СПОСОБ ИССЛЕДОВАНИЯ МЕХАНОХИМИЧЕСКИХ ПЕРЕХОДОВ ОЛИГОМЕРНЫХ ФЕРМЕНТОВ С ПОМОЩЬЮ АКУСТИЧЕСКОГО РЕЗОНАНСА Российский патент 1999 года по МПК C12N13/00 

Данное изобретение относится к области биофизической химии. Оно может быть применено для целенаправленного поиска и исследования надмолекулярных биологических структур (олигомерные мембранносвязанные ферменты и их комплексы, рецепторы гормонов и т.д.), претерпевающих колебательные механохимические изменения конформации. Также данное изобретение может служить инструментом для исследования неспецифической (вне органов чувств) рецепции звуковых колебаний живыми организмами.

Хорошо известны многочисленные способы исследования твердых тел, жидкостей и гетерофазных систем (в том числе и биологических объектов) с помощью акустических волн. При этом чаще всего применяется ультразвук. Однако исследуемым объектом являются либо химические соединения, либо биологические объекты (органы человеческого и животного организмов, плоды, волокна растений). Однако остаются не охваченными такие области организации живой материи, как субклеточный и надмолекулярный. Применяемый в этих областях ультразвук [1] используется в основном как способ избирательной деструкции материала. Исследования механохимических переходов олигомерных ферментов до сих пор проводилось с помощью различных физико-химических методов, являющихся весьма дорогостоящими и, подчас, трудно интерпретируемыми.

Целью настоящего изобретения является демонстрация возможности изучения механохимических переходов олигомерных ферментов с помощью акустического резонанса (в области слышимого звука), позволяющее выявить и охарактеризовать некоторые нетривиальные особенности механизма катализа с помощью относительно простой постановки исследования.

Для достижения данной цели в качестве объекта исследования была выбрана F₁-F₀ АТРаза (АТР синтетаза) в составе субмитохондриальных частиц (протеолипидных замкнутых пузырьках). F₁-F₀ АТРаза представляет собою белок, состоящий из двух олигомерных доменов: F₁-каталитического, обращенного в водную фазу (м.в. - 340 кДа), и мембранного (протонного канала F₀), соединенных субдоменом "ножки" "[2]. Данный фермент осуществляет сопряжение между векторным трансмембранным переносом протонов и скалярным синтезом (гидролизом) АТР, являясь в живых организмах основным ферментом образования соединения с высоким потенциалом (Гиббса) переноса фосфорильной группы. Для F₁-F₀ АТРаза продемонстрированы связанные с катализом конформационные переходы, природа которых в настоящее время окончательно не установлена и является предметом интенсивных исследований и дискуссий [3]. В соответствии с принципом Кюри о невозможности в изотропной среде сопряжения процессов, являющихся тензорами разного ранга, конформационные переходы F₁-F₀ АТРазы должны выражаться в векторном изменении олигомерной структуры. Исходя из строения фермента и ряда косвенных данных таковыми изменениями могут быть и процессы сближения (удаления) водорастворимого домена F₁ с (от) мембранной части. Изменения конформации F₁-F₀ АТРазы связаны с катализом, лимитирующая стадия которого - высвобождение прочносвязанного АТР, образующегося на молекуле фермента изоэнергетически [3]. Лимитирующая стадия in vivo зависит от электрохимического потенциала протонов [4] . Максимальное число оборотов F₁-F₀ АТРазы, а следовательно, и частота конформационных переходов составляет около 10⁴ мин^-1 [5]. При осуществлении вынужденных колебаний фермента с помощью звуковой волны возможно имитировать валовый каталитический цикл фермента, когда за счет энергии звука при резонансной частоте будет высвобождаться синтезированный на молекуле фермента АТР за счет изменения сродства к продукту при конформационных переходах. Использование F₁-F₀ АТРазы в составе субмитохондриальных частиц позволяет рассматривать фермент как фактически иммобилизованный на носителе - мембранном пузырьке. Вследствие этого и разницы в радиусах Стокса (-250 нм у субмитохондриальных частиц против ~5 нм у F₁) достигается относительная инерционность при колебаниях F₁ части АТРазы относительно мембранносвязанного домена F₀.

Описание изобретения. Схема акустического стенда представлена на фиг. 1. Он состоял из генераторов сигналов (использовали синусоидальную форму) Г6-27 (1), усилителя У7-1 (2), динамика (3) и экспериментальной кюветы (4). Кювета представляла собою замкнутый сосуд в виде шайбы: объем - 0,16 л, диаметр - 100 мм. Дно и стенки кюветы - стеклянные, толщина - 2 мм. Верхняя крышка изготовлена из полистирола, толщина - 1,4 мм. Утечка раствора предотвращалась за счет прокладки и прижимного приспособления. Кювету неподвижно закрепляли за прижимное приспособление над динамиком на двух штативах так, что оси динамика и кюветы совпадали, и расстояние от дна кюветы до верхнего края динамика не превышало 15 мм. Кювету заполняли полностью раствором следующего состава: 0,08 мг (по белку) на мл субмитохондриальных частиц; 0,25 М сахароза; 0,1 М KCl; 20 мМ KH₂PO₄, pH=8,0; 5 мМ MgCl₂; 1 мМ ADP; 0,1 мМ ЭДТА; 1 мг/мл бычьего сывороточного альбумина; 3 мкМ ротенон; 1,5 мМ NADP; 10 мМ глюкоза; 30 ФЕ/мл гексокиназы; 10 ФЕ/мл глюкозо-6-фосфат дегидрогеназы. Субмитохондриальные частицы (AS-типа), выделяли стандартным способом из сердца быка [6]: содержание F₁-F₀ АТРазы - 0,4 нмоль на мг белка [5]. Кювету озвучивали в течении 30 минут при различных частотах и максимальной интенсивности (t=20^oC, повышения температуры при озвучивании не наблюдалось). Образование АТР регистрировали по возрастанию оптической плотности при 340 нм вследствие сопряженного с образованием АТР восстановления NADP⁺. Для учета фонового значения образования АТР вследствие миокиназной реакции часть среды оставляли в качестве контроля вне экспериментальной комнаты. График зависимости валовой скорости образования АТР от частоты звука представлен на фиг. 2. Как видно из представленных данных, скорость синтеза АТР за счет энергии звуковой волны имеет две гармоники приблизительно в области 170 и 320 Гц (максимальные значения скоростей - 10 и 8 нмоль АТР в минуту на мг белка, соответственно).

Найден способ исследования механохимических переходов (конформационных превращений) надмолекулярных белковых комплексов (олигомерных ферментов) с помощью акустической волны, при этом
1) для исследования данного уровня организации живого вещества впервые применен звук в области частот до 500 Гц;
2) использовано явление резонанса на действие акустической волны в качестве источника вынужденных колебаний;
3) предложен простой способ отслеживания резонансных конформационных колебаний по каталитической активности ферментов.

Пример: При приготовлении стандартной среды для измерения образования АТР энзиматическим способом (см. выше) субмитохондриальные частицы вносили в реакционную среду в последнюю очередь. Далее заполняли реакционную кювету полностью так, чтобы не оставалось пены. Часть экспериментального раствора оставляли вне бокса с акустическим стендом, следя за равенством температур опытного и контрольного образца. Перед самым началом озвучивания измеряли оптическую плотность раствора при длине волны - 340 нм. Далее немедленно (задержка не более 10 секунд) начинали озвучивание при определенной частоте. После озвучивания немедленно (задержка не более 10 секунд) измеряли оптическую плотность при 340 нм в экспериментальном и контрольном образцах. По разнице рассчитывали скорость образования АТР, нормируя ее к концентрации белка СМЧ. Таким образом, на фиг. 2 представлена (фактически зависимость кажущихся чисел оборота фермента от частоты акустической волны. Учитывая содержание F₁-F₀ в субмитохондриальных частицах, число оборотов АТР синтетазы, индуцируемой акустической волной, составляет ~2 с^-1 при частоте звука около 170 Гц.

Источники информации.

1. Эльпинер И.Э. (1973) Биофизика ультразвука, М., Наука.

2. Walker J.E., Collinson 1.R. (1994) FEBS Lett., 346, 39-43.

3. Boyer P.D. (1993) Biochim. Biophys. Acta, 1140, 215-250.

4. Сыроешкин А. В., Галкин М.А. (1997) 2 съезд биохим. обществ РАН. Тезисы симпоз. докладов, 72. Пущино.

5. Сыроешкин А.В. (1996) Диссерт. соиск. уч. степени канд. биол. наук., М., МГУ.

6. Kotlyar А. В., Vinogradov A.D. (1990) Biochim. Biophys. Acta, 1019, 151-158.

Изобретение относится к области биофизической химии. Для олигомерного мембранносвязанного фермента F1-F0 АТРазы в составе субмитохондриальных частиц продемонстрирован способ изучения конформационных переходов в ходе катализа, необходимых in vivo для осуществления сопряжения векторного переноса протонов и скалярной реакции синтеза АТР. В соответствии с принципом Кюри о невозможности сопряжения процессов, являющихся тензорами разного ранга, наиболее вероятным событием в ходе данных конформационных изменений F1-P0 АТРазы (сопровождающихся изменением сродства к субстратам/продуктам реакции) будет процесс взаимного сближения/удаления факторов F1 и F0. В подтверждение колебательных конформационных движениях доменов АТРазы показана возможность валового синтеза АТР (в отсутствии генератора) при использовании в качестве синусоидальной внешней силы акустической волны. Для этого использовался стандартный акустический стенд, включающий генератор сигналов, усилитель, динамик и специально изготовленный в виде шайбы экспериментальной кюветы с раствором, содержащим субмитохондриальные частицы и субстраты АТР синтетазной реакции. Регистрацию индуцируемого акустической волной синтеза АТР проводили стандартным энзиматическим способом по восстановлению NADP⁺ с помощью сопряженных гексокиназной и глюкозо-6-фосфат дегидрогеназной реакций. Зависимость скорости синтеза АТР от частоты звука имела два максимума (гармоники) приблизительно в области 170 и 320 Гц с соответствующими значениями скоростей 10 и 8 нмоль АТР в минуту на мг белка субмитохондриальных частиц. 2 ил.

Способ исследования механохимических переходов олигомерных ферментов, заключающийся в применении явления резонанса на действие акустической волны в качестве источника вынужденных колебаний надмолекулярного белкового комплекса в области частот звука до 500 Гц.