СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АУТОАНТИТЕЛ К ПРОГЕСТЕРОНУ В СЫВОРОТКЕ И ПЛАЗМЕ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА МЕТОДОМ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА Российский патент 2015 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способу определения антител к прогестерону, и может быть использовано в биологии и медицине для определения аутоантител к прогестерону в сыворотке и плазме крови человека при акушерско-гинекологической патологии, а именно при привычном невынашивании беременности, бесплодии, у больных с гипоплазией эндометрия, неудачами в программах экстракорпорального оплодотворения, с акушерскими осложнениями (гипоплазия хориона, угроза прерывания беременности, хроническая плацентарная недостаточность), с предменструальным синдромом, после применения гормональных контрацептивов и препаратов, содержащих прогестерон.

Известен способ определения антител к прогестерону [1], заключающийся в том, что на поверхность лунок полистирольного микропланшета иммобилизуют конъюгат прогестерона с БСА из 0,1 М карбонат-бикарбонатного буферного раствора (рН 9,5) в концентрации 10 мкг/мл при 4°С в течение ночи; планшет промывают трисовым солевым буферным раствором (рН 7,4), содержащим 0,05% твина-20; планшет обрабатывают смесью 1,5% БСА и 1,5% желатина в трисовом солевом буферном растворе при комнатной температуре в течение 2 часов и затем при 4°С в течение ночи; сыворотки крови для определения IgM и IgG исследуют в разведении 1:100 по объему и инкубируют при комнатной температуре в течение 2 часов, для определения IgE сыворотки исследуют в разведении 1:2 по объему и инкубируют в течение ночи; антитела козы, меченные щелочной фосфатазой, к IgM, IgG или IgE человека инкубируют при комнатной температуре в течение 2 часов; инкубацию с субстратно-хромогенной смесью, содержащей паранитрофенилфосфат, проводят в течение 45 минут. К недостаткам следует отнести сложность и многоэтапностъ методики, включение длительных инкубации, в том числе в течение ночи. Многокомпонентность системы, использование длительных инкубаций, конъюгата поликлональных антител с ферментом для детекции антител к прогестерону приводят к недостаточно высокой чувствительности, специфичности, точности и воспроизводимости определения.

Наиболее близким к заявляемому по технической сущности является способ определения антител к прогестерону [2], заключающийся в том, что конъюгат прогестерона с БСА (БСА-11α-гидроксипрогестерон) иммобилизуют на полистирольную поверхность лунок микропланшета из фосфатно-солевого буферного раствора при 20±2°С в течение 18±2 часов; сыворотки крови разводят 1:100 в фосфатно-солевом буферном растворе, содержащем 0,5% желатина и 0,5% твина-20, и инкубируют на встряхивателе при 20±2°С в течение 1 часа; планшет промывают фосфатно-солевым буферным раствором, содержащим 0,5% твина-20; планшет инкубируют с мышиными моноклональными антителами к IgM, IgG человека, меченными пероксидазой хрена, при 20±2°С в течение 1 часа; планшет инкубируют с субстратно-хромогенным раствором, содержащим 3,3′,5,5′-тетраметилбензидин и перекись водорода. Использование в качестве антигена конъюгата прогестерона с БСА, в котором содержание прогестерона ограничивается 12-16 молекулами прогестерона на 1 молекулу БСА, отсутствие дополнительной обработки поверхности твердой фазы блокирующим раствором, содержащим инертные белки, использование высокой концентрации поверхностно-активного вещества в буфере для промывки и разведения сывороток и конъюгата приводят к ограничению чувствительности, специфичности и точности определения.

Технической задачей изобретения является создание чувствительного, специфичного и простого в исполнении способа определения аутоантител к прогестерону в сыворотке и плазме крови человека методом ИФА. Эта задача решается описываемым способом определения антител к прогестерону, заключающимся в использовании в качестве антигена конъюгата прогестерона с гемоцианином с высоким содержанием прогестерона от 120 до 150 молекул на 1 молекулу гемоцианина, иммобилизации антигена на поверхность полистирола из водного буферного раствора (рН 7,2±0,2), обработке поверхности водным буферным раствором, содержащим 5-20 мг/мл инертного белка (БСА, желатина), инкубации сывороток крови, разведенных в соотношении 1:10-1:100 по объему в водном буферном растворе, содержащем 5-10 мг/мл инертного белка (БСА, желатина) и 0,05-0,1% по объему твина-20, промывании поверхности до и после инкубации водным буферным раствором, содержащим 0,05-0,1% твина-20, использовании для детекции антител к прогестерону конъюгата моноклональных антител к иммуноглобулинам человека класса М, G, А, Е, с ферментом.

Практически способ осуществляется следующим образом.

Конъюгат прогестерона с гемоцианином из лимфы улитки Megathura crenulata (гемоцианин-11α-гидроксипрогестерон, гемоцианин-3α-гидроксипрогестерон) в водном буферном растворе (фосфатно-солевом, трисовом) с рН 7,2±0,2, содержащем 0,05-0,1% проклина 300, в концентрации 1-5 мкг/мл иммобилизуют на поверхность полистирола при 20±2°С в течение 18±2 часов, поверхность промывают указанным водным буферным раствором, поверхность обрабатывают водным буферным раствором, содержащим 5-20 мг/мл инертного белка (БСА, желатина) при 20±2°С в течение 60-90 минут, промывают водным буферным раствором, содержащим 0,05-0,1% по объему твина-20. Образцы сыворотки, плазмы крови, разведенные в соотношении 1:10-1:100 по объему в водном буферном растворе, содержащем 5-10 мг/мл инертного белка и 0,05-0,1% по объему твина-20, инкубируют при 20±2°С на орбитальном шейкере при 200-300 об/мин в течение 60-120 минут, поверхность твердой фазы до и после инкубации промывают водным буферным раствором, содержащим 0,05-0,1% твина-20, и инкубируют с конъюгатом мышиных моноклональных антител к иммуноглобулинам человека класса М, G, А, Е, с пероксидазой хрена в разведении в соотношении 1:2000-1:60000 по объему в водном буферном растворе, содержащем 5-10 мг/мл инертного белка и 0,05-0,1% твина-20, при 20±2°С на орбитальном шейкере при 200-300 об/мин в течение 60±10 минут. После промывания водным буферным раствором, содержащим 0,05-0,1% твина-20, инкубируют с субстратно-хромогенной смесью, содержащей 3,3′,5,5′-тетраметилбензидин и перекись водорода, при 20±2°С в течение 15-20 минут, ферментативную реакцию останавливают 0,5М H₂SO₄ результат анализа оценивают инструментально путем измерения оптической плотности (ОП) на фотометре при длине волны 450 нм.

Отличительной особенностью предлагаемого способа является то, что в качестве антигена используют конъюгат прогестерона с гемоцианином, адсорбцию антигена на поверхность полистирола проводят из водного буферного раствора с рН 7,2±0,2 при 20±2°С в течение 18±2 часов, поверхность промывают водным буферным раствором и обрабатывают раствором инертного белка (БСА, желатина) с концентрацией 5-20 мг/мл при 20±2°С в течение 60-90 минут, образцы сыворотки, плазмы крови разводят в водном буферном растворе, содержащем 5-10 мг/мл инертного белка и 0,05-0,1% по объему твина-20, в соотношении 1:10-1:100 по объему и инкубируют при 20±2°С на орбитальном шейкере при 200-300 об/мин в течение 60-120 минут, поверхность полистирола до и после инкубации промывают водным буферным раствором, содержащим 0,05-0,1% твина-20, инкубируют с конъюгатом мышиных моноклональных антител к иммуноглобулинам человека класса М, G, А, Е, с пероксидазой хрена в водном буферном растворе, содержащим 5-10 мг/мл инертного белка и 0,05%-0,1% твина-20.

Пример 1. Для подтверждения возможности получения технического результата с помощью заявленного способа определения аутоантител к прогестерону используют образцы сыворотки, плазмы крови здоровых доноров и пациенток с привычным невынашиванием беременности и бесплодием.

Конъюгат гемоцианин-11α-гидроксипрогестерон (Michigan Diagnostics, США) в фосфатно-солевом буферном растворе (ФСБР) с рН 7,2±0,2, содержащем 0,05% проклина 300, в концентрации 1 мкг/мл вносят по 100 мкл в лунки полистирольного микропланшета (Nunc MaxiSorp, Thermo Fisher Scientific, Дания) и инкубируют при 20±2°С в течение 18±2 часов. Планшет промывают 4 раза ФСБР. В лунки планшета вносят по 200 мкл ФСБР, содержащего 10 мг/мл БСА, и инкубируют при 20±2°С в течение 90±10 минут. После 4-кратного промывания планшета ФСБР, содержащим 0,05% по объему твина-20, в лунки вносят по 100 мкл образцов сыворотки, плазмы крови, предварительно разведенных в ФСБР, содержащем 5 мг/мл БСА и 0,05% по объему твина-20, в соотношении 1:100 по объему, инкубируют при 20±2°С на орбитальном шейкере при 200 об/мин в течение 60±10 минут. После 4-кратного промывания планшета ФСБР, содержащим 0,05% твина-20, в лунки вносят конъюгат мышиных моноклональных антител с пероксидазой хрена к IgM человека в разведении в соотношении 1:30000 по объему, к IgG человека в разведении в соотношении 1:50000 по объему в ФСБР, содержащем 5 мг/мл БСА и 0,05% твина-20, по 100 мкл в лунку, инкубируют при 20±2°С на орбитальном шейкере при 200 об/мин в течение 60±10 минут. После 4-кратного промывания планшетов ФСБР, содержащим 0,05% твина-20, в лунки вносят по 100 мкл субстратно-хромогенного раствора, содержащего 3,3′,5,5′-тетраметилбензидин и перекись водорода, инкубируют при 20±2°С в течение 15-20 минут, реакцию останавливают добавлением в лунки по 100 мкл 0,5 М H₂SO₄. Оценку результатов проводят инструментально путем измерения ОП на фотометре при длине волны 450 нм.

Пример 2. Анализ проводят аналогично способу, описанному в примере 1, за исключением того, что в качестве антигена для иммобилизации на твердую фазу используют гемоцианин-3α-гидроксипрогестерон (Michigan Diagnostics, США).

Пример 3. Анализ проводят аналогично способу, описанному в примере 1, за исключением того, что в качестве антигена для иммобилизации на твердую фазу используют БСА-11α-гидроксипрогестерон (Michigan Diagnostics, США).

Пример 4. Анализ проводят аналогично способу, описанному в примере 1, за исключением того, что выполняют 2-кратное титрование образцов сыворотки крови больных с привычным невынашиванием беременности (1:100-1:6400).

Пример 5. Анализ проводят аналогично способу, описанному в примере 1, за исключением того, что в качестве антигена на поверхность твердой фазы иммобилизуют гемоцианин из лимфы улитки Megathura crenulata (Sigma-Aldrich, США).

Пример 6. Анализ проводят аналогично способу, описанному в примере 1, за исключением того, что в качестве антигена на поверхность твердой фазы иммобилизуют БСА (Sigma-Aldrich, США).

Пример 7. Анализ проводят аналогично способу, описанному в примере 2, за исключением того, что используют планшет, который после иммобилизации антигена и обработки раствором инертного белка, хранят в вакуумной упаковке при +4°С в течение 1 года.

Изобретение относится к биотехнологии и медицине, в частности иммунологии, и предназначено для определения аутоантител к прогестерону в сыворотке и плазме крови человека. Изобретение раскрывает способ непрямого твердофазного иммуноферментного анализа, в котором в качестве антигена на поверхность полистирола иммобилизуют конъюгат прогестерона с гемоцианином: гемоцианин-11α-гидроксипрогестерон, гемоцианин-3α-гидроксипрогестерон. Предлагаемый способ технически прост, информативен, обладает высокой чувствительностью и специфичностью при определении антител к прогестерону в сыворотке и плазме крови больных с привычным невынашиванием беременности и бесплодием, его применение позволяет получить достоверные результаты при хранении готовых планшетов до 1 года. Изобретение может быть применено для обследования больных с различной акушерско-гинекологической патологией. 7 табл., 7 пр.

Способ определения аутоантител к прогестерону в сыворотке и плазме крови человека методом иммуноферментного анализа, включающий адсорбцию конъюгата прогестерона с белком-носителем на поверхность полистирола, обработку поверхности водным раствором инертного белка, инкубацию с разведенной сывороткой, плазмой крови, инкубацию с конъюгатом антител к иммуноглобулинам человека с ферментом, инкубацию с субстратно-хромогенным раствором, отличающийся тем, что на полистирольную поверхность адсорбируют конъюгат прогестерона с гемоцианином (гемоцианин-11α-гидроксипрогестерон, гемоцианин-3α-гидроксипрогестерон) в водном буферном растворе (фосфатно-солевом, трисовом) с pH 7,2±0,2, содержащем 0,05-0,1% проклина 300, при 20±2°С в течение 18±2 часов, поверхность промывают указанным буферным раствором и обрабатывают буферным раствором, содержащим инертный белок (БСА, желатин) в концентрации 5-20 мг/мл, инкубируют с образцами сыворотки, плазмы крови, разведенными в соотношении 1:10-1:100 по объему в буферном растворе, содержащем инертный белок в концентрации 5-10 мг/мл и 0,05-0,1% по объему твина-20, поверхность до и после инкубации промывают буферным раствором, содержащим 0,05-0,1% по объему твина-20, инкубируют с мышиными моноклональными антителами к иммуноглобулинам человека класса М, G, А, Е, конъюгированными с пероксидазой хрена, используют субстратно-хромогенный раствор, содержащий 3,3′,5,5′-тетраметилбензидин и перекись водорода измеряют оптическую плотность при длине волны 450 нм.