ШТАММ БАКТЕРИЙ BACILLUS SUBTILIS - ПРОДУЦЕНТ КОМПЛЕКСА ГИДРОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ, ОБОГАЩЕННЫХ β -ГЛЮКАНАЗОЙ Российский патент 1995 года по МПК C12N9/14 C12N9/42 C12N9/14 C12R1/125 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к производству комплексных ферментных препаратов, обогащенных β -глюканазой, используемых в сельском хозяйстве в кормопроизводстве ячменных кормов, в пищевой промышленности в пивоварении, а также во всех других случаях, связанных с переработкой ячменя.

По данным научно-технической литературы установлено, что эндосперм ячменя содержит гумми-вещества, 85% которых составляет β-глюкан, представляющий собой сложный комплекс некрахмальных полисахаридов. Приготовление ячменного корма в птицеводстве происходит наиболее эффективно при использовании комплексных ферментных препаратов, включающих наряду с β -глюканазой целлюлазы, гемицеллюлазы, протеазы и другие гидролитические ферменты, способствующие эффективному гидролизу ячменного сырья. Целлюлазы и гемицеллюлазы гидролизуют оболочку зерна ячменя, далее на алейроновый слой действуют протеазы, давая возможность β-глюканазе гидролизовать β-глюкан эндосперма. Фермент β-глюканаза расщепляет глюкановые блоки, в которые упакован крахмал, делая доступным его для пищеварительных ферментов.

Наиболее близким к заявляемому объекту является штамм B. subtilis, продуцент β -глюканазы (авт. св. СССР N 1507793, кл. С 12 N 9/42, 1991). Штамм B. subtilis (ВКПМ В-3936), описываемый в прототипе, выделен из почвы на среде с лихенином, и его культивирование производили на питательной среде следующего состава, г/л: нерастворимый крахмал 239,0; кукурузный экстракт 11,4; дрожжи пивные 2,2; лактоза 0,6; аммоний фосфорнокислый, 2-замещенный 8,4; CuSO₄ 0,0036; NaCl 0,28; MgSO₄ 0,15; K₂SO₄ 2,9; CaCl₂ 0,45˙ Н₂О до 1 л. Перед приготовлением среды крахмал предварительно осахаривают ферментом амилазой. Питательную среду стерилизуют при 125^оС, 30 мин, охлаждают и засевают суточной культурой. B.subtilis. Культивирование проводили в колбах и ферментере. Температура выращивания 37^оС, рН 6,5, число оборотов мешалки 180-2400 об/мин, длительность культивирования 48-72 ч. Активность β -глюканазы составила в культуральной жидкости в колбах 20,2 ед/мл, в ферментеpе 41,6 ед/мл.

Недостатками штамма-прототипа являются отсутствие биосинтеза других гидролитических ферментов, сопутствующих β-глюканазе и способствующих эффективному гидролизу полисахаридов ячменного сырья, большая длительность культивирования (48-72 ч), значительная зависимость интенсивности биосинтеза β -глюканазы от условий культивирования (активность β-глюканазы в культуральной жидкости в колбах, составила 20,2 ед/мл, а в ферментере 41 ед/мл).

Цель изобретения создание нового штамма продуцента β -глюканазы, позволяющего за счет присутствия в культуральной жидкости комплекса сопутствующих ферментов получить препарат, значительно более эффективно гидролизующий ячменное сырье, способного быстро расти на дешевой питательной среде, содержащей отходы, обладающего стабильностью процесса биосинтеза ферментов при переходе от лабораторных условий к промышленным.

Цель была достигнута путем многократного рассева штамма Bacillus subtilis (коллекционный номер ВКПМ В-5165), выделением и очисткой моноколоний на средах, содержащих в качестве источника питания лихенан, и путем обработки выделенных моноколоний температурой 100^оС в течение 25 с.

Полученный в результате новый штамм B. subtilis 5790 позволяет получить комплексный ферментный препарат. Полученный штамм депонирован в коллекции, коллекционный номер ВКПМ-В-5790.

Культуральная жидкость культуры Bacillus subtilis ВКПМ-В-5790 содержит следующие ферменты, (методы определения активностей приведены в конце описания): 1,3-1,4 β -глюканаза 60-70 ед/мл, 1,3-1,4 β-глюкозидаза 55-60 ед/мл, β -1,4 эндоглюканаза 4-6 ед/мл, β -1,4 маннаназа 8-10 ед/мл, ксиланаза 21-27 ед/мл, ОЦА (общая цитолитическая активность), 20-30 ед/мл. β -амилаза 15-20 ед/мл, глюкоамилаза 5-8 ед/мл, протеаза нейтральная 1-3 ед/мл, протеаза щелочная 550-630 ед/мл, протеаза кислая 3-5 ед/мл.

Морфология штамма. На МПА (мясопептонном агаре) форма колонии неправильная, морщинистая, мелкоскладчатая, внутренняя структура колонии мелкозернистая, профиль выпуклый, край колонии волнистый, цвет кремовый. На ККА (картофельно-казеиновом агаре) форма колонии ризоидная, плоская, форма края колонии лопастная, на выпуклой стороне край штриха выпукло-зубчатый, цвет колонии белый. Культура аэробная, растет при температуре 25-55^оС, оптимальная температура роста 33-37^оС, рН роста 5,5-8,5 рН оптимальное 6,8-7,8. Физиология питания: ассимилирует следующие источники питания: (углерода) рамнозу, арабинозу, мальтозу, сорбит, сахарозу, ксилозу, маннит, лактозу, галактозу, крахмал, лихенан, β-глюкан.

Ассимилирует следующие источники азота:
неорганические: (NH₄)₂ HPO₄, NH₄NO₃, NH₄Cl, (NH₄)₂SO₄, NaNO₃, KNO₃,
органические: белки, аминокислоты, пептон, мочевину. В качестве источника углеродного и азотного питания потребляет природные субстраты: кукурузную муку, дробленый ячмень, пивную дробину, пшеничные отруби. Длительность культивирования штамма, необходимая для биосинтеза ферментов, 28-32 ч.

П р и м е р 1. Штамм В. subtilis 5790 выращивали в качалочных колбах, объемом 750 мл, с объемом среды 50 мл при температуре 33^оС в течение 32 ч на среде следующего состава: 2% пивной дробины (отход пивоваренного производства), 2% БВК (белково-витаминного концентрата), 1% КН₂РО₄ рН 7,2, воды до 50 мл. Стерилизация среды: 1 атм, 40 мин. Посевной материал: суспензия культуры бактерий, выращенной на агаризованной среде, содержащей мясопептонный бульон и лихенан. Количество посевного материала 2% от объема среды. Число оборотов качалки n 180 об/мин. Культуральная жидкость обладала следующими ферментативными активностями: 1,3-1,4 β -глюканаза 60 ед/мл, β-1,4 эндоглюканаза 4 ед/мл, 1,34-1,4 β -глюкозидаза 55 ед/мл, β- 1,4 маннаназа 8 ед/мл, ксиланаза 21 ед/мл, ОЦА 20 ед/мл, α-амилаза 15 ед/мл, глюкоамилаза 5 ед/мл, протеаза нейтральная 1 ед/мл, протеаза щелочная 550 ед/мл, протеаза кислая 3 ед/мл. Микроскопирование культуры в процессе культивирования показало, что морфология клеток без патологии.

П р и м е р 2. Штамм B. subtilis 5790 выращивали в ферментере объемом 10 л с валом и перемешивающим устройством из шести лопастей и c пеногасящим механическим устройством из двух лопастей, выгрузка культуральной жидкости производилась сжатым стерильным воздухом. Состав питательной среды: 2% пивной дробины, 1,5% БВК, 0,5% дробленого ячменя, 1% КН₂РО₄, воды до 5 л, рН-исходное 6,8. Количество посевного материала 2% от объема питательной среды. Аэрация: один объем воздуха на один объем культуральной жидкости. Число оборотов мешалки 220 об/мин. Длительность культивирования 30 ч, температура культивирования -35^оС. Культуральная жидкость обладала следующими ферментативными активностями: 1,3-1,4 β -глюканаза 65 ед/мл, 1,3-1,4 β-глюкозидаза 57 ед/мл, 1,4 β -эндоглюканаза, 5,0 ед/мл, 1,4 β-маннаназа 9,0 ед/мл, ксиланаза 24,0 ед/мл, ОЦА 25,0 ед/мл, α -амилаза 18 ед/мл, глюкоамилазаа 6,6 ед/мл, протеаза нейтральная 2 ед/мл, протеаза щелочная 600 ед/мл, протеаза кислая 4,0 ед/мл. Микроскопирование клеток культуры в процессе культивирования показало, что морфология клеток без патологии.

П р и м е р 3. Штамм B. subtilis-5790, выращивали в ферментере, объемом 250 л с валом и перемешивающим устройством, состоящим из закрытых турбин. Мешалка лопастная с лопастями расположенными в два яруса. В ферментере осуществлялось механическое перемешивание с барботажным подводом воздуха. Состав питательной среды: 2% пивной дробины, 1,5% БВК, 1,0% КН₂РО₄ воды до 100 л, рН исходное 7,8. Количество посевного материала 2% от объема среды. Температура культивирования, 37^оС, число оборотов мешалки 240 об/мин. Аэрация один объем воздуха на один объем культуральной жидкости. Длительность культивирования 28 ч. Микроскопирование клеток культуры в процессе культивирования показало, что морфология клеток без патологии. Культуральная жидкость имела следующие ферментативные активности: 1,3-1,4 β -глюканаза 70 ед/мл, 1,3-1,4 β -глюкозидаза 60 ед/мл. β -эндоглюканаза 6,0 ед/мл, 1,4 β-маннаназа 10 ед/мл, ксиланаза 27 ед/мл, ОЦА 30 ед/мл, α -амилаза 20 ед/мл, глюкоамилаза 8,0 ед/мл, протеаза нейтральная 3,0 ед/мл, протеаза щелочная 630 ед/мл, протеаза кислая 5 ед/мл.

Таким образом, преимущество предлагаемого штамма заключается в следующем:
способен синтезировать одновременно с β-глюканазой комплекс сопутствующих гидролитических ферментов, усиливающих эффективность гидролиза ячменного сырья;
способен потреблять в качестве источника питания отходы производства (пивную дробину), сохраняя способность биосинтеза глюканазы и сопутствующих ферментов;
отличается стабильностью процесса биосинтеза ферментов при переходе от лабораторных условий выращивания (колбы) к производственным в ферментерах;
имеет сравнительно небольшую длительность культивирования, которая обеспечивает максимальный биосинтез ферментов (28-32 ч).

Методы определения ферментативных активностей.

1.1,3-1,4 β -глюканазу определяли согласно оп. 59-00321-84 "Препарат ферментативный β-глюканаза высокоочищенная". За единицу β-глюканазной активности принимали такое количество фермента, которое способно образовывать в 1 мин из β -глюкана количество олигосахаридов, которое до восстанавливающей способности соответствует 1 мкМ глюкозы. Редуцирующие сахара определяли с 3,5 ДНС (динитро-салициловой кислотой).

2.1,3-1,4 β -глюкозидазу определяли по методу определения 1,3-1,4 β-глюканазы, с использованием в качестве субстрата лихенана
3.1,4 β глюканазу определяли по методике, описанной в журнале "Биоорганическая химия", 1977, т. 3. с. 405-414.

4.1,4 β -маннаназу (осахаривающую) определяли по методу, предложенному в Автореферате диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Власенко Е. Ф. М. 1990. За единицу активности β -маннаназы принимали такое количество фермента, которое за 1 мин при 40^оС и рН 5,8 способно образовывать из галактоманнана такое количество олигосахаридов, которое по восстанавливающей способности соответствует 1 мкМ маннаназы.

5. Ксиланазную активность определяли по ГОСТ 202.66-89 с использованием ксилана фирмы "Sigma".

6. ОЦА (общую цитолитическую активность) определяли согласно ОСТ 10.04.06.86. "Препарат ферментный циторизин ПХ".

7. Амилолитическую активность ( α-амилазу) определяли по ГОСТ 202. 64.4-89.

8. Глюкоамилазную активность определяли по ГОСТ 202.64.4-89.

9. Протеазу нейтральную, щелочную и кислую определяли по ГОСТ 202.662-74 "Препараты ферментные".

Использование: изобретение относится к биотехнологии, к производству ферментных препаратов, к сельскому хозяйству, к кормопроизводству ячменных кормов, используется в пищевой промышленности для пивоварения. Сущность изобретения: путем многократного рассева штамма B.subtilis ВКМП 13 5165 выделением и очисткой моноколоний на средах, содержащих в качестве источника питания лихенан, получен штамм B subtilis ВКПМ 5790. Штамм B. subtilis культивируют на питательной среде, содержащей пивную дробину, БВК, 1% KH₂PO₄, рН 6,8 7,2, температура культивирования 33 -37°С, длительность культивирования 266 32 ч. Культуральная жидкость имела следующие ферментативные активности: 1,3 1,4- β -глюканазу, 1,3 - 1,4- b -глюкозидазу, b -эндоглюканазу, 1,4 маннаназу, ксиланазу, ОЦА (общую цитолитическую активность) 20 30 ед/мл, a амилазу, глюкоамилазу, протеазу нейтральную, протеазу щелочную, протеазу кислую.

Штамм бактерий Bacillus subtilis ВКПM-В-5790 продуцент комплекса гидролитических ферментов, обогащенных b -глюканазой.