АНТИГЕН-СПЕЦИФИЧЕСКИЙ СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИММУННЫХ КОМПЛЕКСОВ БЕЛКОВ СЕМЕЙСТВА МАКРОГЛОБУЛИНОВ С ИММУНОГЛОБУЛИНОМ КЛАССА G В БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЯХ Российский патент 2003 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к лабораторной диагностике, к серологическим методам исследования, а именно к иммунологии.

Белки семейства макроглобулинов, а именно альфа-2-макроглобулин (МГ), ассоциированный с беременностью протеин - А (РАРР-А) и ассоциированный с беременностью альфа-2-гликопротеин (PAG) имеют очень древнее происхождение, присутствуют фактически у всех представителей животного мира (от моллюсков до человека) и являются основными регуляторами функций, осуществляемых в жидких средах организма. Широко известна способность макроглобулинов ингибировать все известные типы протеиназ. Иммуномодуляторные способности белков семейства макроглобулинов и их комплексов с протеиназами и цитокинами также являются общепризнанным фактом. Однако комплексы белков данного семейства с другими иммунорегуляторными белками, в частности с иммуноглобулинами, в крови и других биологических жидкостях, колебания их концентрации при различных физиологических и патологических процессах до сих пор остаются не изученными.

Аналогом предлагаемого метода является способ количественного определения аутоантител к липопротеидам низкой плотности (ЛПНП) в сыворотке крови (патент РФ 2137134 от 15.04.97 г., Опубл. БИ 25, стр.513, 10.03.99 "Способ количественного определения аутоантител к липопротеидам низкой плотности в сыворотке крови."). Однако в этом способе в качестве связывающего агента используются ЛПНП, выделенные из большого числа доноров и очищенные от циркулирующих иммунных комплексов.

Данный подход требует очень больших затрат исходного сырья вследствие потерь в процессе очистки. Кроме того, в случае промышленного использования методики возникнет необходимость введения внутренних стандартов, так как в каждом случае количество и физиологические характеристики доноров, а следовательно, и конечный состав полученных фракций ЛПНП будет различным.

Наиболее близким к заявленному является способ количественного определения циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) при помощи иммуноферментного анализа (Константинова Н.А. "Иммунные комплексы и повреждение тканей". - М.: Медицина 1996, с.233-234). В данном способе в качестве связывающего агента (первичных антител) используются мышиные моноклональные антитела против Сlq, в качестве образца - сыворотка крови человека, в качестве буфера для разведения - забуференный физиологический раствор рН 7,4 с 150 мМ NaCl и 0,05% неионного детергента Твина-20 (ЗФР-Т). Реакция проявляется коньюгатом моноклональных анти-Fc-IgG с пероксидазой хрена. В качестве калибратора используют агрегированный при тепловой обработке IgG.

Однако использование моноклональных антител при определении комплексов белков семейства макроглобулинов с иммуноглобулинами, даже с иммуноглобулинами наиболее распространенного в биологических жидкостях класса G, неприемлемо вследствие исходно низкой концентрации данных комплексов. Моноклональные антитела способны распознавать только определенный центр связывания (эпитоп) на поверхности молекулы белка, вследствие чего незначительно повышается специфичность, но значительно снижается чувствительность тест-системы. Кроме того, тепловая агрегация контрольных образцов плохо поддается стандартизации вследствие спонтанного образования агрегатов различных размеров. К тому же, достаточно высокая гликозилированность молекул белков семейства макроглобулинов может спровоцировать завышение полученных результатов вследствие выявления неспецифических комплексов макроглобулинов с противоуглеводными антителами.

Задача изобретения - создание высокоточного, дифференциального и достаточно эффективного способа определения концентрации комплексов белок семейства макроглобулинов - антитело, - аутоантитело или - противоуглеводное антитело в биологических жидкостях.

Поставленная задача достигается тем, что для определения общей концентрации иммунных комплексов при выполнении иммуноферментного анализа в качестве первичных антител берут аффинно-очищенные поликлональные кроличьи антитела против белка семейства макроглобулинов, а именно МГ, PAG или РАРР-А, образцы разводят стандартным 0,1М фосфатным буфером рН 7,4 с 150 мМ NaCl, содержащим 0,05% Твина-20 (ЗФР-Т), иммуные комплексы проявляют коньюгатом поликлональных кроличьих антител к Fc фрагментам иммуноглобулина класса G с пероксидазой хрена. Для построения калибровки в качестве первичных антител используются кроличьи поликлональные антитела к иммуноглобулину класса G, в качестве калибратора - высокоочищенный нативный иммуноглобулин класса G, реакция проявляется коньюгатом кроличьих поликлональных антител к Fc фрагменту иммуноглобулина класса G с пероксидазой хрена.

Для определения аутоантител при помощи иммуноферментного анализа в качестве первичных антител берут аффинно-очищенные поликлональные кроличьи антитела против белка семейства макроглобулинов, а именно МГ, PAG или РАРР-А, в буфер для разведения образцов (ЗФР-Т) вводят сахара, а именно 0,1 М лактозу и 0,5 М глюкозу, иммунокомплексы проявляют коньюгатом поликлональных кроличьих антител к Fc фрагментам иммуноглобулина класса G с пероксидазой хрена. Для построения калибровки в качестве первичных антител используются кроличьи поликлональные антитела к иммуноглобулину класса G, в качестве калибратора - высокоочищенный нативный иммуноглобулин класса G, реакция проявляется коньюгатом кроличьих поликлональных антител к Fc фрагменту иммуноглобулина класса G с пероксидазой хрена.

Концентрацию противоуглеводных антител определяют, вычисляя разницу между общей концентрацией иммунных комплексов и концентрацией аутоантител.

Новизна способа:
1) Использование в качестве первичных антител аффинно-очищенных поликлональных кроличьих антител против белка семейства макроглобулинов, а именно: МГ, PAG или РАРР-А.

2) Использование смеси сахаров, а именно: 0,1 М лактозы и 0,5 М маннозы, добавляемой в буфер (ЗФР-Т) для разведения образцов биологических жидкостей при определении комплексов с ауто-антителами.

3) Использование для построения калибровочной кривой высокоочищенного нативного иммуноглобулина человека класса G в качестве калибратора.

4) Вычисление концентрации комплексов с противоуглеводными антителами путем вычитания концентрации комплексов с ауто-антителами из общей концентрации иммунокомплексов с иммуноглобулином класса G.

Использование поликлональных антител в качестве первичных обусловлено крайне низкой концентрацией комплексов белков семейства макроглобулинов с иммуноглобулином класса G в предварительно исследованных образцах биологических жидкостей. Использование смеси антител с сайтами связывания к различным эпитопам на поверхности макроглобулина позволяет обеспечить наиболее полное связывание определяемых иммунных комплексов.

Учитывая достаточно высокую гликозилированность молекул белков семейства макроглобулинов, определение только общей концентрации иммунных комплексов не всегда корректно, так как при ряде патологий степень гликозилированности может меняться. Добавление смеси сахаров в буфер для разведения позволяет исключить противоуглеводные антитела за счет конкурентного вытеснения и определить, таким образом, истинную концентрацию иммунных комплексов белков семейства макроглобулинов с аутоантителами.

Использование нативного иммуноглобулина класса G в качестве калибратора позволяет повысить точность тест-системы, так как в отличие от агрегированного при тепловой обработке белка нативные высокоочищенные препараты IgG имеют одинаковую молекулярную массу и, следовательно, лучше поддаются стандартизации.

Определение сначала общей суммы иммунокомплексов с иммуноглобулином класса G, а затем концентрации комплексов с аутоантителами позволяет оценить соотношение ауто- и противоуглеводных антител в различных биологических жидкостях.

Предлагаемый способ осуществляют следующим образом.

Для определения общей концентрации комплексов иммуноглобулина класса G с каким-либо из белков семейства макроглобулинов при помощи иммуноферментного анализа афинно-очищенные поликлональные кроличьи антитела к макроглобулину (МГ, PAG или РАРР-А) разводятся карбонат-бикарбонатным буфером рН 9,6 до концентрации 10 мкг в мл и вносятся на полистироловый планшет по 200 мкл в каждую лунку. Планшет оставляют на 16 ч при 4^oС. Затем планшет несколько раз промывают 0,1 М фосфатным буфером рН 7,4 с 150 мМ NaCl, содержащим 0,05% Твина-20 (ЗФР-Т). Для исключения неспецифических реакций свободный полистирол (без присоединившихся антител) покрывается 1% бычьим сывороточным альбумином (БСА) в 0,1 М фосфатном буфере рН 7,4 с 150 мМ NaCl. Раствор БСА вносится по 200 мкл в каждую лунку и инкубируется 1ч при комнатной температуре. Образцы разводятся в ЗФР-Т, соотношения буфера и образца подбираются для каждого типа образца индивидуально вследствие различной концентрации иммунных комплексов в различных биологических жидкостях. Разведенные образцы вносятся на планшет по 200 мкл в каждую лунку. В качестве калибратора используется высокоочищенный нативный человеческий иммуноглобулин класса G. Его разведения готовятся в ЗФР-Т. Мы рекомендуем использовать 7-точечную калибровку со ступенчатым разведением. Кроме того, необходимо оставить несколько свободных лунок в качестве фона (в них вносится только 200 мкл ЗФР-Т), а также, при серийном использовании метода, несколько лунок, куда вносится один и тот же образец на каждый планшет из серии для стандартизации результатов. Планшет ставится в термостат (37^oС) на 45-60 мин, после чего вновь промывается ЗФР-Т 3-4 раза. Коньюгат к иммуноглобулинам разводится ЗФР-Т (степень разведения подбирается индивидуально, в зависимости от качества используемого коньюгата), вносится по 200 мкл в каждую лунку, инкубируется 45-60 мин при 37^oС и вновь промывается ЗФР-Т. Субстрат для пероксидазы готовится непосредственно перед внесением и вносится в лунки по 150 мкл в каждую. Реакция развивается 10-30 мин в зависимости от качества коньюгата и характеризуется появлением желтой окраски различной интенсивности в лунках, содержащих калибровку и образцы. Затем реакция останавливается внесением 50 мкл 2 н. серной кислоты (Н₂SO₄) в каждую лунку.

Для определения концентрации иммунных комплексов белков семейства макроглобулинов с аутоантителами при помощи иммуноферментного анализа афинно-очищенные поликлональные кроличьи антитела к макроглобулину (МГ, PAG, или РАРР-А) разводятся карбонат-бикарбонатным буфером рН 9,6 до концентрации 10 мкг в мл и вносятся на полистироловый планшет по 200 мкл в каждую лунку. Планшет оставляют на 16 ч при 4^oС. Затем планшет несколько раз промывают 0,1 М фосфатным буфером рН 7,4 с 150 мМ NaCl, содержащим 0,05% Твина-20 (ЗФР-Т). Для исключения неспецифических реакций свободный полистирол (без присоединившихся антител) покрывается 1% бычьим сывороточным альбумином (БСА) в 0,1 М фосфатном буфере рН 7,4 с 150 мМ NaCl. Раствор БСА вносится по 200 мкл в каждую лунку и инкубируется 1 ч при комнатной температуре. Образцы разводятся в ЗФР-Т, содержащем 0,5 М маннозы и 0,1 М лактозы, для конкурентного исключения противоуглеводных антител. Соотношения буфера и образца подбираются для каждого типа образца индивидуально вследствие различной концентрации иммунных комплексов в различных биологических жидкостях. Разведенные образцы вносятся на планшет по 200 мкл в каждую лунку. В качестве калибратора используется высокоочищенный нативный человеческий иммуноглобулин класса G. Его разведения готовятся в ЗФР-Т. Мы рекомендуем использовать 7-точечную калибровку со ступенчатым разведением. Кроме того, необходимо оставить несколько свободных лунок в качестве фона (в них вносится только 200 мкл ЗФР-Т), а также, при серийном использовании метода, несколько лунок, куда вносится один и тот же образец на каждый планшет из серии для стандартизации результатов. Планшет ставится в термостат (37^oС) на 45-60 мин, после чего вновь промывается ЗФР-Т 3-4 раза. Коньюгат к иммуноглобулинам разводится ЗФР-Т (степень разведения подбирается индивидуально, в зависимости от качества используемого коньюгата), вносится по 200 мкл в каждую лунку, инкубируется 45-60 мин при 37^oС и вновь промывается ЗФР-Т. Субстрат для пероксидазы готовится непосредственно перед внесением и вносится в лунки по 150 мкл в каждую. Реакция развивается 10-30 мин в зависимости от качества коньюгата и характеризуется появлением желтой окраски различной интенсивности в лунках, содержащих калибровку и образцы. Затем реакция останавливается внесением 50 мкл 2 н. серной кислоты (H₂SO₄) в каждую лунку.

Замер оптической плотности, построение калибровочного графика и конечный расчет концентрации комплексов производится по стандартной технологии для иммуноферментного анализа. Концентрацию противоуглеводных антител вычисляют по разности общей концентрации иммунных комплексов и комплексов с аутоантителами.

Примеры.

Пример 1: Исследована сыворотка крови здоровой небеременной женщины по предложенной методике на общее содержание МГ-IgG; PAG-IgG и PAPP-A-IgG, а также комплексов МГ-IgG; PAG-IgG с ауто- и противоуглеводными антителами. Общая концентрация комплексов МГ-IgG -0,059 мкг/мл, концентрация аутоантител - 0,043 мкг/мл, противоуглеводных антител - 0,016 мкг/мл. Общая концентрация комплексов PAG-IgG -0,039 мкг/мл, концентрация аутоантител - 0,031 мкг/мл, противоуглеводных антител - 0,008 мкг/мл. Общая концентрация комплексов PAPP-A-IgG -5,71 мкг/мл, аутоантител - 5,71 мкг/мл, противоуглеводные антитела не обнаружены. Таким образом, определены нормальные значения концентраций комплексов белков семейства макроглобулинов с иммуноглобулином класса G в сыворотке крови для здоровых женщин.

Пример 2: Исследована сыворотка крови здорового мужчины по предложенной методике на общее содержание МГ-IgG, а также комплексов МГ-IgG с ауто- и противоуглеводными антителами. Общая концентрация комплексов МГ-IgG - 0,060 мкг/мл, концентрация аутоантител - 0,051 мкг/мл, противоуглеводных антител - 0,009 мкг/мл. Концентрация комплексов иммуноглобулина класса G с PAG и РАРР-А не изучалась вследствие крайне низкой концентрации данных белков в сыворотке крови мужчин. Таким образом, определены нормальные значения концентрации комплексов МГ с иммуноглобулином класса G в сыворотке крови для здоровых мужчин.

Пример 3: Исследована амниотическая жидкость женщины в III триместре физиологически протекающей беременности (образец взят во время родов) по предложенной методике на содержание общего количества МГ-IgG; PAG-IgG и PAPP-A-IgG. Содержание комплексов МГ-IgG - 0,019 мкг/мл. Комплексы PAG-IgG не обнаружены. Общая концентрация комплексов РАРР-А-IgG-0,053 мкг/мл.

Пример 4: Исследовано молоко женщины в послеродовом периоде по предложенной методике на наличие общего количества иммунных комплексов МГ-IgG; PAG-IgG РАРР-А-IgG. Полученная концентрация РАРР-А - 0,036 мкг/мл. Комплексы МГ-IgG, PAG-IgG не обнаружены.

Пример 5: Исследованы образцы сыворотки крови женщины с физиологически протекающей беременностью в I, II и в III триместре (в динамике) по предложенной методике на наличие иммунных комплексов МГ-IgG, PAPP-A-IgG и PAG-IgG. Концентрация комплексов МГ-IgG в I триместре - 0,132 мкг/мл, во II триместре - 0,156 мкг/мл, и в III триместре - 0,168 мкг/мл. Концентрация комплексов PAG-IgG в I триместре - 0,040 мкг/мл, во II триместре - 0,056 мкг/мл, и в III триместре - 0,078 мкг/мл. Концентрация комплексов PAPP-A-IgG в I триместре - 5,94 мкг/мл, во II триместре - 4,86 мкг/мл, и в III триместре - 3,68 мкг/мл. Таким образом, определены нормальные значения концентраций комплексов белков семейства макроглобулинов с иммуноглобулином класса G в сыворотке крови для здоровых женщин с физиологически протекающей беременностью в I-III триместре (в динамике).

Пример 6: Исследованы образцы сыворотки крови беременной женщины в III триместре с верифицированным диагнозом - тяжелый гестоз, по предложенной методике на наличие иммунных комплексов МГ-IgG. Концентрация комплексов MT-IgG - 0,078 мкг/мл. Таким образом, показано, что концентрация комплексов МГ-IgG при гестозе значительно ниже, чем при физиологически протекающей беременности.

Предложенный метод позволяет изучить общую концентрацию комплексов белков семейства макроглобулинов, а именно МГ PAG или РАРР-А с иммуноглобулинами класса G, а также концентрацию комплексов вышеперечисленных белков с аутоантителами класса G и противоуглеводными антителами данного класса. Использование высокоочищенного нативного иммуноглобулина класса G в качестве калибратора позволяет значительно повысить точность и, как следствие, эффективность предложенной методики. Введение сахаров в буфер для разведения образцов позволяет определить истинную концентрацию иммунных комплексов макроглобулинов с аутоантителами. Параллельное исследование как общей концентрации иммунных комплексов МГ, PAG или РАРР-А с IgG, так и комплексов с аутоантителами позволяет провести дифференцированную оценку соотношения иммунных комплексов с аутоантителами и противоуглеводными антителами в различных образцах биологических жидкостей, что может иметь особое значение при изучении патологий углеводного обмена или аутоиммунных заболеваний.

Данная методика внедрена в Центральной научно-исследовательской лаборатории Новокузнецкого ГИДУВа. Проверка тест-системы на специфичность не выявила перекрестных реакций с наиболее широко распространенными аффинантами к белкам семейства макроглобулинов. При проверке воспроизводимости результатов коэффициент вариации не превышал 10%. Обследовано 100 практически здоровых людей различного пола и возраста, 50 женщин с физиологически протекающей беременностью и 45 женщин с диагнозом гестоз различной степени тяжести. Чувствительность метода при дифференцированной диагностике гестоза легкой степени тяжести достигала 73,7%, при дифференцированной диагностике тяжелого гестоза - 61,1%.

Изобретение относится к области медицины, а именно к клинической иммунологии. Сущность изобретения состоит в том, что определяют общую концентрацию иммунных комплексов (ИК) и концентрацию комплексов с аутоантителами класса G и по их разнице находят концентрацию комплексов с противоуглеводными антителами, причем в качестве первичных антител используют аффинно-очищенные поликлональные кроличьи антитела против белка семейства макроглобулинов, в качестве калибратора берут высокоочищенный нативный человеческий иммуноглобулин класса G, при определении общей концентрации ИК используют забуференный физиологический раствор рН 7,4 с 150 мМ NaCl и 0,05% неионного детергента Твина-20, а для определения комплексов с аутоантителами класса G в буфер для разведения образцов добавляют смесь из сахаров: лактозу в количестве 0,1 Моль и маннозу в количестве 0,5 Моль. Технический результат изобретения заключается в создании высокоточного, дифференциального и достаточно эффективного способа определения концентрации комплексов белков семейства макроглобулинов-антитело в биологических жидкостях.

Антиген-специфический способ определения иммунных комплексов белков семейства макроглобулинов с иммуноглобулином класса G в биологических жидкостях с использованием иммуноферментного анализа, включающий связывание циркулирующих иммунных комплексов с антителами на поверхности полистероловых планшетов, отличающийся тем, что определяют общую концентрацию иммунных комплексов и концентрацию комплексов с аутоантителами класса G и по их разнице находят концентрацию комплексов с противоуглеводными антителами, причем в качестве первичных антител используют аффинно-очищенные поликлональные кроличьи антитела против белка семейства макроглобулинов (МГ, PAG или РАРР-А), в качестве калибратора берут высокоочищенный нативный человеческий иммуноглобулин класса G, при определении общей концентрации иммунных комплексов в качестве буфера для разведения образцов используют забуференный физиологический раствор рН 7,4 с 150 мМ NaCl и 0,05% неионного детергента Твина-20, а для определения комплексов с аутоантителами класса G в буфер для разведения образцов добавляют смесь из cахаров: лактозу в количестве 0,1 Моль и маннозу в количестве 0,5 Моль.