 177 - 180.

7. ТУоп МЭК-СХ-1, 1994.

8. ГОСТ 20264.4-89.

9. ГОСТ 20264.2-88.

10. Ферментная и спиртовая промышленность, 1983, N 6, с. 21 - 22.

11. Ермаков А.И. Методы биохимических исследований растений. - Л.: Колос, 1972.

12. Методы исследования кормов, органов и тканей животных. - М.: Колос, 1969.

13. J. of Animal and Feed Science, 1992, v. 1, p. 65 - 70.

Использование: в сельском хозяйстве при получении комбикормов и полнорационных смесей для сельскохозяйственных животных. Сущность изобретения: мультиэнзимная композиция включает целлюлолитический препарат из Trichoderma viride, амилолитический препарат из Bacillus subtilis. В качестве источника грибных целлюлаз содержит препарат из Trichoderma riesei или Trichoderma viride при соотношении активностей: грибная ксиланаза к грибной и бактериальной экзо-β-глюканазе = 1 : (3,50 - 3,70). 14 табл.

Мультиэнзимная композиция для животноводства, содержащая целлюлолитический и амилолитический препараты, отличающаяся тем, что она содержит целлюлолитический препарат из Trichoderma reesei или Trichoderma viride и амилолитический препарат из Bacillus subtilis при следующем соотношении активностей ферментов: грибная ксиданаза : грибная и бактериальная экзо-β-глюканазы = 1 : (3,50 - 3,70).