НЕЙТРАЛЬНЫЕ ЛИПИДЫ ИЗ ЗЕРЕН КОИКСА NLKJ, СПОСОБ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ, ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ НА ИХ ОСНОВЕ, НЕЙТРАЛЬНЫЕ ЛИПИДЫ ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ В КАЧЕСТВЕ ЛЕКАРСТВЕННОГО СРЕДСТВА Российский патент 1998 года по МПК A61K35/78 A61K31/23 

Изобретение относится к нейтральным липидам с противоопухолевым действием, их извлечению и очистке и к фармацевтической композиции. Конкретнее изобретение относится к нейтральным липидам из зерен коикса, способам извлечения и очистки нейтральных липидов из зерен и к противоопухолевой эмульсии из нейтральных липидов из зерен коикса для инъекций или орального введения.

Зерно коикса представляет собой сухое зерно Coix lacryma-jobi. Оно используется в Китае в течение тысячелетий как в традиционной медицине, так и в питании.

В 1961 г. Pyunosin Okita и Akio Tanimura/Okita T. et. al., Chem. Phorm. Dull, 9 (1): 43, 1961) сообщили об извлечении коиксенолида как противоопухолевого элемента из зерна коикса и о результатах испытаний его противоопухолевой активности. Они также сообщают, что формула коиксенолида C₃₈H₇₀O₄, однако, не упоминают о его фармацевтических препаратах. Сообщается об ингибировании роста опухоли асцита Эрлиха (Ehtlich) у мышей. Коиксенолид экстрагируют по приведенной далее схеме.

Порошок зерна экстрагируют ацетоном 3 раза, экстракт растворяют в петролейном эфире, фильтруют и концентрируют, коричневый сироп растворяют в петролейном эфире, пропускают через колонку с силикагелем и элюируют петролейным эфиром, к элюату добавляют 0,2 N KOH, чтобы отделить кислотный элемент, нейтральное масло пропускают через колонку с оксидом алюминия и через колонку с диоксидом кремния, получают коиксенолид.

Коиксенолид получают в виде чистого соединения, показывающего сильную противоопухолевую активность. Но о его клинических испытаниях не сообщается. Поскольку для экстракции и очистки коиксенолида применяют колоночную хроматографию двух видов (на оксиде алюминия и на диоксиде кремния), производительность является очень низкой, и полученный таким путем коиксенолид является очень дорогим и не может быть коммерческим продуктом.

В 80-е годы Si Pei-hai получил сырое масло из зерна коикса непосредственно с помощью петролейного эфира и приготовил эмульсию для внутривенного введения (Si Pei-hai, The Extraction of the Oil of the Endosperm of Job's Tears and the Preparation of its Emulsion, Zhejiand Pharmacology, 3 (6): 18 - 20, 1986). Стадии извлечения и очистки масла эндосперма коикса приведены далее.

Порошок зерна коикса экстрагируют петролейным эфиром (3 раза), экстракт после поглощения, обесцвечивания и упаривания дает масло из эндосперма коикса.

Полученное масло имеет относительную плотность 0,9033 - 0,9057 (20^oC), показатель преломления (diopter) 1,4670 - 1,4708 (20^oC), иодное число 83 - 90 и кислотное число < 36. Эмульсия для внутривенного вливания содержит масло, извлеченное в соответствии с вышеупомянутым способом (в качестве основного компонента), и два эмульгатора - спан и твин. Состав эмульсии следующий:
Масло из зерна коикса - 10 г,
Спан-80 - 1 г,
Твин-80 - 1,5 г
Вода для инъекций - До 100 мл
Для исследования фармацевтического препарата и распределения его в теле используют эмульсию для введения прямо в опухоль. Для применения в клинике человека эмульсий для внутреннего введения существуют следующие препятствия:
1) Основной компонент - масло из зерна коикса - не является чистым и недостаточно безопасен, чтобы удовлетворять требованиям фармакопеи Китая, например, его кислотное число составляет менее 36.

2) Твин и спан могут проходить сквозь клеточную мембрану и являются лизоактивными и токсичными. Лизогенез предотвращается, если только используют изотоническую систему. И действительно, подавляющее большинство коммерческих продуктов - внутривенных эмульсий - в Англии, Германии, Соединенных Штатах, Франции, Китае и Японии не используют эмульгаторы, подобные твину и спану.

3) Вышеупомянутая композиция не включает такой существенный фактор, как изотоничность, и таким образом, неприемлема.

Цель изобретения состоит в том, чтобы предложить способ извлечения и очистки противоопухолевых нейтральных липидов из зерна коикса (NLKJ). Способ состоит из простых стадий, является недорогим, но позволяет получить стандартные нейтральные липиды, удовлетворяющие потребностям в препаратах для внутривенного применения.

Еще одна цель изобретения состоит в том, чтобы предложить фармацевтическую композицию, содержащую NLKJ, приготовляемую как эмульсия "масло-в-воде" в качестве противоопухолевого лекарственного препарата. Композиция является безопасной и приемлемой для орального, внутривенного и внутриартериального введения.

NLKJ, о котором идет речь в изобретении, представляет собой при комнатной температуре светло-желтую прозрачную жидкость, NLKJ легко растворяется в петролейном эфире, эфире и бензоле, способен растворяться в ацетоне, мало растворим в метаноле, спирте и не может растворяться в воде. Физико-химические константы NLKJ при испытаниях его в виде масла следующие: кислотное число < 0,20, иодное число 95,00 - 107,00, число омыления 185,00 - 195,00, относительная плотность 0,915 - 0,918 (20^oC), показатель преломления 1,470 - 1,475 (20^oC); NLKJ содержит,%: триглицерид 91,48 ± 3,43, диглицерид 1,47 ± 0,63, моноглицерид 5,75 ± 3,19 и сложный алкиловый эфир жирной кислоты 1,0 ± 0,78. Липолиз NLKJ приводит к получению гексадекановой, октодекановой, октадеценовой и октадекадиеновой кислоты.

Экстракцию и очистку NLKJ осуществляют так, как описано далее.

Экстракция органическим растворителем. Органический растворитель представляет собой, например, ацетон, петролейный эфир, эфир, спирт или гексан. Метод экстракции представляет собой, например, перколяцию, фильтрацию или просачивание через порошок зерна коикса. Сырое масло будет экстрагироваться с большим количеством посторонних веществ, например, свободных жирных кислот, пигментов.

Абсорбция и обесцвечивание. Используют обычный абсорбент, например, активный уголь, 3%-ную белую горшечную глину, 10%-ный оксил алюминия или другие абсорбенты. После абсорбирования сырого экстракта получается желтое масло.

Щелочное омыление. После добавления с целью омыления соответствующего количества щелочного раствора (например, NaOH или KOH) получают эмульсию.

Деэмульгирование ацетоном. Соответствующее количество ацетона будет возвращать эмульсии прозрачность.

Экстрагирование жидкости жидкостью. Экстрагируют соответствующим количеством второго растворителя, например, петролейного эфира, эфира или гексана, отстаивают, отбрасывают фазу, содержащую только ацетон /содержащую кислотный элемент, воду/, выпаривают органический растворитель, и в остатке остается только NLKJ настоящего изобретения.

Очистка. Между стадиями щелочного омыления и деэмульгирования ацетоном добавляют стадию промывания эмульсии горячей водой и/или, при необходимости, после экстракции жидкости жидкостью добавляют стадию обесцвечивания и/или промывания горячей водой. В таком случае получают NLKJ высокой чистоты, удовлетворяющий требованиям для внутривенного введения.

Эмульсия по изобретению представляет собой фармацевтическую композицию, содержащую NLKJ в качестве основного компонента, соевый /или яичный/ лецитин в качестве эмульгатора и достаточное количество воды. Она также содержит глицерин, сорбит или вещества подобного рода для придания изотоничности. Она может также содержать другие обычные противоопухолевые лекарства. Способ эмульгирования включает две обычные стадии - гомогенизации и диспергирования. Содержание NLKJ в фармацевтической композиции может изменяться в широких пределах. Она представляет собой эмульсию типа "масло в воде". В 100 мл эмульсии может содержаться 5 - 25 г NLKJ.

NLKJ и содержащие его фармацевтические композиции обладают высокой противоопухолевой активностью. Последние могут быть особенно пригодны в терапии рака легких, карциномы печени и других видов метастазирующего рака средней или поздней стадии. Возможно усиление иммунитета и защитных сил организма от многих заболеваний и, таким образом, эти вещества могут также применяться при заболеваниях, вызванных иммунными нарушениями. Сочетание эмульсии NLKJ с химиотерапией в небольших дозах может усилить протиоопухолевую активность и уменьшить токсичность химиотерапевтического воздействия.

Испытания противоопухолевой активности NLKJ и фармацевтической композиции на его основе по отношению к опухоли человека проиллюстрированы примерами 9 и 10. Влияние этой фармацевтической композиции на иммунитет, усиление воздействия при сочетании с небольшой дозой химиотерапии и защитное действие по отношению к снижению лейкоцитов, вызванному химиотерапией, соответственно проиллюстрированы в примерах 11, 12 и 13, и клиническое действие этой композиции описано в примере 14.

Соединения изобретения вводят в терапевтически эффективной дозе, т.е. в количестве, которое при введении млекопитающему, которому требуется лечение, является терапевтически достаточным для эффективного лечения опухолевых заболеваний. Введение активных соединений может быть осуществлено внутривенно, внутриартериально или орально.

На фиг. 1 проиллюстрировано действие NLKJ на пролиферацию лейкоза /Leukoemia/ P388, L 1210;
на фиг. 2 - действие NLKJ на образование клеточной колонии опухоли толстой кишки M 7609;
на фиг. 3 - терапевтическое действие эмульсии NLKJ на метастаз меланомы (B16) в легком in vivo (каждый третий день);
на фиг. 4 - терапевтическое действие эмульсии NLKJ на метастаз меланомы (B16) в легком in vivo (вв. каждый день);
на фиг. 5 - терапевтическое действие эмульсии NLKJ на метастаз меланомы (B16) в легком in vivo (вб, каждый день).

Пример 1. Экстракция и очистка NLKJ.

Экстрагируют ацетоном 100 кг порошка зерна коикса, после выпаривания ацетона, абсорбции и обесцвечивания получают 5 кг экстракта; для щелочного омыления добавляют 152 г NaOH (или соответствующее количество KOH) в виде 5%-ного горячего щелочного раствора, вес добавленной щелочи зависит от кислотного числа экстракта, высокая температура щелочного раствора ускоряет омыление и делает его более полным; разделенную эмульсию после отстаивания промывают 2-3 раза до тех пор, пока эмульсия не станет нейтральной (pH 6-7); добавляют ацетон 1: 1 (по объему) для деэмульгирования; после отстаивания экстрагируют ацетоновую фазу достаточным количеством петролейного эфира, отстаивают и ацетон отбрасывают; NLKJ остается в петролейном эфире, добавляют абсорбент для пигментов и пирогена; после фильтрации и выпаривания петролейного эфира получают нейтральное масло, которое кипятят в течение 0,5 ч с горячей дистиллированной водой при пониженном давлении, отстаивают и нагревают нейтральное масло до 100^oC, чтобы выпарить воду; снова добавляют абсорбент и отфильтровывают; получают 2 кг светло-желтого NLKJ, о котором идет речь в настоящем изобретении; и после стерилизации при 160^oC в течение 2 ч упаковывают его для приготовления эмульсий для внутривенного и орального введения.

Примеры 2-3. Составы NLKJ-эмульсии.

Композиции для орального применения, внутривенного и внутриартериального применения подробно пояснены в примерах 2 - 8.

Пример 2.

NLKJ - 10,0 г
Соевый лецитин для инъекций - 1,5 г
Глицерин для инъекций - 2,5 г
Вода для инъекций - g.s. до 100 мл
Эмульсия представляет собой эмульсию для орального, внутривенного или внутриартериального введения.

Пример 3.

NLKJ - 10,0 г
Лецитин для инъекций - 1,2 г
Глицерин для инъекций - 2,5 г
Вода для инъекций - g.s. до 100 мл
Эмульсия представляет собой эмульсию для внутреннего или внутриартериального введения.

Пример 4.

NLKJ - 15,0 г
Pluronic^F88 - 2,0 г
Глицерин - 2,5 г
Вода для инъекций - q•s до 100 мл
Дистиллированная вода - g.s. до 100 мл
Эмульсия является эмульсией для орального введения.

Пример 5.

NLKJ - 15,0 г
Соевый лецитин для инъекций - 2,0 г
Глицерин для инъекций - 2,5 г
Вода для инъекций - g.s. до 100 мл
Эмульсия является эмульсией для внутреннего или внутриартериального введения.

Пример 6.

NLKJ - 5,0 г
Фосфолипид - 0,75 г
Глицерин - 1,25 г
Дистиллированная вода - g.s. до 100 мл
Эмульсия является эмульсией для орального введения.

Пример 7.

NLKJ - 2,5 г
Фосфолипид - 2,5 г
Глицерин - 3,0
Дистиллированная вода - g.s. до 100 мл
Эмульсия является эмульсией для орального введения.

Пример 8.

NLKJ - 1000 г
Соевый лецитин для инъекций - 120 г
Глицерин для инъекций - 250 г
Вода для инъекций - g.s. до 10000 мл
Эмульсия является эмульсией для внутривенного или внутриартериального введения.

Пример 9. Противоопухолевая активность NLKJ in vitro.

(1) Осуществление NLKJ ингибирования пролиферации выращенных клеток лейкоза P388 и L 1210.

Методика
В 96-ячеичные микроплаты с выращенными лейкозными клетками, при удвоении, по 9 • 10⁵ клеток в каждой ячейке, добавляют 20 UlNLKJ с различной концентрацией, в контрольные ячейки добавляют по 20 Ul pps /фосфатно-солевой буферный раствор/, самая высокая концентрация NLKJ составляет 100 Ul /мд; клетки инкубируют в течение 48 ч при 37^oC в присутствии 5% CO₂; подсчитывают клетки счетчиком Coulter, и вычисляют степень ингибирования и концентрации лекарственного препарата, при которой происходит 50% ингибирование пролиферации колонии клеток опухоли (IC₅₀), как указано далее.

Степень ингибирования - ([(число контрольных клеток) - (число клеток после обработки)] /[(число контрольных клеток) - (число клеток в начале испытания)]) • 100%
Результаты
NLKJ обнаруживает явную противоопухолевую активность по отношению к клеткам лейкозы P388 и L1210 in vitro. Дозировка свыше 50 Ul /мл ингибирует пролиферацию клеток почти полностью. IC₅₀ NLKJ для клеток P388 и L1210 составляет 15,2 Ul/мл и 28,8 Ul/мл соответственно. Коэффициенты корреляции составляют 0,9136 и 0,9454 соответственно /фиг. 1 и табл. 1/.

(2) Испытания ингибирования образования колонии клеток опухоли толстой кишки M7609
Методика
В 3,8 мл среды PPMI 1640, содержащей 20% коровьей сыворотки, в круглой емкости для инкубирования клеток диаметром 4 см, добавляют 0,1 мл суспензии клеток опухоли толстой кишки (M7609) (2000/мл) в логарифмической стадии, полученных после переваривания 0,15% трипсина; после инкубирования клеток в течение 24 ч при 37^oC в присутствии 5% CO₂ добавляют в емкость 0,1 мл NLKJ различной концентрации; клетки инкубируют еще в течение 9 дней; после подкрашивания 0,1% раствором кристаллического фиолетового в спирте колонию подсчитывают, и вычисляют степень ингибирования образования колонии и IC₅₀.

Результаты
NLKJ заметно ингибирует образование колонии клеток опухоли толстой кишки M7609. Концентрация 50 Ul/мл полностью ингибирует образование колонии. IC₅₀ NLKJ для образования колонии клеток опухоли толстой кишки M7609 составляет 11,88 Ul/мл. Коэффициент корреляции составляет 0,9445 /фиг. 2, табл. 1/.

Пример 10. Терапевтическое действие эмульсии NLKJ на метастазирующую опухоль in vivo
(1) Терапевтическое действие эмульсии NLKJ на рост гепатомы человека (QCY) in vivo
Методика
Ткани буйно растущей гепатомы (QCY) гомогенизируют в физиологическом растворе /1:4/, готовят в виде суспензии, и вводят подкожно по 0,2 мл суспензии в подмышечную ямку каждой мыши, лишенной волосяного покрова; на другой день после инокулирования мышей наугад разбивают на группы, и вводят внутривенно в хвост мыши, лишенной волосяного покрова, дозы эмульсии NLKJ, составляющие 25 мл/кг, 12,5 мл/кг и 6,25 мл/кг, ежедневно в течение 10 дней; одной группе мышей вводят циклофосфамид /CTX/ при дозе 30 мг/кг, интраперитонеально, каждый день в течение 7 дней. Контрольной группе мышей вводят родственную эмульсию, в которой отсутствует только NLKJ /холостая эмульсия/ в дозе, составляющей 25 мл/кг, внутривенно в хвост каждой мыши, ежедневно в течение 10 дней. Через 30 дней после инокулирования собирают образцы опухолевых тканей у всех мышей, и взвешивают.

Результаты
Все дозы эмульсии NLKJ - 25 мл/кг, 12,5 мл/кг и 6,25 мл/к - показывают хорошее терапевтическое действие на рост гепатомы человека (QCY), и хорошую корреляцию соотношения доза-активность; самая высокая доза (25 мл/кг) дает почти такую же степень ингибирования, как при обработке CTX /табл. 2/.

(2) Терапевтическое действие эмульсии NLKJ на рост мелких клеток рака легкого человека (SPC) in vivo
Методика
Буйно растущие ткани опухоли SPC режут на кусочки по 2 мм, по одному кусочку инокулируют под кожу подмышечной ямки каждой мыши, лишенной волосяного покрова; на другой день после инокулирования мышей разделяют наугад на группы, и вводят эмульсию NLKJ при дозе 25 мл/кг ежедневно в течение 10 дней вв /внутривенно/, одной группе мышей вводят дакарбазин /дакарбазин, DTIC/, при дозе 40 мг/кг ежедневно в течение 10 дней внутривенно; контрольной группе мышей, лишенных волосяного покрова, вводят ежедневно в течение 10 дней холостую эмульсию при дозе 25 мл/кг. Через 30 дней после инокулирования отбирают образцы опухолевых тканей у всех мышей и взвешивают.

Результаты
Доза в 25 мл/кг NLKJ дает хорошее терапевтическое действие на мелкие клетки рака легкого человека. Степень ингибирования составляет 62,35% /табл. 3/.

(3) Терапевтическое действие эмульсии NLKJ на метастаз меланомы (B16) в легком in vivo
Методика
Ткани меланомы B16, растущие в логарифмической стадии, обрабатывают 0,15% трипсина; в хвост каждой мыши C57BL/6 инокулируют внутривенно 0,2 мл суспензии тканей, содержащей 2,5•10⁵ клеток в мл, в среде RPMI 1640; мышей наугад разбивают на группы через 3 дня после инокулирования и вводят разные дозы эмульсии; через 21 день после инокулирования мышей умерщвляют, подсчитывают колонии меланомы в легких мышей и вычисляют степень ингибирования, а также сравнивают действие на метастаз меланомы в легких различных доз и режимов введения эмульсии NLKJ, и таким же способом для сравнения вводят 100 мг/кг циклофосфамида (CTX).

Результаты. Действие различных доз и режимов введения на метастаз меланомы
(i) Все сочетания дозы (6,25 мл/кг, 12,5 мл/кг и 25 мл/кг) и периодичности введения (каждый третий день, 4 раза и внутривенно в хвост) эмульсии NLKJ показывают явное ингибирующее действие на метастаз меланомы B16 (табл. 4, фиг. 3).

(ii) Все сочетания дозы (6,25 мл/кг, 12,5 мл/кг и 25 мл/кг) и введения (каждый день, 7 раз и внутривенно в хвост) эмульсии NLKJ показывают явное действие на метастаз меланомы B16, см. также табл. 5 и фиг. 6.

(iii) Все сочетания дозы (6,25 мл/кг, 12,5 мл/кг и 25 мл/кг) и введения (каждый день, 7 раз и внутриперитонеально) эмульсии NLKJ также показывают явное ингибирующее действие на метастаз меланомы B16 (табл. 6, фиг. 5).

Пример 11. Усиление иммунитета у мышей при введении эмульсии NLKJ
(1) Индуцирование пролиферации лимфатических клеток селезенки мыши под действием эмульсии NLKJ in vivo.

Методика
Клетки селезенки получают асептически от мыши C57BL/6, плотность клеток регулируют средой RPMI-1640 до уровня 1 • 10⁷/мл: каждая клеточная ячейка содержит 100 мл среды, 100 мл лекарственного препарата и 50 мл ConA, причем упомянутый здесь лекарственный препарат представляет собой эмульсию NLKJ (4 концентрации), лентинанин (lentinanin) (4 концентрации), холостую эмульсию и воду; клетки инкубируют в течение 48 ч при 37^oC в присутствии 5% CO₂, и затем в ячейки добавляют ³H-Tdr (0,5 uci/ячейку), инкубируют еще в течение 20 ч; затем клетки собирают и измеряют величину CPM сцинтилляционным счетчиком для жидкости.

Результаты
Из табл. 7 можно видеть, что клетки, инкубированные как с NLKJ, так и с лентианином, дают более высокие значения CPM, т.е. как NLKJ, так и лентианин индуцируют пролиферацию лимфатических клеток селезенки мыши in vitro. Также показано корреляционное соотношение между дозой и величиной CPM.

(2) Влияние эмульсии NLKJ на активность естественных убийц клеток мыши in vitro.

Методика
В качестве эффективных клеток получают клетки селезенки от мыши C57BL/6 асептически, регулируют плотность клеток до 1 • 10⁶/мл, плотность нацеленных клеток - клеток YAC-1, регулируют до уровня 1 • 10⁴; две суспензии клеток смешивают в соотношении 1: 1 /по объему/, т.е. соотношение эффективных и вспомогательных клеток составляет 1: 1000; в ячейки добавляют ³H-Tdr (0,5 uci/ячейку); клетки инкубируют в течение 48 ч при 37^oC в присутствии 5% CO₂; затем клетки собирают и измеряют величину CPM сцинтилляционным счетчиком для жидкости; за активность естественных убийц клеток принимают степень специфического ингибирования (Pi), Pi эмульсии NLKJ сравнивают с Pi лентианина, холостой эмульсии и среды, которые берутся для контроля.

Pi - ([1-(величина CPM при обработке)]/(величина CPM контрольная)) • 100%
Результаты
Результаты показывают, что NLKJ симулирует активность естественных убийц клеток мыши in vitro, так же, как и лентианин /табл. 8/. Можно также отметить, что между дозой и величиной CPM существует обратное корреляционное соотношение.

(3) Действие эмульсии NLKJ на пролиферацию лимфатических клеток селезенки мыши, несущей опухоль, in vivo
Методика
Инокулируют подкожно в подмышечную ямку каждой мыши 1 • 10⁴ лейкозных клеток L 1210; на следующий день после инокулирования мышей наугад разделяют на 6 групп /10 мышей в группе/, и проводят 6 видов обработки: эмульсией NLKJ при дозах 6,25, 12,5 и 25 мл/кг, лентианином при дозе 10 мл/кг, холостой эмульсией и физиологическим раствором; после ежедневного введения в течение 7 дней мышей умерщвляют, регулируют плотность клеток, в клеточной суспензии, полученной асептически от мышей, на уровне 1 • 10⁷/мл, в каждую ячейку добавляют 100 Ul суспензии клеток и 100 Ul среды, дублируя в 3 ячейки, после инкубирования при 37^oC в течение 48 ч в присутствии 5% CO₂ добавляют 0,5 uci на ячейку ³H-Tdr, инкубируют еще в течение 20 ч и измеряют величину CPM, чтобы сравнить ее с данными для контрольных клеток.

Результаты
Из табл. 9 можно видеть, что эмульсия NLKJ может увеличивать пролиферацию лимфатических клеток селезенки мыши, переносящей лейкоз. Усиливающее действие эмульсии NLKJ на иммунитет мыши также увеличивается при увеличении дозы. Усиление иммунитета у мыши также наблюдается при обработке лентинанином.

(4) Действие эмульсии NLKJ на активность естественных убийц /NK/ клеток мыши, переносящей лейкоз, in vivo.

Методика
Каждой мыши в подмышечную ямку подкожно инокулируют 1 • 10⁴ лейкозных клеток L1210; на следующий день после инокулирования мышей делят наугад на 6 групп /10 мышей в группе/; осуществляют 6 видов обработки: 6,25, 12,5 и 25 мл/кг NLKJ, 10 мл/кг лентинанина, холостой эмульсией и физиологическим раствором; после 7-кратного ежедневного введения препаратов мышей умерщвляют, суспензию клеток селезенки, полученных асептически от мышей, регулируют до плотности клеток 1•10⁶/мл; в каждую ячейку добавляют 100 мл клеточной суспензии (эффективные клетки) и 100 мл YAC-клетки (клетки - мишень с плотностью клеток 1•10⁴) и 0,5 uci (ячейку ³H-Tdr, каждую обработку дублируют 3 ячейками; после инкубирования при 37^oC в присутствии 5% CO₂ в течение 48 ч, измеряют величину CPM собранных клеток; степень специфического ингибирования (Pi) принимают за активность естественных убийц клеток.

Pi = ([ l - (величина CPM испытуемой группы)]/(величина CPM контрольной группы)) • 100%.

Результаты
Табл. 10 показывает стимулирование эмульсией NLKJ и лентинанином активности естественных убийц клеток мыши, несущей лейкозные клетки, и указывает нативирование иммунитета у мышей.

(5) Влияние эмульсии NLKJ на индуцирование интердейкина-2 у мыши, переносящей лейкоз, in vivo
Методика
Каждой мыши в подмышечную ямку инокулируют подкожно 1 х 10-Е4 лейкозных клеток L1210; на следующий день после инокулирования мышей наугад разбивают на 6 групп /10 мышей в каждой группе/; осуществляют 6 обработок: 6,25 ,12,5 и 25 мл/кг NLKJ, 10 мл/кг лентинанина, эмульсией слепого опыта и физиологическим раствором; после 7-кратного ежедневного введения препаратов мышей умерщвляют; эмульсию клеток селезенки, полученных асептически из мышей, регулируют до плотности клеток 1 • 10⁷/мл; дублируют в 3 ячейки 2 мл суспензии клеток, содержащей 5 ug/мл ConA; после инкубирования при 37^oC в присутствии 5% CO₂ в течение 24 ч берут супернатант, измеряют активность интерлейкина-2 (IL-2-) с интерлейкином-2 в зависимости от клона клеток CTLL и метода введения 3H-Tdr.

Результаты
Табл. 11 показывает, что все виды обработки NLKJ стимулируют индуцирование интерлейкина-2 у мышей, несущих опухоль.

(6) Влияние эмульсии NLKJ на фагоцитозную активность фагоцитов мышей in vivo.

Методика
Швейцарских мышей разделяют наугад на две группы, одной группе интраперитонально вводят эмульсию NLKJ 7 раз ежедневно, другой группе вводят холостую эмульсию в таком же режиме; после последнего введения препарата интраперитонально вводят 0,5 мл гидролизованного лактальбумина, на следующий день таким же способом вводят 1 мл суспензии /2%/ куриных эритроцитов, 30 мин спустя швейцарских мышей умерщвляют, смещая шейные позвонки, фиксируют мышей мордой вверх, вскрывают брюшину, промывают брюшную полость 2 мл физиологического раствора в течение 1 мин, отбирают 1 мл воды и капают на поверхность стекла, инкубируют при 37^oC в течение 30 мин, сохраняя влагу; затем после высушивания клетки, фиксированные на стекле, смывают смесью ацетона с метанолом в соотношении и 1:1 (по объему), подкрашивают клетки 4% Giemsa-фосфатным буфером в течение 3 мин, промывают дистиллированной водой и сушат; подсчитывают фагоциты /свыше 100/ под микроскопом, процент фагоцитоза (PP) и индекс фагоцитоза (PI) рассчитывают следующим образом.

Процент фагоцитоза = [(число фагоцитов, фагоцитозирующих эритроциты)/(общее число фагоцитов)] • 100%;
Индекс фагоцитоза = [(число фагоцитозируемых эритроцитов)/(число фагоцитов)] • 100%.

Результаты
Из табл. 12 можно видеть, что NLKJ активирует фагоцитозную активность фагоцитов мышей.

Пример 12. Противоопухолевая активность эмульсии NLKJ в сочетании с небольшими дозами химиотерапии.

(1) Противоопухолевое терапевтическое действие на карциносаркому Валайера /Walaer/ твердую W256 in vivo
Методика
Асцит буйно растущих тканей карциносаркомы Валайера /твердой/ обрабатывают биологически, чтобы получить суспензию, клеточную суспензию регулируют до плотности клеток 1-2 • 10⁷ мл; 0,2 мл суспензии инокулируют под кожу каждой крысы в подмышечную ямку; на следующий день после инокулирования крыс наугад разделяют на группы, и вводят дозы эмульсии NLKJ, составляющие 20 мл/кг, 10 мл/кг и 5 мл/кг, вв •10 /каждый день/, дозы циклофосфамида составляют 30 мг/кг, вв • 7 /каждый день/, 10 мг/кг вв • 2 /в третий и в пятый день/; на 14 день после инокулирования отбирают образцы опухолевых тканей всех видов обработки, взвешивают и вычисляют степень ингибирования опухоли.

Результаты
Противоопухолевое терапевтическое действие эмульсии NLKJ на асцит карциносаркомы Валайера /твердой/ W 256 активируется небольшой дозой химиотерапевтического средства циклофосфамида /табл. 13/.

(2) Противоопухолевое терапевтическое действие на саркому (S-180)
Методика
Буйно растущие ткани саркомы (S-180) препарируют для получения клеточной суспензии с физиологическим раствором в соотношении 1:3 (вес/объем); мышей наугад разделяют на группы на другой день после инокулирования и вводят им эмульсию NLEJ при дозе 25 мл/кг, вв • 7 /каждый день/, циклофосфамид при дозе 30 мг/кг, вб /ип/ • 2 /во второй и четвертый день/, митоксантрон /DHAD/ при дозе 2 мг/кг, вб • 2 /во второй и четвертый день/, митомицин при дозе 1,5 мг/кг, вб • 2 /во второй и четвертый день/; на 14 день после инокулирования отбирают образец опухолевых тканей со всеми видами обработки и взвешивают, чтобы вычислить степень ингибирования.

Результаты
Результаты показывают, что противоопухолевое действие эмульсии MKJ на саркому активируется небольшими дозами циклофосфамида, DHAD и митомицина /табл. 14/.

Пример 13. Защитное действие эмульсии NLKJ против снижения числа лейкоцитов, вызванного химиотерапией
Методика
Разделяют произвольно 80 швейцарских мышей на 8 групп, которым вводят циклофосфамид при дозе 45 мг/кг, вб, • 3 /во второй, шестой и десятый день/, гаррингтонин /garringtonine/ /HRTN/ при дозе 1 мг/кг, вб • 3 /во второй, шестой и десятый день/, двум группам животных одновременно вводят эмульсию NLKJ в дозах 2,4 мл/кг и 6,25 мл/кг, вв • 7 /каждый день/; в начале испытаний и на четвертый день после каждого введения отбирают образцы крови из угла глаза каждой мыши и подсчитывают число лейкоцитов в крови.

Результаты
Табл. 15 и 16 показывают, что эмульсия NLKJ может защитить мышь от снижения числа лейкоцитов, вызванного химиотерапией, с применением либо циклофосфамида, либо гаррингтонина.

Пример 14. Клиническое терапевтическое действие эмульсии NLKJ
Методика
Эмульсию NLKJ вводят внутривенно или внутриартериально при лечении различных видов рака человека. Подробности методов лечения опускаются.

С 1992 года предварительное клиническое испытание противоопухолевой эмульсии, содержащей противоопухолевое вещество, экстрагированное и очищенное из натурального китайского коикса инъекции проводятся в ТСМ Госпитале провинции Шаюань. 151 пациент со злокачественными опухолями были произвольно распределены в группе (включая оральное введение, внутривенное вливание и артериальную перфузию и группу химиотерапии). Противораковое терапевтическое действие было изучено с целью наблюдения за токсичностью или побочными эффектами и безопасной эффективной дозировкой.

Результаты, показанные в дозе 200 мл/время или 2,5 мл/кг/время, используемой постоянно, не обнаруживают токсического или побочного эффектов. Также считается, что кратковременный лечебный эффект является вполне удовлетворительным. Инъекция может усилить иммунологическую функцию человека, защитить человеческие органы. Эффективная скорость вовлечения составляет 76,11% в группе с большой дозой (≥200 мл). Эффективная скорость вовлечения составляет 68,42% в группе артериальной перфузии и 50,98% в группе внутривенного вливания соответственно. Суммарная эффективная скорость вовлечения составляет 70% в двух группах и 49% в группе химиотерапии. Скорость ремиссии симптомов составляет 70% и скорость ремиссии боли возрастает до 91,1%.

Число пациентов со злокачественной опухолью, диагностированной гистопатологией, составило 151 случай, 103 мужчины и 48 женщины. Возрастной интервал составляет 27-81 год. Средний возраст составляет 55,73 года. Клиническая стадия: 23 случая в стадии II, 75 случаев в стадии III и 53 случая в стадии IV.

Клиническая группа: пациенты были произвольно разделены на четыре группы: группа орального введения (оральная группа для краткости), группа внутривенного вливания (внутривенная группа), группа артериальной перфузии (для краткости артериальная группа) и группа химиотерапии.

Оральная группа: 15 мужчин и 17 женщин - 32 пациента. 7 случаев с карциномой желудка, 8 случаев с раком легкого, 5 случаев с раком кишечника, 3 случая с раком печени, 3 случая мастокарциномы, 2 случая рака слизистой оболочки носоглотки, по одному случаю рака ларинокарциномы печеночного протока, рака шейки матки, злокачественной лимфомы.

Клиническая стадия: 13 случаев в стадии II: 13 случаев в стадии III и 6 случаев в стадии IV.

Внутривенная группа: 40 мужчин и 11 женщин - 51 пациент. 17 случаев рака печени, 4 случая рака кишечника, 12 случаев рака легкого, 6 случаев карциномы желудка, 2 случая рака пищевода, 2 случая последующей перитонеальной карциномы, 3 случая злокачественной лимфомы, 2 случая рака слизистой носоглотки и по одному случаю мастокарциномы, церебромы и рака яичника.

Клиническая стадия: 7 случаев стадии II, 24 случая стадии III и 20 случаев стадии IV.

Артериальная группа: 14 мужчин и 5 женщин - 19 пациентов. 11 случаев рака печени, 6 случаев рака легкого, 2 случая метастаз печени от рака кишечника.

Клиническая стадия: 3 случая стадия II, 14 случаев стадии III и 2 случая стадии IV.

Группа химиотерапии: 34 мужчины и 15 женщин - 49 пациентов. 26 случаев рака легкого, 14 случаев карциномы желудка, 9 случаев рака кишечника.

Клиническая стадия: 24 случая в стадии III и 25 случаев в стадии IV.

Сравнение базового состояния в четырех группах приведено в табл. 23.

Суммарно было 70 случаев во внутривенной группе и артериальной группе. Суммарная эффективная скорость вовлечения составляет 55,71%. 51 случай во внутривенной группе, эффективная скорость вовлечения составляет 50,98%; 19 случаев в артериальной группе, эффективная скорость вовлечения составляет 68,42% (включая некоторых пациентов с гидротораксом) (табл. 10). (Поскольку в клиническом исследовании изучали токсические и побочные эффекты и безопасно эффективную дозу главным образом, применение других терапевтических лекарств некоторыми пациентами строго контролировалось. Объективная оценка лечебных эффектов сделана только для справки).

Соотношение между различными дозами и терапевтической эффективностью
Результаты указывают, что эффективная скорость вовлечения в группе малых доз составляет 46,94% и 76,19% в группе с большой дозой. Имеется значительное различие между двумя группами (p<0,05). Лечебный эффект в группе с большой дозой выше (табл. 25).

Изобретение относится к области медицины и биотехнологии и касается нейтральных липидов из зерен Коикса (NLKJ), способа их получения, композиции на их основе нейтральных липидов для применения в качестве лекарственного средства. Задача изобретения заключается в разработке способа получения нейтральных липидов, обладающих высокой активностью и достаточной степенью частоты, пригодных для внутривенного применения, а также композиции на их основе, безопасной и применяемой для орального, внутривенного и внутриартериального введения. Сущность изобретения: нейтральные липиды, выделенные из зерен коикса, представляют собой триглицериды, диглицериды, моноглицериды и алкиловый сложный эфир жирной кислоты. Способ получения включает экстрагирование зерен коикса органическим растворителем, щелочное омыление, нейтрализацию полученной эмульсии ацетоном, деэмульгирование ацетоном и очистку ацетоновой фракции экстракцией целевого продукта органическим растворителем. Фармацевтическая композиция состоит из нейтральных липидов в количестве 2,5-25 г и фармацевтических, приемлемых добавок и обладает противоопухолевым и иммуностимулирующим действиями. Технический результат заключается в получении нейтральных липидов, удовлетворяющих потребности в препаратах для внутривенного применения. Разработанный способ является простым, недорогим и позволяет получить стандартные нейтральные липиды. Сочетание полученных липидов с некоторыми химиотерапевтическими препаратами позволяет уменьшить токсичность химиотерапевтического воздействия. 4 с. и 5 з.п.ф-лы, 25 табл., 5 ил.

1. Нейтральные липиды, выделенные из зерен коикса Coix Lacryma jobi (NL KJ) экстракцией органическим растворителем, щелочным омылением и очисткой, отличающиеся тем, что они представляют собой фракцию нейтральных липидов, содержащую, %:
Триглицериды - 91,48±3,43
Диглицериды - 1,47±0,63
Моноглицериды - 5,75±3,19
Алкиловый сложный эфир жирной кислоты - 1,00±0,78
и полученную деэмульгированием эмульсии, нейтрализованной после щелочного омыления ацетоном и экстрагирования органическим растворителем. 2. NLKJ по п.1, отличающиеся тем, что имеют следующие физико-химические свойства: кислотное число менее 0,2, иодное число 95,00-107,00, число омыления 185,00-195,00, относительная плотность 0,915-0,918 (20^oC) и коэффициент преломления 1,470-1,475 (20^oC) и липолиз указанных NLKJ приводит к гексадекановой, октадекановой, октадеценовой, октадекадиеновой кислотам. 3. Способ получения нейтральных липидов NLKJ по п.1, включающий экстрагирование зерен коикса органическим растворителем, щелочное омыление и очистку, отличающийся тем, что после щелочного омыления проводят деэмульгирование нейтрализованной эмульсии ацетоном, а очистку ацетоновой фракции осуществляют экстракцией целевого продукта органическим растворителем. 4. Способ по п. 3, отличающийся тем, что органический растворитель на стадии экстрагирования представляет собой ацетон или петролейный эфир. 5. Фармацевтическая композиция, обладающая противоопухолевым и иммуностимулирующим действиями, включающая биологически активное вещество, выделенное из зерен коикса (Coix Lacryma jobi (NLKJ) экстракцией органическим растворителем, щелочным омылением и очисткой, отличающаяся тем, что она содержит биологически активное вещество, представляющее фракцию нейтральных липидов, содержащую, %:
Триглицериды - 91,48±3,43
Диглицериды - 1,47±0,63
Моноглицериды - 5,75±3,19
Алкиловый сложный эфир жирной кислоты - 1,00±0,78
и полученную деэмульгированием эмульсии, нейтрализованной после щелочного омыления ацетоном и экстрагирования органическим растворителем, в количестве 2,5-25 г и фармацевтически приемлемые добавки. 6. Композиция по п.5, отличающаяся тем, что в качестве добавок используют эмульгатор и/или изоосмотический раствор. 7. Композиция по п.5, отличающаяся тем, что указанная композиция содержит:
NLKJ - 2,5-25 г
Соевый или яичный лецитин - 0,3-3,0 г
Глицерин - 1,25-6,0 г
Дистиллированная вода - До 100 мл
8. Композиция по любому из пп.5-7, отличающаяся тем, что дополнительно включает циклофосфамид, митоксантрон, митомицин или харрингтонин. 9. Средство, обладающее противоопухолевым и иммуностимулирующим действием, включающее биологически активное вещество, выделенное из зерен коикса (Coix Lacryma jobi (NLKJ) экстракцией органическим растворителем, щелочным омылением и очисткой, и вспомогательные вещества, отличающееся тем, что биологически активное вещество представляет фракцию нейтральных липидов, содержащую, %:
Триглицериды - 91,48±3,43
Диглицериды - 1,47±0,63
Моноглицериды - 5,75±3,19
Алкиловый сложный эфир жирной кислоты - 1,00±0,78
и полученную деэмульгированием эмульсии, нейтрализованной после щелочного омыления ацетоном и экстрагирования органическим растворителем, в количестве 2,5-25 г.

Приоритет по пунктам:
16.09.92 по пп.1 и 2, 5-9;
17.09.92 по пп. 3 и 4.