СПОСОБ УСИЛЕНИЯ ДЕЙСТВИЯ УЛЬТРАЗВУКА ПРИ ЛЕЧЕНИИ ГИПЕРТЕРМИЕЙ ОПУХОЛЕВЫХ ТКАНЕЙ ПУТЕМ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ НАНОКЛАСТЕРОВ КРЕМНИЯ Российский патент 2012 года по МПК A61N7/00 A61B18/04 A61N7/02 B82B1/00 A61K33/00 A61P35/00 

Изобретение относится к медицине, в частности к онкологии, и может быть использовано для селективного разрушения раковых клеток и опухолевых тканей.

Из уровня медицины хорошо известны технические решения аналогичного характера.

Так, из уровня медицины известной является система фокусированного воздействия ультразвуком высокой интенсивности для сканирования и лечения опухолей, раскрытая в описании патента РФ №2210409, A61N 7/02, A61F 7/00, 18.12.1998. Изобретение относится к медицинской технике, а именно к терапевтическим аппаратам для сканирования и лечения гипертермией опухолевых тканей внутренних органов. Система фокусированного ультразвука (УЗ) высокой интенсивности для сканирования и лечения опухолей состоит из комбинированного датчика, источника энергии высокой интенсивности, ультразвукового сканера в В-режиме, многомерного устройства перемещения с цифровым управлением, вакуумного дегазатора, терапевтической кушетки и компьютерной системы управления. Комбинированный датчик состоит из УЗ-головки В-режима и терапевтической головки, которая генерирует ультразвук с терапевтическим воздействием, при этом ее излучающий ультразвук конец установлен на многомерном аппарате перемещения, который осуществляет сканирующее перемещение снаружи плоскости тела под управлением компьютера. Изобретение позволяет повысить эффективность лечения опухолей внутренних органов за счет точности наведения и размещения терапевтической головки.

Также из уровня медицины известным является способ локального нагрева внутренних тканей человеческого тела, раскрытый в описании заявки РФ №2006107055, A61N 5/067, 09.03.2006 и предназначенный для селективной гипертермии и абляции злокачественных новообразований, лечения злокачественных опухолей, располагающихся внутри тела больного воздействием электромагнитного излучения, отличающийся тем, что при этом в качестве излучателя используют один или более одного лазерного источника строго определенной длины волны, а также обеспечивают концентрирование излучения в требуемой области человеческого тела посредством фокусировки или одновременным направлением нескольких потоков излучения в один заданный ограниченный объем, при этом обеспечивают условия, при которых нагрев окружающих тканей будет незначителен.

Кроме того, известным является способ подавления роста опухолей, раскрытый в патенте РФ №2339414, A61N 5/067, B82B 1/00, A61K 31/41, A61K 33/30, A61K 33/34, A61P 35/00, 27.03.2007. Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано при лечении злокачественных опухолей. Сущность заявляемого способа заключается в том, что внутривенно вводят наночастицы фталоцианинов в дозе не ниже 5 мг/кг веса и не выше максимально переносимой дозы с последующим облучением опухоли лазерными импульсами с длиной волны в области интенсивного поглощения наночастиц при плотности энергии в импульсе не ниже 0,1 Дж/см² и суммарной плотности энергии не ниже 10 Дж/см². Использование наночастиц фталоцианинов в указанных условиях позволяет повысить эффективность лечения злокачественных опухолей по сравнению с применявшимися ранее наночастицами углерода благодаря более высокому коэффициенту поглощения наночастиц фталоцианинов.

Также известным является способ получения магниточувствительных липосом, раскрытый в описании патента РФ №2357724, A61K 9/127, A61K 9/51, A61K 33/26, A61K 35/12, 22.10.2007.

Изобретение относится к области медицины - онкологии (а также генной инженерии, биохимии) - и касается способов получения магниточувствительных липосомальных систем доставки лекарственных веществ с контролируемым высвобождением. Способ получения магниточувствительных липосом, содержащих лекарственное средство, включает растворение фосфолипидов в хлороформе, добавление носителя магнитных свойств и воздействие ультразвуком, при этом в качестве источника фосфолипидов используют барсучий жир, в качестве носителя магнитных свойств используют ферромагнитный нанопорошок металла, полученный газофазным способом, с размером частиц 2-5 нм, заключенный в углеродную оболочку, и стерилизуют липосомальную систему в камере бетатрона.

Кроме того, из уровня медицины известны технологии аналогичного назначения, раскрытые в описаниях зарубежных охранных документов, например, WO 2009013630, CN 101264191, US 7510555, US 7448389, US 7371781, US 7309316, US 7229973 и др.

В качестве наиболее близкого аналога может быть рассмотрен способ селективного разрушения меланомы, раскрытый в описании к патенту РФ №2347563, A61K 31/195, A61P 35/00, A61N 5/067, B82B 1/00, 21.11.2007. Изобретение относится к медицине, в частности к наномедицине и онкологии, и может быть использовано для селективного разрушения меланомы. Способ включает введение до облучения внутривенно раствора химического соединения аминокислоты L-фенилаланина с золотыми или серебрянными наночастицами. При этом минимальная концентрация наночастиц 10⁸ см^-3 и максимальная концентрация 10¹² см^-3. Плазменный резонанс наночастиц имеет спектральный максимум в области прозрачности биотканей на длине волны 750-1200 нм. Данные наночастицы представляют собой золотые или серебрянные нанооболочки с ядром из двуокиси кремния или наностержни. Облучение меланомы проводят не менее чем через 1 час и не более чем через 4 часа после введения раствора, лазерным пучком с длиной волны излучения, совпадающей со спектральным максимумом поглощения плазменного резонанса наночастиц. При этом облучение производят последовательностью лазерных импульсов с длительностью лазерного импульса в диапазоне 10 мкс - 100 нс при минимальной скважности три и более, при плотности энергии не менее 20 Дж/см², но не более 200 Дж/см². Способ позволяет локально проводить разрушение меланомы при минимальном разрушении окружающих здоровых клеток.

Недостатками приведенных аналогов являются следующие:

- во-первых, при использовании методов гипертермии с применением ультразвука практически невозможно избежать поражения здоровых клеток организма при сколь угодно высоком уровне фокусирования ультразвуковых колебаний;

- во-вторых, надежная доставка нанокластеров в месторасположение раковых клеток с использованием кровотока требует достаточно большой концентрации вводимого раствора, что может привести к побочным эффектам, обусловленным токсичностью материала, использованного для производства нанокластеров;

- в-третьих, использование электромагнитного излучения оптического диапазона для активации нанокластеров и достижения гипертермического эффекта не позволяет проводить разрушения объемных опухолей на глубинах более 1 мм ввиду ограниченной глубины поглощения данного излучения в биологических тканях.

Задачей, на решение которой направлено предлагаемое изобретение, является снижение риска повреждения здоровых клеток организма и повышение уровня надежности уничтожения раковых клеток при использовании биосовместимых растворов нанокластеров кремния, активируемых воздействием ультразвукового излучения.

При реализации данного изобретения достигаются несколько результатов, один из которых заключается в снижении требуемого уровня мощности источника ультразвуковых колебаний, используемых для повышения температуры раковых клеток, а другой - в адресной локализации нагрева, осуществляемого за счет осцилляции под действием ультразвука нанокластеров кремния, внедренных в раковую клетку.

Определенное место в лечении злокачественных новообразований различных локализаций занимают методы, обеспечивающие локальное значительное повышение температуры опухоли, способствующее уничтожению раковых клеток (hyperthermia).

Экспериментально установлено, что цитотоксический эффект, обусловленный термической инактивацией протеинов и повреждением цитоплазматических мембран, развивается в температурном критическом интервале 42,5-43°C.

Из-за патологического строения сосудов злокачественных опухолей при повышении ее температуры не только полностью отсутствует увеличение скорости и объема кровотока и связанное с этим увеличение теплоотдачи, а наоборот, развиваются сосудистый стаз и многочисленные тромбозы, и, как следствие, значительное повышение температуры. В противоположность этому в нормальных тканях скорость перфузии и вместе с ней теплоотдача линейно возрастает с ростом температуры. Именно этот феномен и определяет избирательность (селективность) перегрева опухолевых тканей по сравнению с нормальными. Нарушение кровотока в солидных опухолях и хроническая гипоксия значительно повышают термочувствительность опухолевых клеток, и уже при температуре 43,5°C, к которой толерантны нормальные ткани, происходят необратимые повреждения клеток опухоли.

Выявлены и дополнительные возможности так называемого терапевтического ультразвука (УЗ), давно и успешно используемого в различных областях медицины [1].

Терапевтическое действие ультразвука обусловлено его поглощением тканями организма. При этом взаимодействии энергия ультразвука в основном трансформируется в тепло, энергию поля сдвиговых напряжений стационарных акустических течений, а также в небольшой степени расходуется на образование и активизацию газовых или паровых пузырьков (кавитация) и для больших полимерных молекул на нетепловые специфические эффекты (в основном механические). Каждый из приведенных путей трансформации ультразвуковой энергии в той или иной степени может быть использован для получения терапевтических эффектов. В результате локального выделения тепла в тканях активируются обменные процессы, ускоряется рассасывание инфильтратов, увеличивается проницаемость клеточных мембран. Последнее обстоятельство облегчает поступление в клетку лекарственных веществ. Акустические течения также интенсифицируют обменные процессы и облегчают лекарственный транспорт в очаг поражения.

Преимуществом ультразвукового метода нагрева опухолей является возможность локализации нагреваемой области.

К настоящему времени за рубежом создано большое количество разнообразных аппаратов для ультразвуковой гипертермии, в том числе наружных с несколькими источниками излучения и использованием фокусировки акустического потока, а также внутриполостных в виде зондов или трубок.

Механизмы противоопухолевых эффектов ультразвука могут быть связаны не только с его чисто тепловым воздействием за счет поглощения энергии УЗ в тканях, но и с механическим действием (в частности, кавитацией), повышением проницаемости клеточных мембран и т.д.

Совместное использование УЗ-воздействия с химиотерапией приводит к существенному усилению противоопухолевого действия этих агентов.

В настоящее время ведется интенсивная разработка методов адресной доставки лекарственных препаратов с использованием наноматериалов, их применение при диагностике и лечении онкологических заболеваний.

С этой точки зрения нанокластеры кремния являются уникальным материалом.

Предлагаемый метод лечения состоит во введении в клетки опухоли кремниевых нанокластеров и локального воздействия УЗ для возбуждения колебательных движений последних с амплитудой, достаточной для повышения температуры окружающей среды до гипертермического уровня и механического повреждения раковой клетки.

Далее приведены основные результаты экспериментальных исследований, подтверждающих возможность решения поставленной задачи.

Порошки кремниевых нанокластеров (nc-Si) могут быть изготовлены либо электрохимическим травлением пластин кристаллического кремния в растворах на основе плавиковой кислоты до получения пленок мезопористого кремния (мезо-ПК) с последующим их механическим измельчением, либо механическим измельчением поликристаллических порошков кремния при высокоэнергетичном помоле в водной среде с использованием шаровой мельницы [2].

Для получения водных суспензий nc-Si осуществляется тридцатиминутный помол пленок мезо-ПК в планетарной мельнице в присутствии дистиллированной воды (15 актов измельчения по 2 минуты с 2-минутными перерывами между каждыми актами).

Исследованиям токсикологической безопасности наночастиц в биомедицинских исследованиях уделяется повышенное внимание [3, 4].

В [5], например, описано, что при попадании наночастиц в кровоток возможен их транспорт через все тело и накопление в конкретных органах. Здесь же отмечено, что если в организм попадает биорастворимый кремний, то он легко выводится в виде ортокремниевой кислоты.

Авторами работы [6] проведено исследование генотоксической и тератогенной активности кремниевых нанокластеров in vivo. Препараты, содержащие порошок nc-Si в виде пористых гранул с размерами около 1 мкм, состоящих из nc-Si размерами 2-5 нм в водной взвеси, вводили внутрибрюшинно крысам в дозах 5, 25 и 50 мг/кг. Исследуемый материал не показал цитогенетической активности в клетках костного мозга мышей после 24-часовой, 7 и 14-дневной экспозиции в организме животных после однократного введения. При оценке поведения 30-дневных крысят в тесте «открытое поле» было установлено, что самки потомства экспериментальной серии исследования характеризовались по сравнению с контролем достоверно высокими значениями горизонтальной двигательной и познавательной активности, достоверно низким показателем эмоциональности. В свою очередь, самцы характеризовались достоверно высокими показателями груминга и эмоциональности по сравнению с контрольной группой.

Таким образом, в проведенных ранее исследованиях не выявлено цитогенетических и тератогенных эффектов nc-Si in vivo, показана их незначительная генотоксическая активность в клетках костного и головного мозга. Представленные результаты характеризуют nc-Si как биосовместимый наноматериал.

С целью моделирования эффективности применения кремниевых нанокластеров для повышения внутриклеточной температуры до гипертермического уровня при меньшей мощности ультразвука авторами проведены сравнительные исследования зависимости температуры при озвучивании воды и водного раствора нанокластеров кремния. С этой целью в ультразвуковую ванну (УЗВ6-0,063/37) помещались два сосуда: один с водой (контрольный образец), другой - с водной суспензией nc-Si с концентрацией 1 г/л (испытуемый образец).

В начальный момент времени температура в обоих сосудах была одинакова. Измерение температуры производилось через каждые 5 минут в течение одного часа. Частота ультразвукового излучения 35 кГц, средняя мощность 2 Вт/см².

На фиг.1 представлены зависимости температуры от времени воздействия УЗ-излучения на воду (кривая 1), а также на водную суспензию nc-Si с концентрацией 1 г/л (кривая 2).

Больший нагрев суспензий nc-Si по сравнению с контролем обусловлен как тем, что кремниевые нанокластеры могут выступать в качестве центров локального нагрева вследствие как возникновения кавитации, так и трения между нанокластерами и водой.

Таким образом, наличие нанокластеров кремния в исследуемой суспензии при воздействии ультразвукового озвучивания увеличивает температуру окружающей их среды на 2-3°C или, что эквивалентно, температура гипертермического уровня может быть достигнута при меньшей мощности излучения.

Далее представлены результаты предварительных биомедицинских экспериментальных исследований действия ультразвука и кремниевых нанокластеров на раковые клетки in vitro.

Исследуемая культура - клетки рака легкого человека. Культуральная среда - DME, 10% фетальной сыворотки, 5% CO₂, антибиотики.

Источник ультразвукового озвучивания исследуемой культуры - ультразвуковая ванна УЗВ6-0,063/37.

Измерительное оборудование - проточный цитофлуориметр PAS III (Partec, Germany).

На фиг.2 представлены зависимости числа клеток рака легкого человека от времени после получасового воздействия УЗ в контрольной группе (кривая US) и в испытуемой группе с добавлением суспензии nc-Si в концентрации 1 г/л (кривая nc-Si).

Как видно, после получасового сеанса озвучивания исследуемых клеток контрольной группы показали сохранение жизнеспособности и способность к пролифирации.

Когда же сосуд Карреля с раковыми клетками в свежей культуральной среде, но с добавлением 5 мг nc-Si (итоговая концентрация 1 г/л), помещали в ту же зону объема ванны УЗВ6-0,063/37, то после получасового сеанса озвучивания, микроскопическим изучением ростовой поверхности Карреля и культуральной среды, размножения раковых клеток не обнаружено ни на поверхности Карреля, ни в культуральной среде.

Представленные выше данные могут означать, что клетки после озвучивания в присутствии nc-Si получили дефекты (повреждения), препятствующие их размножению (пролиферации).

В пользу предположения о наличии дефектов свидетельствуют также измеренные распределения озвученных культур по фазам клеточного цикла.

На фиг.3 представлено распределение числа клеток рака легкого человека по фазам клеточного цикла в контрольной группе до УЗ-воздействия. Здесь G1 - клетки с диплоидным набором хромосом (G1 фаза клеточного цикла), G2 - клетки с тетраплоидным набором хромосом (G2+M фазы клеточного цикла).

На фиг.4 представлено распределение числа клеток рака легкого человека по фазам клеточного цикла в контрольной группе после УЗ-воздействия.

На фиг.5 представлено распределение числа клеток рака легкого человека по фазам клеточного цикла в испытуемой группе (с добавлением nc-Si) после УЗ-воздействия.

Можно заметить, что график на фиг.4 почти полностью соответствует исходному графику распределения, представленному на фиг.3.

В то же время на графике фиг.5 хорошо видны искажения стандартного распределения, которые появляются после озвучивания культуры в присутствии nc-Si.

Принципиально, эти отклонения могут быть вызваны кавитацией или какими-либо другими процессами, инициируемыми nc-Si и воздействием УЗ.

Возникновение кавитации вблизи клеток механически срывает их с поверхности субстрата и уничтожает (насильственная гибель клеток). Однако у оставшихся клеток не выявлено при этом повреждений (о чем говорит последующий рост культуры и фазовый состав).

Присутствие nc-Si увеличивает эффективность насильственной гибели клеток.

При этом сочетанное действие nc-Si и УЗ вызывало повреждения клеток, которые инициируют гибель клеток по механизму апоптоза.

С учетом полученных in vivo и in vitro экспериментальных данных рассмотрим вариант реализации предлагаемого способа, ни в коей мере не ограничивающий другие варианты его реализации.

До ультразвукового облучения в кровеносную систему организма вводят водный раствор кремниевых нанокластеров размером 1-5 нм в дозах 10-30 мг/кг. С учетом известных данных о скорости транспорта вещества в кровеносной системе ультразвуковое облучение раковых тканей производят не ранее чем через 1 час и не позднее чем через 4 часа после введения раствора. Ультразвуковое облучение производят в течение 1 часа непрерывным озвучиванием раковых тканей.

В качестве ультразвукового преобразователя может быть использован пьезокерамический преобразователь с амплитудой давления на поверхности 2-4 МПа и с интенсивностью в фокусе 5-7 Вт/см², работающий в диапазоне 2-4 МГц.

Также могут быть использованы пьезокомпозитные преобразователи, состоящие из маленьких пьезокерамических преобразователей, пространство между которыми заполнено полимерным материалом [1].

Таким образом, полученные в экспериментах in vitro данные свидетельствуют об эффективности предложенного способа разрушения раковых клеток при использовании ультразвуковой гипертермии и введенных в них кремниевых нанокластеров.

Источники информации

1. М.Р.Брейли, В.А.Хохлова и др. Физические механизмы воздействия терапевтического ультразвука на биологическую ткань. Акустический журнал, т.49, №4, 2003. 437-464.

2. L.T.Canham. Nanoscale semiconducting silicon as a nutritional food additive. Nanotechnology 18. 2007. 185707-6.

3. E.E.Connor, J.Mwamuka, A.Gole, C.J.Murphy, M.D.Wyatt. Gold nanoparticles are taken up by human cells but do not cause acute cytotoxicity. Small 1. 2005. 325-327.

4. M.C.Garnett, P.Kallinteri. Nanomedicines and nanotoxicology: some physiological principles. Occup. Med. 56. 2006. 307-311.

5. J.Wang et al. Acute toxicity and biodistribution of differently sized titanium dioxide particles in mice after oral administration. Toxicol. Lett. 168. 2007. 176-185.

6. А.Д.Дурнев, A.C.Соломина и др. Исследование генотоксической и тератогенной активности нанокристаллов кремния. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, т.148. №4. 2010. 429-433.

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для усиления действия ультразвука при лечении гипертермией опухолевых тканей. Для этого в опухолевую ткань посредством кровотока вводят водный раствор кремниевых нанокластеров. Затем проводят адресную локализацию нагрева клеток опухолевых тканей и их механическое повреждение посредством ультразвуковой гипертермии. Способ позволяет локально проводить разрушение раковых тканей при минимальном разрушении окружающих здоровых клеток в эксперименте. 5 ил.

Способ усиления действия ультразвука при лечении гипертермией опухолевых тканей, включающий адресную локализацию нагрева клеток опухолевых тканей и их механическое повреждение, для чего в опухолевую ткань посредством кровотока вводят водный раствор кремниевых нанокластеров.