СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ АУТОАНТИТЕЛ К ЛИПОПРОТЕИДАМ НИЗКОЙ ПЛОТНОСТИ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ Российский патент 1999 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к медицине, а именно к терапии.

Сущность способа в том, что в сыворотке крови определяют количество аутоантител к ЛПНП, причем в качестве связующего агента используют ЛПНП, которые выделяют от большого числа доноров в связи с наличием аллотипических различий в структуре липопротеидов и очищают от загрязняющих их циркулирующих иммунных комплексов "ЛПНП + аутоантитело", а в качестве вторых антител для обнаружения аутоантител к ЛПНП в иммуноферментной реакции используют козьи поликлональные антитела к легким цепям иммуноглобулинов человека, меченные пероксидазой.

Изобретение может быть также использовано для диагностики атеросклероза.

Известен способ определения антилипопротеиновой активности в сыворотке крови у больных с сердечно-сосудистыми заболеваниями твердофазовым иммуноферментным методом [1], выбранный в качестве прототипа.

Недостаток прототипа - низкая информативность, малая дифференциация и не обработанный в реализации количественный учет уровня аутоантител.

В изобретении решена медико-техническая задача повышения информативности и достоверности диагностики путем количественного определения аутоантител к липопротеидам низкой плотности (ДПНП) с учетом всего их многообразия.

Поставленная задача решается тем, что выполняют стандартизацию по аффинным аутоантителам к ЛПНП с известной концентрацией белка легких цепей иммуноглобулинов, причем в качестве связывающего агента используют ЛПНП, выделенные от большого числа доноров и очищенные от циркулирующих иммунных комплексов "ЛПНП + аутоантитело", а в качестве вторых антител для обнаружения аутоантител к ЛПНП в иммуноферментной реакции используют козьи поликлональные антитела к легким цепям иммуноглобулинов человека, меченные пероксидазой.

Способ осуществляется следующим образом.

1 этап. Выполняют иммобилизацию связывающего агента - (ЛПНП) на твердой фазе физической сорбции.

2 этап. Осуществляют комплементарное присоединение лиганда - (аутоантител к ЛПНП) из калибровочного материала или исследуемой жидкости.

3 этап. Достигают проявление образовавшегося иммунного комплекса (ЛПНП + аутоантитело) с помощью конъюгата козьих поликлональных антител к легким цепям иммуноглобулинов человека с пероксидазой.

4 этап. Учитывают реакцию по экстинции раствора хромагента, изменяющего свою окраску в зависимости от количества кислорода, выделенного из перекиси водорода при разложении ее пероксидазой.

Конструируют диагностикум в следующем порядке.

1. Получают связывающий агент - ЛПНП.

Со станции переливания крови получают смесь плазм от как можно большего числа доноров - 40 - 105 человек. Менее 40, снижается достоверность; более 105, данные всегда стабильны. Липопротеиды выделяют путем последовательного ультрацентрифугирования в титановом роторе T - 45, например в ультрацентрифуге Вес ап "рпо" 12 - 65В. ЛПНП флотируют в плотности бромистого натрия 1,05 г/мл. Полученный препарат ЛПНП подвергают гель-хроматографии на колонке с сефарозой 6В Cl. Фракции второго пика объединяют и концентрируют, например, на ячейке "А соп" на фильтре ХМ 300 до минимального объема, затем разбавляют веронал - мединаловым буферным раствором до концентрации 2 мг/мл и проводят препаративный электрофорез в блоке 1% агарозы при силе тока 150 мА.

Полоску агарозы с ЛПНП вырезают и подвергают электроэлюированию в стандарном для данной процедуре приборе. Препарат ЛПНП вновь концентрируют в ячейке для ультрафильтрации. Очищенный таким образом препарат ЛПНП не содержит ЦИК и сохраняет свои нативные свойства. Проверку на чистоту осуществляют диск-электрофорезом в ПААГ и иммуноэлектрофорезом с антисыворотками, преципитирующими все человеческие белки и иммуноглобулины. Предложенный препарат дает только одну полосу в диск-электрофорезе при окраске на липопротеиды и белки и одну линию преципитации при иммунофорезе против антисыворотки, преципитирующей все человеческие белки в зоне ЛПНП.

2. Выделяют аутоантитела к ЛПНП.

На основе полученного иммунохимически чистого препарата ЛПНП и СпВ - сефарозы 4В синтезируют иммуносорбент. Смесь человеческих сывороток от 6300 доноров пропускают через колонку с иммуносорбентом, из расчета 100,0 мл на 1 г носителя. Колонку тщательно отмывают от несвязавшихся сывороточных белков и элюируют аффинные аутоантитела к ЛПНП. В препарате аутоантител определяют количество и состав иммуноглобулинов, а также количество белка легких цепей иммуноглобулинов, одинаковых для всех классов.

3. Готовят конъюгат к легким цепям иммуноглобулинов.

Из иммуноглобулинов человека выделяют легкие цепи и проводят иммунизацию лабораторных животных. Антитела к легким цепям конъюгируют с пероксидазой корня хрена периодатным окислением.

4. Перед употреблением готовят субстратную смесь из 0,05% раствора ортофенилендиамина и 0,02% раствора перекиси водорода в 0,05 М имидазол-цитратном буферном растворе pH 5,5.

5. Твердая фаза. В качестве твердой фазы выбирают полистероловые плоскодонные планшеты, например, 8 х 12 лунок отечественные "Медполимер" или зарубежных фирм: "Нунк", "Линбро", "Титертек" и др.

Для конструирования тест-системы подбирают следующие параметры:
1. Концентрацию связывающего агента 10 • 10^-3 г/л.

2. pH сорбирующего буферного раствора 8,5 - 0,01 М фосфатный буферный раствор с 0,15 М хлористого натрия.

3. Температура и время иммобилизации связывающего агента составляют +4^oC в течение 18 часов.

4. Температура и время инкубации лиганда +52^oC в течение 3 часов.

5. Скрининг-титр исследуемого материала составляет 1:50.

6. Калибровку реакции проводят на основе поликлональных моноспецифических аутоантител к ЛПНП с количеством белка легких цепей иммуноглобулинов человека - (10⁴ - 78) • 10^-3 г/л.

Специфичность реакции проверяют с помощью использования в качестве связывающих агентов миоглобина, апопротеинов апо-С-II, апо-С-III и апо-А-I.

Разработанным диагностикумом (способом) определяют уровни аутоантител к ЛПНП в норме у здоровых доноров.

Пример 1. Для исследования были взяты 52 здоровых донора с московской городской Станции переливания крови. Содержание холестерина в сыворотке крови не превышало 4,68 - 5,20 ммоль/л, триглицеридов не более 1,14 - 1,38 ммоль/л Из них 28 - мужчин и 24 женщины. 30 человек в возрасте до 30 лет, 12 - от 30 до 39, а 10 обследованных были в возрасте 40 лет и старше. У исследуемых среднее значение количества аутоантител в сыворотке крови составило 45,32 ± 4,25 мкг/мл, а в циркулирующих иммунных комплексах 0,52 • 0,066 мкг/мл. Способ апробирован в КНЦ АМН РФ.

Пример 2. Для исследования были взяты 100 больных ИБС и гиперлипопротеидемией с верифицированным атеросклерозом с помощью селективной коронарографии. Больные были разделены на 5 групп в зависимости от количества пораженных коронарных артерий. Среднее значение количества аутоантител у больных с верифицированным атеросклерозом составило в сыворотке крови от 115,1 ± 11,5 мкг/мл до 175,7 ± 8,8 мкг/мл, а в циркулирующих иммунных комплексах от 1,12 ± 0,08 мкг/мл до 2,04 ± 0,13 мкг/мл.

Эффективность способа количественного определения аутоантител к ЛПНП в том, что количественно определяют нормальные уровни аутоантител к ЛПНП у здоровых доноров и определяют их границы у больных с верифицированным атеросклерозом.

Литература
1. Szondy E., Mezey Z., Antilipoprotein activity in sera and circulation imminne compolexces. Abstz. Intern. Sump. Aterosclerotis, 1982. W. Berlin, P. 536 - 543.

Использование: в медицине, в частности в терапии. Проводят твердофазный иммуноферментный анализ, в котором выполняют стандартизацию по аффинным аутоантителам к ЛПНП с известной концентрацией белка легких цепей иммуноглобулинов, причем в качестве связывающего агента используют ЛПНП, выделенные от большого числа доноров и очищенные от циркулирующих иммунных комплексов "ЛПНП + аутоантитело", а в качестве вторых антител для обнаружения аутоантител к ЛПНП в иммуноферментной реакции используют козьи поликлональные антитела к легким цепям иммуноглобулинов человека, меченные пероксидазой. Способ является высокоспецифичным, чувствительным и количественным.

Способ количественного определения аутоантител к липопротеидам низкой плотности в сыворотке крови путем проведения твердофазного иммуноферментного анализа, отличающийся тем, что выполняют стандартизацию по аффинным аутоантителам к ЛПНП с известной концентрацией белка легких цепей иммуноглобулинов, причем в качестве связывающего агента используют ЛПНП, выделенные от большого числа доноров и очищенные от циркулирующих иммунных комплексов "ЛПНП + аутоантитело", а в качестве вторых антител для обнаружения аутоантител к ЛПНП в иммуноферментной реакции используют козьи поликлональные антитела к легким цепям иммуноглобулинов человека, меченные пероксидазой.