СПОСОБ ОБНАРУЖЕНИЯ СЛЕДОВ ГЕМОГЛОБИНА В ОБРАЗЦЕ Российский патент 1999 года по МПК A61B5/117 G01N33/72 

Изобретение относится к способам обнаружения следов пероксидазо-активных веществ и может найти применение в криминалистике и судебной медицине, в частности, для установления наличия крови на вещественных доказательствах.

Известны способы обнаружения следов пероксидазо-активных веществ (гемоглобина) в образце в виде водного раствора путем измерения изменения окраски протекающей при окислении пероксидом в присутствии пероксидазо-активного вещества (гемоглобина) хромогена (гвояковый заместитель) (Патент Великобритании 2147416, кл. G 01 N 21/78, 1985 г.) или фенилендиамина и нафтола (патент США 5182213, кл. G 01 N 33/72, 1993 г.).

Недостатком известных способов является ограничение их чувствительности в пределах до 1•10^-6 г/л, а также длительность измерения изменения окраски (около 60 мин).

Известен также способ обнаружения следов пероксидазо-активных веществ в образце измерением хемолюминесценции, протекающей при окислении пероксидом в присутствии пероксидазо-активных веществ гидразида замещенной аминофталевой кислоты (гидразид 7-диметиламинофталевой кислоты) в растворе буфера с pH 6-9 (водного раствора фосфата калия), содержащего депрессор металлов (этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA) или ее натриевая соль), и определением содержания пероксидазо-активных веществ по эталонной калибровочной кривой (патент США 4302537, кл. G 01 N 31/14, 1981 г.).

Недостатком известного способа является невозможность точного установления наличия следов крови (гемоглобина) на вещественных доказательствах, связанная с тем, что известный способ не дает возможность точно определить, какое именно пероксидазо-активное вещество вызывает хемолюминесценцию.

Задача достигается тем, что в известном способе обнаружения следов пероксидазо-активных веществ в образце измерением активности хемолюминесценции, протекающей при окислении перекисным соединением в присутствии пероксидазо-активных веществ гидразида замещенной аминофталевой кислоты в растворе буфера с pH 6-9, содержащего депрессор металлов, определением наличия содержания пероксидазо-активных веществ по эталонной калибровочной кривой, осуществляют измерение активности хемолюминесценции пробы исследуемого образца и при обнаружении в ней наличия содержания - пероксидазо-активных веществ по эталонной калибровочной кривой, предварительно полученной для известных количеств гемоглобина, пробу исследуемого образца подвергают взаимодействию с сорбентом, селективным по отношению к гемоглобину и растительной пероксидазе, отделяют ее от сорбента промывкой водой, проводят измерение активности хемолюминесценции ее водного смыва и по отсутствию хемолюминесценции судят о наличии гемоглобина.

При этом измеряют активность хемолюминесценции, протекающей при окислении пероксидом водорода в присутствии пероксидазо-активных веществ люминола в водном растворе гидроксида натрия, содержащем этилендиаминтетрауксусную кислоту или ее натриевую соль. Кроме того, в качестве сорбента, селективного по отношению к гемоглобину и растительной пероксидазе, используют DEAE Sephadex А-50 или Sephadex G-50-medium. Преимущество предлагаемого способа заключается в том, что в нем исключено влияние других пероксидазо-активных веществ помимо гемоглобина на конечный результат определения и тем самым повышена точность установления наличия крови на вещественных доказательствах. Использование предлагаемого способа также позволяет с высокой чувствительностью (до 10^-10 г/л гемоглобина) определять наличие следов крови на вещественных доказательствах.

На фиг. 1 приведена эталонная калибровочная кривая.

Сущность предлагаемого способа заключается в следующем.

Исследуемый образец (вырезка материала или смыв с пятен вещественных доказательств) заливается физиологическим раствором и оставляется при 4 - 12^oC (в условиях бытового холодильника) в течение 12 - 18 ч.

Готовится реакционная смесь из буфера - водного раствора гидроксида натрия (NaOH), люминола, пероксида водорода (H₂O₂) и ЭДТА или ее натриевой соли (Na₂ЭДТА) при следующем содержании - компонентов: NaOH -4 - 10•10^-3 г/моль, люминол -2,5 - 4,5•10^-6 г/моль, (H₂O₂)-2,5 - 4,5•10^-6 г/млль, ЭДТА (Na₂ЭДТА)-0,3 - 0,5г/моль.

Приготавливаются 6 - 10 эталонных проб с заданным содержанием гемоглобина, обычно от 5 - 10^-9 до 100 - 10^-9 г/л, в воде. В каждую пробу вводится реакционная смесь и с помощью хемолюминометра измеряется активность (светосумма) хемолюминесценции за 15 - 30 с. Измерение производится при 420 нм на люминометре ФЛЮОРАТ 02-3 при температуре 15 - 30^oC (комнатной температуре).

На основании полученных данных строится эталонная калибровочная кривая, приведенная на фиг. 1, в билогарифмической системе координат, где по оси абсцисс откладывается lg содержания гемоглобина, а по оси ординат - светосуммы lg хемолюминесценции.

После выдерживания исследуемого образца в физиологическом растворе, как описано выше, берется его проба и в нее вводится реакционная смесь и измеряется светосумма хемолюминесценции за 15 - 30 с при 420 нм на люминометре. Полученное значение светосуммы сравнивается с эталонной калибровочной кривой. Если измеренная светосумма укладывается в диапазон калибровки, что говорит о присутствии в исследуемом веществе пероксидазо-активных веществ, то проба исследуемого образца подвергается взаимодействию с сорбентом - DEAE Sephadex A-50 или Sephadex G-50-medium, селективным по отношению к гемоглобину, в течение 5 - 10 мин. Затем проба исследуемого образца отделяется от сорбента промывкой его дистиллированной водой. Полученный водный смыв подвергается анализу на люминометре, как описано выше, после введения в него реакционной смеси. Если светосумма хемолюминесценции при исследовании водного смыва будет близка или равна нулю, то можно доказательно утверждать о наличии следов гемоглобина в исследуемом образце. Если же измеренная светосумма будет входить в диапазон калибровки, то в исследуемом образце присутствует пероксидаза и высказаться о присутствии крови не представляется возможным.

Построение эталонной калибровочной кривой и сравнение активности (светосуммы) хемолюминесценции исследуемого образца с эталонной кривой осуществляется с использованием программы для ЭВМ "SUPERDEK", разработанной авторами данного изобретения, путем подключения ЭВМ к люминометру. Аналогичные операции могут быть проделаны и вручную.

Ниже приводятся примеры, иллюстрирующие предлагаемый способ.

Пример 1. Исследуемый образец - вырезка ткани с пятнами (вещественные доказательства) заливают 1,0 мл физиологического раствора и оставляют стоять при +4 - 12^oC в холодильнике в течение 18 ч. Готовят шесть калибровочных растворов гемоглобина в дистиллированной воде с содержанием гемоглобина 5•10^-9 г/л, 7,5•10^-9 г/л, 10•10^-9 г/л, 50•10^-9 г/л, 75•10^-9 г/л, 100•10^-9 г/л соответственно. Для приготовления реакционной смеси смешивают NaOH в виде водного раствора, люминол, Na₂ЭДTA и водный раствор H₂O₂ до содержания в ней 4,0•10^-6 г/моль NaOH, 2,5•10^-6 г/моль люминола, 0,3 г/моль Na₂ЭДTA и 2,5•10^-6 г/моль H₂O₂ (pH6).

В пробирку помещают 1 мл реакционной смеси и вносят в нее 0,1 мл одного из калибровочных растворов гемоглобина. Пробирку помещают в камеру люминометра, подключенного к ЭВМ, и измеряют светосумму хемолюминесценции за 15 с на длине волны 420 нм при комнатной температуре (20^oC). Аналогичные измерения проводят для всех калибровочных растворов. По полученным значениям светосуммы ЭВМ строит эталонную калибровочную кривую, которая приведена на фиг. 1.

В пробирку помещают 0,5 мл реакционной смеси и в нее вносят 0,1 мл пробы исследуемого образца, после выдерживания его в холодильнике. Пробирку помещают в камеру люминометра и измеряют светосумму за 15 с на длине волны 420 нм при комнатной температуре (20^oC). Получают значение светосуммы 167400, которое при сравнении с эталонной калибровочной кривой соответствует наличию ≈50•10^-9 г/л пероксидазоактивного вещества в исследуемом образце.

В колонку помещают 1 мл суспензии сорбента DEAE Sephadex A-50, вносят в нее 0,1 мл пробы исследуемого образца. Через 5 мин сорбент промывают 0,9 мл дистиллированной воды, тем самым отделяя сорбент. Водный смыв помещают в пробирку, в него вводят 0,5 мл реакционной смеси. Пробирку помещают в люминометр и измеряют светосумму как описано выше. Измеренная светосумма равна 0. Это свидетельствует о том, что в исследуемом образце присутствует ≈50•10^-9 г/л гемоглобина, т.е. на вещественных доказательствах присутствует кровь.

Пример 2. Реакционную смесь готовят так же, как описано в примере 1, но содержание в ней NaOH составляет 6,0•10^-3 г/моль, люминола - 4,5•10^-6 г/моль, Na₂ЭДTA - 0,35 г/моль и H₂O₂ - 4,5•10^-6 г/моль.

Построение эталонной калибровочной кривой, приведенной на фиг. 2, осуществляют также как описано в примере 1. Пробу исследуемого образца готовят и определяют в ней активность (светосумму) хемолюминесценции также как описано в примере 1. Получают значение светосуммы 35200, которое при сравнении с эталонной калибровочной кривой соответствует наличию в исследуемом образце ≈6,0•10^-9 г/л пероксидазо-активного вещества.

Пробу исследуемого образца подвергают взаимодействию с сорбентом так же, как описано в примере 1. Затем проводят измерение светосуммы хемолюминесценции водного смыва после введения в него 0,5 мл реакционной смеси в течение 15 с. Измеренная светосумма составляет 35000, что говорит о наличии в исследуемом образце пероксидазы и свидетельствует о невозможности доказательно утверждать о присутствии крови (гемоглобина) на вещественных доказательствах.

Пример 3. Реакционную смесь готовят так же, как описано в примере 1, но содержание в ней NaOH составляет 10•10^-3 г/моль, люминола - 4,5•10^-6 г/моль, Na₂ЭДТА - 0,5 г/моль, H₂O₂ - 4,5•10^-6 г/моль.

Построение эталонной калибровочной кривой, приведенной на фиг. 3, осуществляют так же, как описано в примере 1. Пробу исследуемого образца готовят и определяют в ней активность (светосумму) хемолюминесценции так же, как описано в примере 1. Получают значение светосуммы 221340, которое при сравнении с эталонной калибровочной кривой соответствует наличию в исследуемом образце ≈10•10^-9 г/л пероксидазо-активного вещества.

Пробу исследуемого образца подвергают взаимодействию с сорбентом, отделяют ее от сорбента и проводят измерение светосуммы хемолюминесценции водного смыва так же, как описано в примере 1. Измеренная светосумма составляет 30, близка к нулю. Это свидетельствует о том, что в исследуемом образце присутствует ≈10•10^-9 г/л гемоглобина, т.е. на вещественных доказательствах присутствует кровь.

Пример 4. Определение наличия следов гемоглобина (крови) в исследуемом образце осуществляют так же, как описано в примере 1, за исключением того, что реакционная смесь вместо Na₂ЭДTA содержит то же количество ЭДТА.

Пример 5. Определение наличия следов гемоглобина (крови) в исследуемом образце осуществляют так же, как описано в примере 1, за исключением того, что в качестве селективного сорбента используют Sephadex G-50-medium.

Изобретение относится к области медицины, в частности к криминалистике. Способ характеризуется тем, что для установления наличия следов крови (гемоглобина) на вещественных доказательствах осуществляют измерение активности хемолюминесценции пробы исследуемого образца. При обнаружении в ней наличия содержания пероксидазо-активных веществ по эталонной калибровочной кривой, предварительно полученной для известных количеств гемоглобина, пробу исследуемого образца в случае необходимости подвергают взаимодействию с сорбентом, селективным по отношению к гемоглобину и растительной пероксидазе. Отделяют ее от сорбента промывкой водой, проводят измерение активности хемолюминесценции ее водного смыва и по отсутствию хемолюминесценции судят о наличии гемоглобина. При этом измеряют активность хемолюминесценции, протекающей при окислении пероксидом водорода в присутствии пероксидазо-активных веществ люминола в водном растворе гидроксида натрия, содержащем этилендиаминтетрауксусную кислоту или ее натриевую соль. В качестве сорбента, селективного по отношению к гемоглобину и растительной пероксидазе, используют DEAE Sephadex A-50 или Sephadex G-50-medium. Способ обеспечивает повышение точности определения. 2 з.п.ф-лы, 3 ил.

1. Способ обнаружения следов гемоглобина в образце путем измерения активности хемолюминесценции, протекающей при окислении перекисным соединением в присутствии пероксидазо-активных веществ гидразида замещенной аминофталевой кислоты в растворе буфера с pH 6 - 9, содержащего депрессор металлов, определением наличия содержания пероксидазо-активных веществ по эталонной калибровочной кривой, отличающийся тем, что осуществляют измерение активности хемолюминесценции пробы исследуемого образца и при обнаружении в ней наличия содержания пероксидазо-активных веществ по эталонной калибровочной кривой, предварительно полученной для известных количеств гемоглобина, пробу исследуемого образца подвергают взаимодействию с сорбентом, селективным по отношению к гемоглобину и растительной пероксидазе, отделяют ее от сорбента промывной водой, проводят измерение активности хемолюминесценции ее водного смыва и по отсутствию хемолюминесценции судят о наличии гемоглобина. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что измеряют активность хемолюминесценции, протекающей при окислении пероксидом водорода в присутствии пероксидазо-активных веществ люминола в водном растворе гидроксида натрия, содержащем этилендиаминтетрауксусную кислоту или ее натриевую соль. 3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что в качестве сорбента, селективного по отношению к гемоглобину и растительной пероксидазе, используют DEAE Sephadex А-50 или Sephadex G-50-medium.