СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВИДОВ СЛИЗИ В ИСПРАЖНЕНИЯХ ТЕЛЯТ И ПОРОСЯТ Российский патент 1998 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к ветеринарии, в частности к диагностике дисбактериоза кишечника молодняка сельскохозяйственных животных, а конкретно - к определению видов слизи в испражнениях телят и поросят при дисбактериозе кишечника.

Известно использование методики Трибуле для определения слизи в испражнениях посредством осаждения ее 20%-ным раствором уксусной кислоты (Справочник по клиническим лабораторным методам исследования. /Под ред. Е.А. Коста. - М.: Медицина, 1975, с. 279).

Недостатком этого метода является длительность определения (примерно сутки), применение такого сильного яда как сулема. Он позволяет определить присутствие в испражнениях лишь одного вида слизи - муцина, что явно недостаточно для характеристики других видов и диагностирования заболевания.

Известно также применение метода быстрого определения грампринадлежности бактерий с помощью раствора гидроксида калия (Методы почвенной микробиологии и биохимии. /Под ред. Д.Г. Звягинцева. - М.: Изд. МГУ, 1991, с. 304). Однако он рекомендуется авторами лишь для определения грампринадлежности монокультур бактерий. Нами же он использован для определения увеличения содержания грамотрицательных бактерий в испражнениях молодняка при дисбактериозе кишечника. Одного этого теста для диагностики дисбактериоза кишечника также недостаточно.

Задачей изобретения является разработка способа экспрессного определения видов слизи различного происхождения в свежих испражнениях молодняка при дисбактериозе кишечника и интерпретация получаемых результатов для установления наличия дисбактериоза.

Задача решается тем, что для определения видов слизи применены методики экспресс-анализа (тесты) в следующей последовательности.

Для полуколичественного определения содержания слизи дезоксирибонуклеиновой кислоты грамотрицательных бактерий в испражнениях молодняка млекопитающих животных при дисбактериозе кишечника применена обработка их раствором гидроксида калия.

Для выявления слизи муцина при воспалении слизистой кишечника применено ее определение в суспензии испражнений, в изотоническом растворе хлорида натрия с помощью бактериологической петли.

Для выявления деструкции слизистой кишечника применено выявление хлопьев слизи в суспензии испражнений, разведенных изотоническим раствором в 10²-10³ раз.

Результаты этих трех тестов очень важны для диагностики дисбактериоза кишечника.

Способ осуществляется следующим образом.

Для полуколичественного определения содержания грамотрицательных бактерий в испражнениях молодняка на поверхность чистого обезжиренного сухого предметного стекла пипеткой нанести каплю 3%-ного раствора гидроксида калия. В каплю внести бакпетлей (с диаметром кольца 2 мм) комочек перемешанных испражнений размером с булавочную голову (просяное зерно) и тщательно размешать круговыми движениями. Через 5-8 секунд петлю резко поднять на высоту 8-10 мм над поверхностью стекла.

Суспензия испражнений с низким содержанием грамотрицательных бактерий (здоровый молодняк) равномерно распределяется по капле щелочи (как в воде). Реакция считается отрицательной, если образования слизистых тяжей не наблюдается в течение 60 с.

Суспензия испражнений с высоким содержанием грамотрицательных бактерий при перемешивании становится вязкой и тянется за петлей, образуя мукоидные тяжи толщиной 1-2 мм. Увеличение вязкости вызвано освобождением ДНК при лизисе грамотрицательных бактерий в растворе щелочи. В этом случае для полуколичественного определения содержания грамотрицательных бактерий в испражнениях нанести на поверхность предметного стекла две капли раствора гидроксида калия в одно место и такое же как в первом случае количество испражнений (разведение в два раза). Все операции повторить. Если тяж не образуется - определение закончить, если образуется - нанести 4 капли раствора гидроксида калия и т. д. до тех пор пока реакция не станет отрицательной (перестанет образовываться мукоидный тяж). Последнее разведение, в котором еще образуется слизистый тяж, засчитывается за титр суспензии с положительной реакцией, характеризующей содержание грамотрицательных бактерий в испражнениях.

При сомнительной реакции тяж слизи менее 5 мм высотой.

Для определения муцина в испражнениях на поверхность предметного стекла нанести пипеткой одну каплю стерильного изотонического (0,85%) раствора хлорида натрия; бактериальной петлей внести в нее комочек испражнений с булавочную головку; хорошо гомогенизировать их и поднять петлю над поверхностью предметного стекла на 8-10 мм. Если муцин отсутствует, то тяж слизи не образуется; если присутствует, то образуется, свидетельствуя о воспалении слизистой.

Для определения наличия продуктов деструкции воспаленной слизистой в испражнениях их развести изотоническим раствором хлорида натрия в 10³ раз, тщательно гомогенизируя. Оставить пробирку стоять при комнатной температуре 5 минут для оседания твердых частиц. Если суспензия равномерно мутная без хлопьев - реакция отрицательная, слизистая недеструктурирована; если на фоне опалесцирующей суспензии клеток есть белые хлопья, слизистая разрушена - реакция положительная.

Таким образом, увеличение содержания слизи дезоксирибонуклеиновой кислоты в испражнениях свидетельствует об увеличении содержания грамотрицательных бактерий в них; появлению муцина - о воспалении слизистой кишечника; появление хлопьев - о деструкции воспаленной слизистой при дисбактериозе кишечника. Результаты этих трех тестов способствуют диагностированию дисбактериоза кишечника молодняка.

Способ иллюстрируется следующими примерами и таблицами 1 и 2 определения видов слизи в испражнениях молодняка в хозяйствах Свердловской области (ОПХ "Исток" и совхоз "Свердловский").

Проведенными исследованиями и испытаниями установлено, что различные виды слизи (ДНК, муцина и хлопья слизистой) отсутствуют в испражнениях здорового молодняка и присутствуют в разной степени в испражнениях больного дисбактериозом молодняка.

Способ по затратам времени и материалов в десятки раз экономически эффективнее бактериологического; экспрессен (занимает до 30 минут), доступен благодаря этому лечение дисбактериоза начинается значительно раньше. Способ испытывался на базе ОПХ "Исток" и в совхозе "Свердловский".

Способ предназначен для экспресс-определения и дифференциации видов слизи в испражнениях телят и поросят при диагностике дисбактериоза кишечника. Дифференцируют виды слизи: слизь дезоксирибонуклеиновой кислоты грамотрицательных бактерий, слизь муцинов воспалившейся слизистой оболочки кишечника и слизь разрушенной слизистой оболочки кишечника. Для этого пробы слизи смешивают с растворами гидроокиси калия или хлорида натрия. При образовании слизистого тяжа или хлопьев в результате смешивания с тем или иным реактивом судят о наличии того или иного вида слизи в образце. Способ позволяет сократить время диагностики дисбактериоза до 30 мин. 2 з.п. ф-лы, 2 табл.

1. Способ определения видов слизи в испражнениях, включающий смешивание образца испражнений с раствором химического вещества и последующую визуальную оценку наличия слизи в образце, отличающийся тем, что при определении слизи в испражнениях телят и поросят осуществляют дифференциацию видов слизи: слизь дезоксирибонуклеиновой кислоты грамотрицательных бактерий, слизь муцинов воспалившейся слизистой оболочки кишечника и слизь разрушенной слизистой оболочки кишечника, причем в качестве химического вещества используют раствор соединения щелочного металла, а визуальную оценку осуществляют после 50 - 60 с смешивания и при образовании слизистого тяжа или хлопьев делают заключение о наличии слизи в образце. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве раствора соединения щелочного металла используют 3%-ный раствор гидроокиси калия и при образовании слизистого тяжа делают заключение о наличии слизи дезоксирибонуклеиновой кислоты грамотрицательных бактерий в образце. 3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве раствора соединения щелочного металла используют 0,85%-ный раствор хлорида натрия и при образовании слизистого тяжа делают заключение о наличии слизи муцина в образце, а при образовании хлопьев делают заключение о наличии слизи разрушенной слизистой оболочки кишечника в образце.