МАЛЕАТ ЭФИРНОГО ПРОИЗВОДНОГО НИКОТИНИЛОВОГО СПИРТА, ЕГО КРИСТАЛЛИЧЕСКАЯ ФОРМА И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ Российский патент 2024 года по МПК C07D405/14 A61K31/44 A61P35/00 A61P31/04 A61P31/12 A61P37/02 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к области медицины и раскрывает малеат эфирного производного никотинилового спирта, его кристаллическую форму и применение, то есть изопропил (S)-N-(2-(пиридин-3-илметокси)-4-(2-бром-3-фенилбензилокси)-5-хлорбензил)серинат малеат, способ его получения, его кристаллическая форма, фармацевтическая композиция и применение. В частности, настоящее изобретение относится к изопропил (S)-N-(2-(пиридин-3-илметокси)-4-(2-бром-3-фенилбензилокси)-5-хлорбензил)серинат малеату, представленному формулой I, его стереоизомеру, способу его получения, его кристаллической форме, композиции, содержащей соединение или его кристаллическую форму, и применению соединения в получении лекарственного средства для лечении или профилактики заболеваний, связанных с сигнальным путем PD-1/PD-L1, таких как рак, инфекционные заболевания, аутоиммунные заболевания и тому подобное.

Уровень техники

При углубленном изучении опухолевого иммунитета было обнаружено, что микроокружение опухоли может защитить опухолевые клетки от распознавания и гибели под действием иммунной системы. Ускользание опухолевых клеток от иммунного ответа играет очень важную роль в возникновении и развитии опухоли. В 2013 году журнал Science назвал иммунотерапию опухолей как первую из десяти лучших прорывов, вновь сделав иммунотерапию «фокусом» в области лечения опухолей. Активация или ингибирование иммунных клеток регулируется положительными и отрицательными сигналами. Белок программируемой смерти клеток 1 (PD-1)/лиганд PD-1 (PD-L1) представляет собой отрицательный иммунорегуляторный сигнал, который ингибирует иммунную активность опухолеспецифичных CD8+ Т-клеток и опосредует ускользание от иммунного ответа.

Способность опухолевых клеток ускользать от иммунной системы осуществляется путем связывания лиганда программируемой смерти клеток (PD-L1), продуцируемого на их поверхности, с белком PD-1 Т-клеток. Микроокружение опухоли в организме индуцирует высокую экспрессию молекул PD-1 в инфильтрирующих Т-клетках, и опухолевые клетки высоко экспрессируют PD-1-лиганды PD-L1 и PD-L2, что приводит к непрерывной активации пути PD-1 в микроокружении опухоли, и функция Т-клеток ингибируется, и опухоль не может быть обнаружена, так что они не могут послать иммунной системе приказ атаковать опухоль и убить опухолевые клетки. PD-1 антитело представляет собой белок-антитело против PD-1 или PD-L1, и оно может ингибировать связывание между PD-1 и PD-L1 и блокировать путь, частично восстанавливать функцию Т-клеток и позволять этим клеткам продолжать убивать опухолевые клетки.

Недавно ряд неожиданных исследований подтвердил, что антитело, ингибирующее PD1/PD-L1, обладает сильной противоопухолевой активностью в отношении различных опухолей, что является особенно привлекательным. 4 сентября 2014 года Keytruda® (пембролизумаб) от Merck, США, стал первым одобренным FDA моноклональным антителом к PD-1 для лечения пациентов с прогрессирующей или неоперабельной меланомой, которые не ответили на лечение другими препаратами. В настоящее время MSD исследует потенциал Keytruda в лечении более чем 30 различных типов рака, включая различные виды рака крови, рак легкого, рак молочной железы, рак мочевого пузыря, рак желудка, рак головы и шеи. 22 декабря 2014 г. фармацевтический гигант Bristol Myers Squibb оправдал свои ожидания и стал лидером в ускоренном получении одобрения Управления по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных средств США (FDA). Принадлежащее им противораковое иммунотерапевтическое средство ниволумаб был внесен в список под торговым названием Opdivo для лечения пациентов с неоперабельной или метастатической меланомой, которые не ответили на другие лекарственные средства, и оно является вторым ингибитором PD-1, зарегистрированным в США, после Keytruda от MSD. 4 марта 2015 г. FDA одобрило ниволумаб для лечения метастатического плоскоклеточного немелкоклеточного рака легкого с прогрессированием заболевания во время или после химиотерапии на основе препаратов платины. Согласно исследованию фазы Ib KEYNOTE-028 по лечению солидных опухолей Keytruda (пембролизумаб), опубликованному MSD, лечение Keytruda достигло 28% общей частоты ответа (ORR) у 25 пациентов с мезотелиомой плевры (PM), и 48% пациентов имеют стабильное состояние, и частота контроля заболевания достигла 76%. Пациенты с прогрессирующей лимфомой Ходжкина (HL), у которых не было ответа на лечение на любое из одобренных лекарственных средств, смогли достичь полной ремиссии после лечения с Keytruda от MSD и Opdvio от Bristol-Myers. На ежегодном собрании AACR в 2015 году, Leisha A. Emens, MD, PhD, доцент онкологии в Johns Hopkins Kimmel Cancer Center, сообщила, что PD-L1 моноклональное антитело MPLL3280A от Roche имеет длительный терапевтический эффект при распространенном трижды негативном раке молочной железы.

Хотя иммунотерапия опухолей считается революцией в лечении рака после таргетной терапии, лекарственное средство на основе моноклонального антитела имеет свои недостатки: оно легко расщепляется протеазами, поэтому является нестабильным в организме и не может приниматься перорально; легко продуцирует иммунную перекрестную реакцию; качество препарата нелегко контролировать, и технология производства является сложной; получения и очистка большого количества затруднены, и стоимость высокая; оно неудобно в применении, и его можно только вводить инъекционно или капельно. Поэтому низкомолекулярные ингибиторы PD-1/PD-L1 взаимодействия являются лучшим выбором для иммунотерапии опухоли.

В международной заявке PCT/CN2017/085418 авторы изобретения описали изопропил(S)-N-[2-(пиридинил-3-метокси)-4-(2-бром-3-(фенил)бензилокси)-5-хлорбензил] серинат гидрохлорид и его применение в получении лекарственного средства для профилактики или лечения заболеваний, связанных с сигнальным путем PD-1/PD-L1, таких как рак, инфекционные заболевания, аутоиммунные заболевания и тому подобное. В более поздних исследованиях авторы изобретения обнаружили, что малеат соединения обладает большей стабильностью и эффективностью по сравнению с его гидрохлоридом. Гидрохлорид Примера 1 настоящего изобретения получают в полном соответствии со способом получения в международной заявке на патент PCT/CN2017/085418, в качестве сравнительного примера.

Содержание изобретения

Технической задачей, решаемой настоящим изобретением, является предоставление изопропил (S)-N-(2-(пиридин-3-илметокси)-4-(2-бром-3-фенилбензилокси)-5-хлорбензил)серинат малеата со структурной формулой (I), которое ингибирует взаимодействие PD-1/PD-L1, и его стереоизомера, и способа его получения, его фармацевтической композиции, и их применения в получении лекарственного средства для профилактики или лечения заболеваний, связанных с сигнальным путем PD-1/PD-L1.

Для решения технической проблемы настоящего изобретения настоящее изобретение представляет следующее техническое решение:

Первым аспектом технического решения настоящего изобретения является обеспечение изопропил (S)-N-(2-(пиридин-3-илметокси)-4-(2-бром-3-фенилбензилокси)-5-хлорбензил)серинат малеата, представленного формулой (I), и его стереоизомера,

Второй аспект технического решения по настоящему изобретению обеспечивает кристаллическую форму А твердого вещества изопропил (S)-N-(2-(пиридин-3-илметокси)-4-(2-бром-3-фенилбензилокси)-5-хлорбензил)серинат малеата, где, когда используют анализ рентгеновской порошковой дифрактометрии и экспериментальные условия излучения Cu, положение дифракционного пика: значение 2-тета (°) или значение d (Å) и относительная интенсивность (%) дифракционного пика имеют следующие характеристики:

Пик 2-тета
±0,2° d(Å)
±0,2 Å интенсивность%
±5% Пик 2-тета
±0,2° d(Å)
±0,2 Å интенсивность %
±5% 1 4,5 19,6 42,3 22 21,6 4,1 35,5 2 5,6 15,9 50,1 23 22,2 4,0 15 3 6,8 13,0 14,0 24 22,7 3,9 33,6 4 8,5 10,4 16,2 25 23,1 3,9 50,5 5 9,1 9,8 100 26 23,9 3,7 42 6 10,2 8,7 28,1 27 25,0 3,6 16,4 7 12,4 7,1 11,1 28 25,4 3,5 19,2 8 13,3 6,7 18,6 29 26,6 3,4 28 9 13,6 6,5 35,6 30 28,0 3,2 13,9 10 14,6 6,1 12,1 31 28,4 3,1 15,9 11 15,5 5,7 15 32 29,3 3,1 19,1 12 16,0 5,5 11 33 29,9 3,0 14,2 13 16,6 5,3 13,6 34 30,4 2,9 14,4 14 17,1 5,2 14,2 35 31,0 2,9 15,7 15 17,4 5,1 13,8 36 31,6 2,8 15,6 16 17,9 4,9 17,4 37 32,7 2,7 12,2 17 18,7 4,7 17,6 38 34,0 2,6 12,7 18 19,0 4,7 20,1 39 34,9 2,6 11,9 19 19,7 4,5 35,5 40 35,7 2,5 13,4 20 20,0 4,4 46,6 41 39,0 2,3 11,2 21 20,7 4,3 58,3

Кристаллическая форма А твердого вещества, как описано выше, где при анализе методом ИК-спектрометрии, пики поглощения при 3059, 2984, 2841, 2761, 2519, 2170, 1988, 1968, 1807, 1741, 1716, 1623, 1602, 1580, 1505, 1481, 1460, 1446, 1425, 1401, 1389, 1368, 1309, 1262, 1242, 1205, 1171, 1111, 1095, 1069, 1040, 1004, 972, 953, 924, 884, 870, 864, 854, 824, 788, 761, 721, 703, 662 см^-1 ± 2 см^-1 представляют собой положения характеристических пиков инфракрасного спектра, представленного кристаллической формой А твердого вещества.

Кристаллическая форма А твердого вещества, как описано выше, где при анализе методом дифференциальной сканирующей калориметрии в спектре DSC присутствует эндотермический пик при 175°С±3°С при скорости нагревания 10°С в минуту.

Второй аспект технического решения по настоящему изобретению также обеспечивает смешанное кристаллическое твердое вещество изопропил (S)-N-(2-(пиридин-3-илметокси)-4-(2-бром-3-фенилбензилокси)-5-хлорбензил)серинат малеата, где оно содержит любую часть, отличную от нуля, кристаллической формы А твердого вещества изопропил (S)-N-(2-(пиридин-3-илметокси)-4-(2-бром-3-фенилбензилокси)-5-хлорбензил)серинат малеата.

Третий аспект технического решения настоящего изобретения обеспечивает способ получения соединения по первому аспекту и кристаллической формы А твердого вещества по второму аспекту:

Способ получения соединения формулы (I) представляет собой:

взаимодействие изопропил (S)-N-(2-(пиридин-3-илметокси)-4-(2-бром-3-фенилбензилокси)-5-хлорбензил)серината с малеиновой кислотой с образованием соли в растворителе, наиболее предпочтительно растворителем является изопропиловый спирт, тетрагидрофуран или ацетон;

кристаллизацию полученного изопропил (S)-N-(2-(пиридин-3-илметокси)-4-(2-бром-3-фенилбензилокси)-5-хлорбензил)серинат малеата в смешанном растворителе из ацетона и воды, соотношение ацетона и воды составляет от 200:1 до 1:1, предпочтительно соотношение составляет от 50:1 до 5:1, наиболее предпочтительно соотношение составляет от 25:1 до 10:1. В процессе получения соединения формулы (I) и его сольватов и солей могут образовываться поликристаллы при различных условиях кристаллизации.

Четвертый аспект технического решения настоящего изобретения обеспечивает фармацевтическую композицию, содержащую изопропил (S)-N-(2-(пиридин-3-илметокси)-4-(2-бром-3-фенилбензилокси)-5-хлорбензил)серинат малеат по первому аспекту настоящего изобретения и его стереоизомер или кристаллическую форму А твердого вещества по второму аспекту в качестве активного ингредиента, и фармацевтически приемлемый носитель или эксципиент.

Настоящее изобретение дополнительно относится к фармацевтической композиции, содержащей соединение по настоящему изобретению в качестве активного ингредиента. Фармацевтическая композиция может быть получена способами, хорошо известными в данной области. Любые лекарственные формы, подходящие для применения человеку или животному, могут быть получены путем объединения соединения по настоящему изобретению с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми твердыми или жидкими эксципиентами и/или адъювантами. Содержание соединения по настоящему изобретению в его фармацевтической композиции обычно составляет от 0,1% до 95% масс.

Соединение по настоящему изобретению или фармацевтическую композицию, содержащую его, можно вводить в стандартной лекарственной форме, путь введения может быть энтеральным или парентеральным, например, пероральное, внутривенное введение, внутримышечное введение, подкожное введение, назально, через слизистую оболочку ротовой полости, глазное введение, через легкие и дыхательные пути, через кожу, вагинально, ректально и тому подобное.

Лекарственная форма для введения может быть жидкой лекарственной формой, твердой лекарственной формой или полутвердой лекарственной формой. Жидкие лекарственные формы могут быть растворами (включая истинный раствор и коллоидный раствор), эмульсиями (включая тип масло/вода, вода/масло и двойную эмульсию), суспензией, инъекцией (включая воду для инъекций, порошок для инъекции и инфузию), глазными каплями, назальными каплями, лосьонами, настойками и тому подобное; твердыми лекарственными формами могут быть таблетки (включая обычные таблетки, энтеросолюбильные таблетки, таблетки для рассасывания, диспергируемые таблетки, жевательные таблетки, шипучие таблетки, таблетки, диспергируемые в полости рта), капсулы (включая твердые капсулы, мягкие капсулы, кишечнорастворимые капсулы), гранулы, порошки, пеллеты, каплевидные таблетки, суппозитории, пленки, пластыри, газовые (порошковые) спреи, спреи и тому подобное; полутвердыми лекарственными формами могут быть мази, гели, пасты и тому подобное.

Соединения по настоящему изобретению можно формулировать в виде обычных препаратов, а также препаратов с замедленным высвобождением, препаратов с контролируемым высвобождением, нацеленных препаратов и различных систем доставки на основе микрочастиц.

Для получения таблеток соединения по настоящему изобретению можно широко использовать различные эксципиенты, известные в данной области, включая разбавители, связующие вещества, смачивающие агенты, дезинтегрирующие агенты, смазывающие вещества и скользящие вещества. Разбавителем может быть крахмал, декстрин, сахароза, глюкоза, лактоза, маннит, сорбит, ксилит, микрокристаллическая целлюлоза, сульфат кальция, гидрофосфат кальция, карбонат кальция и тому подобное; смачивающим агентом может быть вода, этанол или изопропанол и тому подобное; связующим может быть крахмальный сироп, декстрин, сироп, мед, раствор глюкозы, микрокристаллическая целлюлоза, смола акации, желатин, натрийкарбоксиметилцеллюлоза, метилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза, этилцеллюлоза, акриловая смола, карбомер, поливинилпирролидон, полиэтиленгликоль и тому подобное; дезинтегрирующими агентами могут быть сухой крахмал, микрокристаллическая целлюлоза, низкозамещенная гидроксипропилцеллюлоза, сшитый поливинилпирролидон, кроскармеллоза натрия, натрий карбоксиметилкрахмал, гидрокарбонат натрия и лимонная кислота, сложный эфир полиоксиэтиленсорбитана и жирной кислоты, додецилсульфонат натрия и тому подобное; смазывающим веществом и скользящим веществом могут быть тальк, кремнезем, стеарат, винная кислота, жидкий парафин, полиэтиленгликоль и тому подобное.

Таблетки также могут быть кроме того сформулированы в таблетки, покрытые оболочкой, такие как таблетки, покрытые сахарной оболочкой, таблетки, покрытые пленочной оболочкой, таблетки, покрытые кишечнорастворимой оболочкой, или двухслойные таблетки и многослойные таблетки.

Для получения стандртной лекарственной формы в виде капсулы, соединение по настоящему изобретению в качестве активного ингредиента может быть смешано с разбавителем и скользящим веществом, и затем смесь может быть непосредственно помещена в твердую капсулу или мягкую капсулу. Соединение по настоящему изобретению в качестве активного ингредиента также может быть получено в виде гранулы или пилюли с разбавителем, связующим веществом, дезинтегрирующими агентами и затем помещено в твердую капсулу или мягкую капсулу. Различные разбавители, связующие вещества, смачивающие агенты, дезинтегрирующие агенты и скользящие агенты для получения таблеток соединения по настоящему изобретению также могут быть использованы для получения капсул соединения по настоящему изобретению.

Для получения соединения по настоящему изобретению в виде инъекционной формы в качестве растворителя можно использовать воду, этанол, изопропанол, пропиленгликоль или их смесь, и кроме того, может быть добавлено соответствующее количество солюбилизирующего агента, сорастворителя, агента, регулирующего рН, и агента, регулирующего осмотическое давление, которые обычно используются в данной области. Солюбилизирующий агент или сорастворитель может представлять собой полоксамер, лецитин, гидроксипропил-β-циклодекстрин и тому подобное; агент, регулирующий рН, может представлять фосфат, ацетат, хлористоводородную кислоту, гидроксид натрия и тому подобное; агент, регулирующий осмотическое давление, может представлять хлорид натрия, маннит, глюкозу, фосфат, ацетат и тому подобное. Для получения лиофилизированного порошка для инъекций в качестве наполнителя также могут быть добавлены маннит, глюкоза и тому подобное.

Кроме того, красители, консерванты, отдушки, ароматизаторы или другие добавки также могут быть добавлены к фармацевтическим препаратам при необходимости.

Для достижения цели лечения и усиления терапевтического эффекта лекарственное средство или фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно вводить любым известным способом введения.

Доза введения соединения или фармацевтической композиции по настоящему изобретению может варьироваться в широком диапазоне в зависимости от характера и тяжести заболеваний, которые необходимо предотвратить или лечить, индивидуального состояния пациента или животного, способа введения и лекарственной формы и тому подобное. В общем, подходящая суточная доза соединения по изобретению будет составлять от 0,001 до 150 мг/кг массы тела, предпочтительно от 0,01 до 100 мг/кг массы тела. Указанные дозы могут вводиться в однократных единицах дозирования или в разделенных единицах дозирования в зависимости от клинического опыта врача и режима введения доз, включая использование других терапевтических средств.

Соединение или композицию по настоящему изобретению можно вводить самостоятельно или в комбинации с другими терапевтическими или симптоматическими лекарственными средствами. Когда соединение по настоящему изобретению обладает синергическим эффектом с другими терапевтическими средствами, то его дозировку следует корректировать в соответствии с реальной ситуацией.

Пятый аспект технического решения настоящего изобретения обеспечивает применение изопропил (S)-N-(2-(пиридин-3-илметокси)-4-(2-бром-3-фенилбензилокси)-5-хлорбензил)серинат малеата и его стереоизомера или кристаллической формы А твердого вещества по второму аспекту для получения лекарственного средства для профилактики и/или лечения заболеваний, связанных с сигнальным путем PD-1/PD-L1.

Заболевания, связанные с сигнальным путем PD-1/PD-L1, выбраны из группы, состоящей из рака, инфекционных заболеваний и аутоиммунных заболеваний. Рак выбран из группы, состоящей из рака кожи, рака легкого, опухоли мочеполовой системы, гематологической опухоли, рака молочной железы, глиомы, опухоли органов пищеварительной системы, опухоли органов репродуктивной системы, лимфомы, опухоли нервной системы, опухоли головного мозга, рака головы и шеи. Инфекционные заболевания выбраны из группы, состоящей из бактериальной инфекции и вирусной инфекции. Аутоиммунные заболевания выбраны из группы, состоящей из органоспецифических аутоиммунных заболеваний, системных аутоиммунных заболеваний, где органоспецифические аутоиммунные заболевания включают хронический лимфоцитарный тиреоидит, гипертиреоз, инсулинозависимый сахарный диабет, миастению гравис, язвенный колит, злокачественную анемию с хроническим атрофическим гастритом, геморрагический легочно-почечный синдром, первичный билиарный цирроз, рассеянный склероз, острый идиопатический полиневрит. И системные аутоиммунные заболевания включают ревматоидный артрит, системную красную волчанку, системный васкулит, склеродермию, пемфигус, дерматомиозит, смешанное заболевание соединительной ткани, аутоиммунную гемолитическую анемию.

ПОЛЕЗНЫЕ ТЕХНИЧЕСКИЕ ЭФФЕКТЫ:

По сравнению с изопропил (S)-N-(2-(пиридин-3-илметокси)-4-(2-бром-3-фенилбензилокси)-5-хлорбензил)серинат гидрохлоридом, соединение изопропил (S)-N-(2-(пиридин-3-илметокси)-4-(2-бром-3-фенилбензилокси)-5-хлорбензил)серинат малеат по настоящему изобретению имеет стабильную кристаллическую форму, хорошую устойчивость к световому излучению, высокой влажности и высокой температуре окружающей среды, а также обладает высокой степенью ингибирования опухолей в отношении различных типов опухолей на модели мышей с подкожной трансплантацией опухоли или модели мыши, несущей опухоль NSG, реконструированной иммунной системой человека.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ РИСУНКОВ

Фиг.1. Спектр дифференциальной сканирующей калориметрии/термогравиметрического анализа соединения примера 1.

Фиг.2. Спектр дифференциальной сканирующей калориметрии/термогравиметрического анализа соединения примера 2.

Фиг.3. Порошковая рентгеновская дифрактограмма соединения примера 2.

КОНКРЕТНЫЕ СПОСОБЫ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение будет дополнительно описано ниже в сочетании с конкретными примерами, но объем настоящего изобретения не ограничен.

Измерительные приборы: Сверхпроводящий спектрометр ядерного магнитного резонанса Bruker AVANCE III 500 с высоким разрешением использовали для ядерной магнитно-резонансной спектроскопии. Систему QSTAR Elite LC/MS/MS использовали для масс-спектрометрии. Для элементного анализа использовали элементный анализатор FLASH1112 и прибор MX-5 millionth Balance. Для УФ-анализа использовался спектрофотометр Shimadzu UV-2700 UV-Vis. Американский поляриметр PE Model 343 использовали для определения удельного вращения. Рентгеновский дифрактометр D8-Advance использовали для анализа с использованием рентгеновской порошковой дифрактометрии. Термоанализатор Swiss Mettler TGA/DSC3⁺ использовали для сканирующей калориметрии/термогравиметрического анализа (DSC/TG).

1. Получение соли:

Пример 1: изопропил (S)-N-[2-(пиридин-3-илметокси)-4-(2-бром-3-(фенил)бензилокси)-5-хлорбензил] серинат гидрохлорид (Пример является сравнительным примером, в котором соединение является известным соединением, и способ его получения точно такой же, как в примере 6 международной заявки PCT/CN2017/085418)

598 мг (S)-N-[2-(пиридин-3-илметокси)-4-(2-бром-3-(фенил)бензилокси)-5-хлорбензил] серина и 60 мл безводного изопропанола помещали в 100 мл круглодонную колбу, 6 мл сульфоксид хлорида и 2 капли DMF добавляли при перемешивании на бане с ледяной водой. Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов, нагревали и кипятили с обратным холодильником до завершения реакции. Растворитель удаляли при пониженном давлении с получением изопропил (S)-N-[2-(пиридин-3-илметокси)-4-(2-бром-3-(фенил)бензилокси)-5-хлорбензил] серинат гидрохлорида, в виде белого твердого вещества. ¹H ЯМР (400 MГц, DMSO-d₆) δ 9,62 (с, 1H, -HCl), 9,40 (с, 1H, -HCl), 9,10 (с, 1H, -ArH), 8,86 (д, 1H, -ArH), 8,59 (д, J=7,6 Гц, 1H, -ArH), 8,01-7,91 (м, 1H, -ArH), 7,73-7,64 (м, 2H, -ArH), 7,57-7,46 (м, 3H, -ArH), 7,46-7,37 (м, 4H, -ArH), 7,16 (с, 1H, -ArH), 5,47 (с, 2H, -CH₂-), 5,36 (с, 2H, -CH₂-), 4,92 (м, 1H, -CH-), 4,30-4,15 (м, 2H, -CH₂-), 4,05 (с, 1H, -CH-), 3,97 (дд, J=12,0, 3,0 Гц, 1H, -CH₂-), 3,84 (дд, J=12,0, 3,8 Гц, 1H, -CH₂-), 1,20 (д, J=6,4Гц, 3H, -CH₃), 1,18 (д, J=6,4 Гц, 3H, -CH₃). MS (FAB): 640 (M).

Пример 2: Изопропил (S)-N-(2-(пиридин-3-илметокси)-4-(2-бром-3-фенилбензилокси)-5-хлорбензил)серинат малеат (IMMH-010)

При комнатной температуре изопропил (S)-N-[2-(пиридин-3-илметокси)-4-(2-бром-3-(фенил)бензилокси)-5-хлорбензил] серинат (2,6 г) и изопропанол (9 мл) добавляли в реакционную колбу 50 мл. Смесь нагревали до 40°С, перемешивали в течение 0,5 ч и по каплям добавляли раствор малеиновой кислоты (0,594 г) в изопропаноле (4 мл). Температуру поддерживали на уровне 35 ~ 45°С и твердое вещество осаждалось, затем смесь перемешивали при этой температуре в течение 0,5 ч, охлаждали естественным путем до комнатной температуры и перемешивали в течение ночи. На следующий день смесь фильтровали отсасыванием, и фильтрпрессную лепешку промывали 0,5 мл изопропанола и 0,5 мл ацетона последовательно для получения светло-желтого твердого вещества, которое представляет собой неочищенный продукт изопропил (S)-N-(2-(пиридин-3-илметокси)-4-(2-бром-3-фенилбензилокси)-5-хлорбензил)серинат малеата. При комнатной температуре неочищенный продукт и ацетон (26 мл) добавляли в реакционную колбу 50 мл, нагревали до температуры кипения с обратным холодильником и добавляли по каплям 1,4 мл очищенной воды. После полного растворения смесь подвергали термической фильтрации. После фильтрации осадок на фильтре переносили в реакционную колбу 50 мл, охлаждали естественным путем до комнатной температуры и перемешивали для кристаллизации в течение ночи. На следующий день смесь охлаждали до 5-15°С, перемешивали в течение 2 ч и фильтровали отсасыванием. Фильтрпрессную лепешку промывали 0,5 мл ацетона, и подвергают принудительной сушке на воздухе до постоянной массы при температуре 45°С для получения чистого продукта (0,73 г), в виде белого твердого вещества.

2. Определение структуры соединения примера 2:

1) Элементный анализ:

(1) Измерительный прибор: элементный анализатор FLASH1112 и millionth balance MX-5.

(2) Метод определения: углерод, водород и азот измеряли дважды параллельно.

(3) Результаты измерений:

Таблица данных элементного анализа соединения примера 2

Содержание (%) C H N Теоретическое значение (%) 57,19 4,80 3,71 Измеренное значение (%) 57,10 4,80 3,63 57,21 4,78 3,59 Среднее значение (%) 57,16 4,79 3,61 Абсолютная погрешность (%) 0,03 0,01 0,1

2) Масс-спектрометрия с высоким разрешением:

(1) Измерительный прибор: система QSTAR Elite LC/MS/MS

(2) Условия тестирования: источник ESI

(3) Результат измерений:

Данные масс-спектрометрии с высоким разрешением соединения примера 2

Измеренное значение (m/z) [M+H]⁺ 639,1259 Теоретическое значение (m/z) [M+H]⁺ 639,1256 Ошибка (х10^-6) 0,49 Молекулярный состав пика молекулярного иона C₃₂H₃₃N₂O₅ClBr Молекулярная формула C₃₂H₃₂N₂O₅ClBr

3) УФ-спектр поглощения:

(1) Измерительный прибор: спектрофотометр Shimadzu UV-2700 UV-Vis

(2) Метод определения: образец получали в виде раствора в определенной концентрации, ту же партию растворителя использовали в качестве холостого контроля, и абсорбционную ячейку 1 см использовали для измерения значения поглощения в диапазоне 190 ~ 400 нм.

Растворитель: вода - метанол (1:1), 0,1 моль/л хлористоводородной кислоты - метанола (1:1), 0,1 моль/л гидроксида натрия - метанола (1:1)

Концентрация анализируемого раствора: 20 мкл/мл.

(3) Результат измерений:

Таблица УФ-данных соединения примера 2

IMMH-010 λ _max (нм) Значение поглощения Назначение спектральной полосы метанол-вода
(1:1) 206,50 2,567 Поглощение в K-диапазоне 237,50 0,622 285,30 0,116 0,1 моль/л хлористоводородной кислоты - метанола
(1:1) 206,60 2,464 237,50 0,621 285,40 0,147 0,1 моль/л гидроксида натрия - метанола (1:1) 227,60 0,550 285,70 0,042

4) Инфракрасный спектр поглощения:

(1) Измерительный прибор: инфракрасный спектрометр British PE (Spectrum 400)

(2) Условия тестирования: инфракрасная спектроскопия нарушенного полного внутреннего отражения (НПВО), непосредственный впрыск порошка

Таблица данных в ИК-спектре соединения примера 2

пик поглощения (см^-1) Тип колебания Группа Интенсивность 3059 =C-H валентные колебания Ароматическое кольцо, алкен w 2984, 2840 C-H валентные колебания Метил, метилен w 1716 C=O валентные колебания Карбоксил (малеат) w 1741 C=O валентные колебания Эфирная связь m 1623 C=C валентные колебания Алкеновая связь (малеат) m 1600,1580,1505,
1446 C=C валентные колебания Ароматическое кольцо s 1368,1389,1460 C-H деформационные колебания изопропил s 703, 761, 788 =C-H неплоские девиационные колебания Ароматическое кольцо s

5) Спектр водорода и спектр углерода ядерного магнитного резонанса:

(1) Измерительный прибор: Сверхпроводящий спектрометр ядерного магнитного резонанса Bruker AVANCE III 500 с высоким разрешением

(2) Условия тестирования: растворитель представлял собой DMSO-d6, внутренний стандарт представлял собой TMS

Данные ¹H-ЯМР соединения примера 2

No химический сдвиг (ppm) мультиплетность спектральных линий J (Гц) Число протонов 1 8,72 д 1,7 1 2 8,56 дд 4,8, 1,7 1 3 7,92 м \ 1 4 7,64 дд 7,7, 1,7 1 5 7,55 с \ 1 6 7,51 т 7,6 1 7 7,49-7,46 м \ 1 8 7,46-7,44 м \ 1 9 7,44-7,42 м \ 1 10 7,42-7,40 м \ 1 11 7,40-7,38 м \ 2 12 7,38-7,36 м \ 1 13 7,14 с \ 1 14 6,05 с \ 2 15 5,48 шир.с \ 1 17 5,34 с \ 2 18 5,29 с \ 2 19 4,86 п 6,3 1 20 4,10 с \ 2 21 3,87-3,73 м \ 3 22 1,16 дд \ 6

Данные ¹³С-ЯМР соединения примера 2

No химический сдвиг (ppm) Количество атомов углерода Тип углерода Функциональная группа 1 167,69 1 4° Сложноэфирная группа 2 167,12 2 4° карбоксил 3 156,60 1 4° Ароматическое углеродное кольцо 4 154,76 1 4° Ароматическое углеродное кольцо 5 149,33 1 3° Ароматическое углеродное кольцо 6 148,97 1 3° Ароматическое углеродное кольцо 7 143,10 1 4° Ароматическое углеродное кольцо 8 140,76 1 4° Ароматическое углеродное кольцо 9 136,16 1 4° Ароматическое углеродное кольцо 10 135,68 1 3° Ароматическое углеродное кольцо 11 135,24 2 3° Алкеновая связь 12 132,51 1 3° Ароматическое углеродное кольцо 13 132,00 1 4° Ароматическое углеродное кольцо 14 131,27 1 3° Ароматическое углеродное кольцо 15 129,25 2 3° Ароматическое углеродное кольцо 16 129,10 1 3° Ароматическое углеродное кольцо 17 128,20 2 3° Ароматическое углеродное кольцо 18 127,84 1 3° Ароматическое углеродное кольцо 19 127,78 1 3° Ароматическое углеродное кольцо 20 123,63 1 3° Ароматическое углеродное кольцо 21 123,06 1 4° Ароматическое углеродное кольцо 22 112,90 1 4° Ароматическое углеродное кольцо 23 100,19 1 3° Ароматическое углеродное кольцо 24 71,08 1 2° метилен 25 69,66 1 3° метин 26 68,16 1 2° метилен 27 60,47 1 3° метин 28 59,50 1 2° метилен 29 43,34 1 2° метилен 30 21,40 1 1° метил 31 21,34 1 1° метил

6) Удельное вращение:

(1) Измерительный прибор: Американский поляриметр PE Model 343.

(2) Метод определения: продукт по настоящему изобретению точно взвешивали, растворяли в DMSO и количественно разбавляли для получения раствора, содержащего примерно 50 мг на 1 мл, и определяли удельное вращение.

(3) Температура испытания: 20°С

(4) Результаты

С DMSO в качестве растворителя и концентрации определения 50 мг/мл удельное вращение соединения примера 2 составило +5,5°. [α] ²⁰₅₈₉=+5,5° (C=5, DMSO)

3. Анализ кристаллической формы соединения примера 2

1) Анализ с использованием рентгеновской порошковой дифрактометрии:

(1) Измерительный прибор: Рентгеновский дифрактометр D8-Advance

(2) Условия тестирования: рабочее напряжение: 40 кВ, рабочий ток: 40 мА, материал мишени Cu. Скорость сканирования: 0,02 градуса/шаг, время выдержки: 0,1 секунды/шаг.

(3) Результаты испытаний (см. фиг. 3):

Таблица данных порошковой рентгеновской дифракции соединения примера 2

Интенсивность
% Угол
2-тета Интенсивность
Cont Значение d
ангстрем 42,3 4,509 1707 19,58167 50,1 5,565 2020 15,86828 14,0 6,785 567 13,01670 16,2 8,481 653 10,41733 100,0 9,054 4033 9,75969 28,1 10,206 1133 8,66043 11,1 12,392 449 7,13700 18,6 13,285 749 6,65934 35,6 13,620 1435 6,49629 12,1 14,550 486 6,08317 15,0 15,497 603 5,71323 11,0 15,984 442 5,54049 13,6 16,574 550 5,34433 14,2 17,119 573 5,17560 13,8 17,401 558 5,09221 17,4 17,929 703 4,94346 17,6 18,697 711 4,74221 20,1 18,963 809 4,67625 35,5 19,650 1432 4,51412 46,6 20,037 1880 4,42785 58,3 20,655 2351 4,29674 35,5 21,556 1433 4,11923 15,0 22,174 604 4,00580 33,6 22,706 1356 3,91306 50,5 23,110 2036 3,84561 42,0 23,863 1692 3,72585 16,4 24,974 660 3,56261 19,2 25,356 774 3,50974 28,0 26,594 1127 3,34912 13,9 27,986 560 3,18567 15,9 28,414 641 3,13867 19,1 29,261 772 3,04971 14,2 29,872 574 2,98871 14,4 30,398 581 2,93813 15,7 30,948 634 2,88721 15,6 31,580 631 2,83082 12,2 32,673 493 2,73853 12,7 33,988 512 2,63555 11,9 34,858 480 2,57176 13,4 35,712 539 2,51218 11,2 39,004 453 2,30741

(4) Анализ: анализ с использованием рентгеновской порошковой дифрактометрии показал, что соединение примера 2 представляло собой кристаллическое вещество.

2) Дифференциальная сканирующая калориметрия/термогравиметрический анализ (DSC/TG):

(1) Измерительный прибор: Термоанализатор Swiss Mettler TGA/DSC3 ⁺

(2) Установка значений параметров: начальная температура: 35°С; температура окончания: 250°С; скорость нагрева: 10°С/мин.

(3) Результат измерений: DSC: пиковая температура: 174,68°С (эндотермическая).

TGA: потеря массы началась примерно при 170°С, и потеря массы была очевидна при 175°С.

(4) Анализ: DSC показала наличие эндотермического пика при 174,68°С, который должен быть вызван теплом, поглощенным при плавлении соединения примера 2. TGA показал, что термогравиметрическая кривая практически не изменилась до 160°С, и не было потери массы, что свидетельствует об отсутствии в составе соединения примера 2 растворителя для кристаллизации. Когда температура поднялась до вершины эндотермического пика DSC (примерно 175°С), стала очевидна потеря массы, которая была вызвана разложением образца при плавлении. Эндотермический пик DSC представлял собой точку разложения соединения примера 2.

4. Сравнение стабильности соединения примера 1 и соединения примера 2

1) Стабильность соединения примера 1

(1) Физические и химические свойства

Внешний вид: не совсем белый порошок

Температура плавления: 119,36°С (способ DSC) (см. фиг. 1)

Чистота: 99,5% (метод нормализации ВЭЖХ)

log P=2,4

(2) Тест на фактор, оказывающий влияние

Внешний вид Температура плавления
(способ DSC, °C) Чистота
(%) Сопутствующие примеси
(%) Исходный не совсем белый порошок 119,36 99,5 0,5 60°С, 5 дней не совсем белый порошок 118,69 99,5 0,5 относительная влажность 92,5%, 5 дней бесцветная вязкая жидкость - 99,5 0,5 Освещение, 5 дней прозрачное сыпучее вещество - 96,0 4,0

Соединение примера 1 не показало очевидных изменений во внешнем виде, температуре плавления и содержании примесей после выдержки при высокой температуре 60°C в течение 5 дней, что указывает на то, что оно было стабильным в условиях высокой температуры. После пребывания в условиях высокой влажности 92,5% в течение 5 дней соединение продемонстрировало серьезное поглощение влаги, бесцветную вязкую жидкость на вид и отсутствие изменений в сопутствующих примесях. Соединение имело прозрачный объемный вид в условиях освещения, а содержание примесей в нем увеличивалось до 4,0%, что указывает на то, что оно нестабильно в условиях освещения.

2) Стабильность соединения примера 2

(1) Физические и химические свойства

Внешний вид: белое твердое вещество

Температура плавления: 174,68°C (способ DSC) (см. фиг.2)

Чистота: 98,7% (метод нормализации ВЭЖХ)

log P=3,2

(2) Тест на фактор, оказывающий влияние

внешний вид Температура плавления
(способ DSC, °С) Хиральные примеси
(%) Чистота
(%) сопутствующие примеси
(%) Исходный белый порошок 174,68 0,2 98,7 1,3 60°С, 10 дней белый порошок 174,64 0,2 98,7 1,3 относительная влажность 92,5%, 10 дней белый порошок 174,57 0,2 98,7 1,3 Освещение, 10 дней белый порошок 174,60 0,2 98,6 1,4

Соединение Примера 2 было стабильным в условиях освещения, высокой температуры и высокой влажности.

5. Сравнение противоопухолевого эффекта соединения примера 1 и соединения примера 2 на мышиную меланому B16F10 in vivo

Цель эксперимента:

Противоопухолевые эффкты in vivo соединения примера 1 и соединения примера 2 в качестве ингибиторов PD-L1 на мышиную меланому B16F10 оценивали на модели подкожно трансплантированной опухоли мышей.

Экспериментальный раствор:

Распределение животных по группам: экспериментальных животных разделяли на группу контроля растворителем, группу циклофосфамида 80 мг/кг (CTX), группу 5 мг/кг и группу 10 мг/кг соединения примера 1 и соединения примера 2, соответственно.

Стадии эксперимента: субкультивированный опухолевой штамм B16F10 измельчали в гомогенизаторе, дважды промывали стерильным физиологическим раствором и подсчитывали, и концентрацию клеток в суспензии опухолевых клеток доводили физиологическим раствором до 9×10⁶/мл. 0,2 мл клеточной суспензии инокулировали в правую подмышечную впадину мышей C57BL/6J, и день регистрировали как день 0. На следующий день после инокуляции животных случайным образом делили на группы, взвешивали и осуществляли введение. Мышам в контрольной группе растворителем перорально вводили 0,5% CMC каждый день. Циклофосфан вводили внутрибрюшинно. Тестируемые соединения вводили перорально один раз в день. Животных взвешивали и умерщвляли во время лечения. Опухолевые ткани отделяли, взвешивали и фотографировали. В заключение, рассчитывали степени ингибирования опухоли для оценки интенсивности противоопухолевого эффекта.

Расчетный и статистический метод: степень ингибирования пролиферации опухоли TGI (%): TGI= (1-T/C) ×100. (T: масса опухоли в группе лечения; C: масса опухоли в группе отрицательного контроля).

Статистический метод: Для статистического анализа данных использовали Graphpad и использовали однофакторный дисперсионный анализ, ^*P <0,05, ^**P <0,01, ^***P< 0,001.

Результаты экспериментов:

После введения животных умерщвляли и опухоли взвешивали. Противоопухолевые эффекты соединения примера 1 и соединения примера 2 на мышиную меланому B16F10 показаны в таблице ниже.

Противоопухолевый эффект in vivo соединения примера 2 на B16F10 мыши

Группы Доза
(мг/кг) Количество
(начало/ конец) Масса тела (г) X ±SD Масса опухоли (г) Начало Конец X ±SD TGI% Группа контроля растворителем 10/10 17,32±0,46 21,0±0,7 2,32±0,85 NA Группа CTX 80×1 10/10 16,94±0,43 19,2±0,8 0,23±0,18^*** 90 Группа соединения примера 2 5×14 10/10 17,09±0,81 20,0±1,2 1,39±0,84^* 40 10×14 10/10 17,15±0,50 20,1±1,0 1,04±0,66^** 55 Примечание: по сравнению с группой контроля растворителем, *P<0,05, **P <0,01, ***P <0,001, однофакторный дисперсионный анализ
NA: не определено

Противоопухолевый эффект in vivo соединения примера 1 на B16F10 мыши

Группы Доза
(мг/кг) Количество
(начало/ конец) Масса тела (г) X ±SD Масса опухоли (г) Начало Конец X ±SD TGI% Группа контроля растворителем 7/7 17,1±0,9 18,8±1,1 3,49±0,91 NA Группа CTX 80×1 7/7 16,9±0,8 17,5±0,9 1,00±0,34^*** 70 Группа соединения примера 1 5×14 7/7 17,7±1,1 20,1±1,5 3,11±0,98^* 11 10×14 7/7 18,8±1,4 21,0±1,8 3,04±0,94^** 13 Примечание: по сравнению с группой контроля растворителем, *P<0,05, **P <0,01, ***P <0,001, однофакторный дисперсионный анализ
NA: не определено

6. Сравнение противоопухолевых эффектов соединения примера 1 и соединения примера 2 в отношении рака толстой кишки мыши MC38 in vivo

Цель эксперимента:

Противоопухолевые эффекты in vivo соединения примера 1 и соединения примера 2 в качестве ингибиторов PD-L1 в отношении рака толстой кишки мыши MC38 оценивали на модели подкожно трансплантированной опухоли мышей.

Экспериментальный раствор:

Распределение животных по группам: экспериментальных животных разделяли на группу контроля растворителем, группу циклофосфамида 80 мг/кг (CTX), группу 5 мг/кг и группу 10 мг/кг соединения примера 1 и соединения примера 2, соответственно.

Стадии эксперимента: субкультивированный опухолевой штамм MC38 измельчали в гомогенизаторе, дважды промывали стерильным физиологическим раствором и подсчитывали, и концентрацию клеток в суспензии опухолевых клеток доводили физиологическим раствором до 9×10⁶/мл, 0,2 мл клеточной суспензии инокулировали в правую подмышечную впадину мышей C57BL/6J, и день регистрировали как день 0. На следующий день после инокуляции животных случайным образом делили на группы, взвешивали и осуществляли введение. Мышам в контрольной группе растворителем перорально вводили 0,5% CMC каждый день. Циклофосфан вводили внутрибрюшинно. Тестируемые соединения вводили перорально один раз в день. Животных взвешивали и умерщвляли во время лечения. Опухолевые ткани отделяли, взвешивали и фотографировали. В заключение, рассчитывали степени ингибирования опухоли для оценки интенсивности противоопухолевого эффекта.

Расчетный и статистический метод: степень ингибирования пролиферации опухоли TGI (%): TGI=(1-T/C) × 100. (T: масса опухоли в группе лечения; C: масса опухоли в группе отрицательного контроля).

Статистический метод: Для статистического анализа данных использовали Graphpad и использовали однофакторный дисперсионный анализ, *P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001.

Результаты экспериментов:

После введения животных умерщвляли и опухоли взвешивали. Противоопухолевые эффекты соединения примера 1 и соединения примера 2 в отношении рака толстой кишки мыши MC38 показаны в таблице ниже.

Противоопухолевый эффект соединения примера 2 в отношении рака толстой кишки мыши MC38

Группы Доза
(мг/кг) Количество
(начало/ конец) Масса тела (г) X ±SD Масса опухоли (г) Начало Конец X ±SD TGI% Группа контроля растворителем 10/10 22,0±0,4 26,1±1,3 1,70±0,75 NA Группа CTX 40×2 10/10 22,0±0,8 24,5±0,9 0,17±0,10^** 90 Группа соединения примера 2 2,5×14 10/10 22,0±0,6 25,3±2,3 1,13±0,78 34 5×14 10/10 21,9±0,8 23,7±1,8 0,42±0,39^*** 75 10×14 10/10 21,9±0,7 25,0±1,7 0,73±0,54^** 57 Примечание: по сравнению с группой контроля растворителем, *p<0,05、**p<0,01、*** p<0,001, однофакторный дисперсионный анализ
NA: не определено

Противоопухолевый эффект соединения примера 1 в отношении рака толстой кишки мыши MC38

Группы Доза
(мг/кг) Количество
(начало/ конец) Масса тела (г) X ±SD Масса опухоли (г) Начало Конец X ±SD TGI% Группа контроля растворителем 7/7 18,6±0,3 24,1±0,8 3,94±0,78 NA Группа CTX 40×1 6/6 18,8±0,9 21,7±1,4 1,30±1,44^** 67 Группа соединения примера 1 5×14 5/6 18,7±0,4 23,4±1,2 3,21±0,28^*** 18 10 ×14 5/6 18,5±0,6 23,8±1,4 2,86±1,36^** 27 Примечание: по сравнению с группой контроля растворителем, *p<0,05、**p<0,01、*** p<0,001, однофакторный дисперсионный анализ
NA: не определено

7. Сравнение противоопухолевых эффектов соединения примера 1 и соединения примера 2 на модели рака легкого человека NCI-H460

Цель эксперимента:

Противоопухолевые эффекты in vivo соединения примера 1 и соединения примера 2 в качестве ингибиторов PD-L1 оценивали на модели рака легких человека NCI-H460 у мышей, несущей опухоль NSG, реконструированной иммунной системой человека.

Экспериментальный раствор:

Распределение животных по группам: экспериментальных животных разделяли на группу контроля растворителем, группу циклофосфамида 80 мг/кг (CTX), группу 5 мг/кг и группу 10 мг/кг соединения примера 1 и соединения примера 2, соответственно.

Стадии эксперимента: РВМС получали выделением свежих лейкоцитов человека, затем инокулировали мышам NSG через хвостовую вену, и каждой мыши вводили 1х10⁷. На третий день в подмышечную впадину мышей инокулировали опухолевые клетки NCI-H460 и каждой мыши инокулировали 1×10⁶. После роста опухолей до 100~300 мм³ мышам осуществляли введение по группам. Мышам в контрольной группе растворителем перорально вводили 0,5% CMC каждый день. Циклофосфан вводили внутрибрюшинно. Тестируемые соединения вводили перорально один раз в день. Животных взвешивали и умерщвляли во время лечения. Опухолевые ткани отделяли, взвешивали и фотографировали. В заключение, рассчитывали степени ингибирования опухоли для оценки интенсивности противоопухолевого эффекта.

Расчетный и статистический метод: степень ингибирования пролиферации опухоли TGI (%): TGI=(1-T/C) × 100. (T: масса опухоли в группе лечения; C: масса опухоли в группе отрицательного контроля).

Статистический метод: Для статистического анализа данных использовали Graphpad и использовали однофакторный дисперсионный анализ, * P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001.

Результаты экспериментов:

После введения животных умерщвляли и опухоли взвешивали. Противоопухолевые эффекты соединения примера 1 и соединения примера 2 в отношении NCI-H460 показаны в таблице ниже.

Противоопухолевый эффект соединения примера 1 и соединения примера 2 в отношении NCI-H460

Группы Доза
(мг/кг) Количество
(Начало /Конец) Объем опухоли X ±SD Масса опухоли (г) День 1 День 20 X ±SD TGI% Группа контроля растворителем 5/5 180,4±13,0 2129,9±362,7 2,73±0,60 NA Группа CTX 100×1 5/5 165,4±22,4 556,5±81,1 0,90±0,15^*** 66,9 Группа соединения примера 2 15×14 5/5 166,5±24,5 1405,2±442,9 1,90±0,0,37 30,6 Группа соединения примера 1 15×14 5/5 161,9±21,0 1441,4±337,6 2,06±0,22 24,7 Примечание: по сравнению с группой контроля растворителем, *p<0,05、**p<0,01、*** p<0,001, однофакторный дисперсионный анализ
NA: не определено

Таким образом, результаты эксперимента показали, что:

В модели подкожно трансплантированной опухоли штамма мышиной, высокометастатической меланомой B16F10, степень ингибирования опухоли соединением примера 2 при ежедневных пероральных дозах 5 мг/кг и 10 мг/кг составляла 40% и 55%, соответственно, в то время как степени ингибирования опухоли соединением примера 1 при тех же дозировках составляли 11% и 13%, соответственно.

В модели подкожно трансплантированной опухоли рака толстой кишки мыши MC38 степени ингибирования опухоли соединением примера 2 при ежедневных пероральных дозах 5 мг/кг и 10 мг/кг составляли 75% и 57%, соответственно, в то время как степени ингибирования опухоли соединением примера 1 при тех же дозировках составляли 18% и 27%, соответственно.

У мышей, несущих опухоль NSG, с реконструированной иммунной системой человека, степень ингибирования опухоли соединением примера 2 при ежедневной пероральной дозе 15 мг/кг была лучше, чем у соединения примера 1 (степень ингибирования опухоли: 30,6% vs. 24,7%).

Модель опухоли Сравнение степени ингибирования опухоли при одинаковой дозировке B16F10 Соединение примера 2 (малеат) > Соединение примера 1 (гидрохлорид) MC38 Соединение примера 2 (малеат) > Соединение примера 1 (гидрохлорид) NSG NCI-H460 Соединение примера 2 (малеат) > Соединение примера 1 (гидрохлорид)

Настоящее изобретение относится к изопропил (S)-N-(2-(пиридин-3-илметокси)-4-(2-бром-3-фенилбензилокси)-5-хлорбензил)серинат малеату, представленному формулой (I), а также к его кристаллической форме А, дифракционные пики которой приведены в формуле изобретения. Способ получения изопропил (S)-N-(2-(пиридин-3-илметокси)-4-(2-бром-3-фенилбензилокси)-5-хлорбензил)серинат малеата или его кристаллической формы А по изобретению, осуществляют путем взаимодействия изопропил (S)-N-(2-(пиридин-3-илметокси)-4-(2-бром-3-фенилбензилокси)-5-хлорбензил)серината с малеиновой кислотой в растворителе с образованием соли; затем проводят кристаллизацию полученного изопропил (S)-N-(2-(пиридин-3-илметокси)-4-(2-бром-3-фенилбензилокси)-5-хлорбензил)серинат малеата в смешанном растворителе из ацетона и воды, где соотношение ацетона и воды составляет от 25:1 до 10:1. Также изобретение относится к фармацевтической композиции для профилактики и/или лечения заболеваний, связанных с сигнальным путем PD-1/PD-L1, содержащей изопропил (S)-N-(2-(пиридин-3-илметокси)-4-(2-бром-3-фенилбензилокси)-5-хлорбензил)серинат малеат или его кристаллическую форму А по изобретению, в качестве активного ингредиента, и его фармацевтически приемлемый носитель или эксципиент. Технический результат - изопропил (S)-N-(2-(пиридин-3-илметокси)-4-(2-бром-3-фенилбензилокси)-5-хлорбензил)серинат малеат, имеющий стабильную кристаллическую форму, хорошую устойчивость к световому излучению, высокой влажности и высокой температуре окружающей среды, а также предназначенный для применения при получении лекарственного средства для профилактики и/или лечения заболеваний, связанных с сигнальным путем PD-1/PD-L1. 5 н. и 4 з.п. ф-лы, 3 ил., 16 табл., 2 пр.

1. Изопропил (S)-N-(2-(пиридин-3-илметокси)-4-(2-бром-3-фенилбензилокси)-5-хлорбензил)серинат малеат, представленный формулой (I)

2. Кристаллическая форма А твердого вещества изопропил (S)-N-(2-(пиридин-3-илметокси)-4-(2-бром-3-фенилбензилокси)-5-хлорбензил)серинат малеата, характеризующаяся тем, что при использовании анализа рентгеновской порошковой дифрактометрии и экспериментальных условий Cu-излучения, положение дифракционного пика: значение 2-тета (º) или значение d () и относительная интенсивность (%) дифракционного пика имеют следующие характеристики:

Пик 2-тета
±0,2º d()
±0,2 Интенсивность%
±5% Пик 2-тета
±0,2º d()
±0,2 Интенсивность %
±5% 1 4,5 19,6 42,3 22 21,6 4,1 35,5 2 5,6 15,9 50,1 23 22,2 4,0 15 3 6,8 13,0 14,0 24 22,7 3,9 33,6 4 8,5 10,4 16,2 25 23,1 3,9 50,5 5 9,1 9,8 100 26 23,9 3,7 42 6 10,2 8,7 28,1 27 25,0 3,6 16,4 7 12,4 7,1 11,1 28 25,4 3,5 19,2 8 13,3 6,7 18,6 29 26,6 3,4 28 9 13,6 6,5 35,6 30 28,0 3,2 13,9 10 14,6 6,1 12,1 31 28,4 3,1 15,9 11 15,5 5,7 15 32 29,3 3,1 19,1 12 16,0 5,5 11 33 29,9 3,0 14,2 13 16,6 5,3 13,6 34 30,4 2,9 14,4 14 17,1 5,2 14,2 35 31,0 2,9 15,7 15 17,4 5,1 13,8 36 31,6 2,8 15,6 16 17,9 4,9 17,4 37 32,7 2,7 12,2 17 18,7 4,7 17,6 38 34,0 2,6 12,7 18 19,0 4,7 20,1 39 34,9 2,6 11,9 19 19,7 4,5 35,5 40 35,7 2,5 13,4 20 20,0 4,4 46,6 41 39,0 2,3 11,2 21 20,7 4,3 58,3

3. Кристаллическая форма А твердого вещества изопропил (S)-N-(2-(пиридин-3-илметокси)-4-(2-бром-3-фенилбензилокси)-5-хлорбензил)серинат малеата по п. 2, характеризующаяся тем, что при анализе методом ИК-спектрометрии, пики поглощения при 3059, 2984, 2841, 2761, 2519, 2170, 1988, 1968, 1807, 1741, 1716, 1623, 1602, 1580, 1505, 1481, 1460, 1446, 1425, 1401, 1389, 1368, 1309, 1262, 1242, 1205, 1171, 1111, 1095, 1069, 1040, 1004, 972, 953, 924, 884, 870, 864, 854, 824, 788, 761, 721, 703, и 662 см^-1 ± 2 см^-1 представляют собой положения характеристических пиков инфракрасного спектра, представленного кристаллической формой А твердого вещества.

4. Кристаллическая форма А твердого вещества изопропил (S)-N-(2-(пиридин-3-илметокси)-4-(2-бром-3-фенилбензилокси)-5-хлорбензил)серинат малеата по п. 2, характеризующаяся тем, что при анализе методом дифференциальной сканирующей калориметрии в спектре DSC присутствует эндотермический пик при 175°С±3°С при скорости нагревания 10°С в минуту.

5. Способ получения изопропил (S)-N-(2-(пиридин-3-илметокси)-4-(2-бром-3-фенилбензилокси)-5-хлорбензил)серинат малеата по п. 1 или кристаллической формы А твердого вещества по п. 2, характеризующийся следующими стадиями:

взаимодействие изопропил (S)-N-(2-(пиридин-3-илметокси)-4-(2-бром-3-фенилбензилокси)-5-хлорбензил)серината с малеиновой кислотой в растворителе с образованием соли;

кристаллизация полученного изопропил (S)-N-(2-(пиридин-3-илметокси)-4-(2-бром-3-фенилбензилокси)-5-хлорбензил)серинат малеата в смешанном растворителе из ацетона и воды, где соотношение ацетона и воды составляет от 25:1 до 10:1.

6. Фармацевтическая композиция для профилактики и/или лечения заболеваний, связанных с сигнальным путем PD-1/PD-L1, содержащая изопропил (S)-N-(2-(пиридин-3-илметокси)-4-(2-бром-3-фенилбензилокси)-5-хлорбензил)серинат малеат по п. 1, или кристаллическую форму А твердого вещества по любому из пп. 2-4, в качестве активного ингредиента, и его фармацевтически приемлемый носитель или эксципиент.

7. Применение изопропил (S)-N-(2-(пиридин-3-илметокси)-4-(2-бром-3-фенилбензилокси)-5-хлорбензил)серинат малеата по п. 1, или кристаллической формы А твердого вещества по любому из пп. 2-4, в получении лекарственного средства для профилактики и/или лечения заболеваний, связанных с сигнальным путем PD-1/PD-L1.

8. Применение по п. 7, характеризующееся тем, что заболевания, связанные с сигнальным путем PD-1/PD-L1, выбраны из рака, инфекционных заболеваний и аутоиммунных заболеваний.

9. Применение по п. 8, характеризующееся тем, что рак выбран из рака кожи, рака легкого, опухоли мочеполовой системы, гематологической опухоли, рака молочной железы, глиомы, опухоли органов пищеварительной системы, опухоли органов репродуктивной системы, лимфомы, опухоли нервной системы, опухоли головного мозга, рака головы и шеи; инфекционные заболевания выбраны из бактериальной инфекции и вирусной инфекции; аутоиммунные заболевания выбраны из органоспецифических аутоиммунных заболеваний и системных аутоиммунных заболеваний, где органоспецифические аутоиммунные заболевания включают хронический лимфоцитарный тиреоидит, гипертиреоз, инсулинозависимый сахарный диабет, миастению гравис, язвенный колит, злокачественную анемию с хроническим атрофическим гастритом, геморрагический легочно-почечный синдром, первичный билиарный цирроз, рассеянный склероз и острый идиопатический полиневрит, системные аутоиммунные заболевания включают ревматоидный артрит, системную красную волчанку, системный васкулит, склеродермию, пемфигус, дерматомиозит, смешанное заболевание соединительной ткани и аутоиммунную гемолитическую анемию.