СПОСОБ ИССЛЕДОВАНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ И УСТРОЙСТВО ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ Российский патент 1999 года по МПК G01N33/48 G01N1/28 

Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к области медицины и биологии, может быть использовано для лабораторных исследований мазков крови, биологических жидкостей и суспензий, для распознавания и измерения диагностических характеристик цитологических препаратов. Изобретение найдет применение при проведении научных работ, биофизических экспериментов. Особенно целесообразно его использование при массовых гемоцитологических анализах.

Уровень техники
Известны способ и устройство распознавания и измерения диагностических характеристик цитологических препаратов по патенту РФ 2088922, C1 (Медовый и др.), 27.08.97, G 01 N 33/48, позволяющие проводить анализ биологических материалов, в частности, распознавать увеличенные изображения клеток мазка периферической крови. Способ заключается в изготовлении мазка на предметном стекле, размещении его в поле зрения микроскопа посредством манипулятора стекол, съеме телевизионного сигнала, приведении его в цифровую форму и обработке цифрового изображения посредством анализатора клеточного изображения. Однако при осуществлении этого способа для анализа каждого цитологического препарата требуется установка каждого предметного стекла с использованием манипулятора, настройка фокусного расстояния оптической системы либо вручную, либо с применением сложной и дорогостоящей системы автофокусировки. Предметное стекло сложно разместить строго перпендикулярно к оптической оси объектива микроскопа. В результате при перемещении столика микроскопа изменяется расстояние от поверхности стекла до объектива и возникает необходимость настройки оптической системы от образца к образцу.

Наиболее близким аналогом является способ по патенту США 4887892, A (BACUS), 19.12.89, G 02 B 21/08, который позволяет проводить анализ мазков крови визуально, получать изображения исследуемого биологического материала с помощью телевизионной камеры, анализировать и запоминать результаты анализа с помощью компьютерной системы. Мазок исследуемого материала согласно способу наносится на предметное стекло, которое затем устанавливается вручную или с помощью манипулятора на устройство для подачи мазков в зону исследований на оптически прозрачную платформу. С противоположной стороны (под платформой) размещена система формирования светового луча, включающая источник света, регулируемую ирисовую диафрагму и систему линз. Проба на предметном стекле освещается, свет попадает в линзу объектива микроскопа, затем через призму поступает на телевизионную камеру или на светочувствительный датчик, а также к окулярам микроскопа. Увеличенное изображение образца таким образом можно наблюдать визуально, преобразовать в аналоговый электрический сигнал на выходе датчика и получить и записать телевизионную картину. Аналоговый сигнал с датчика преобразуется в цифровой и отражает в этой форме количественные характеристики гемоглобина или иных составляющих исследуемого образца. Этот известный способ также не позволяет провести полную автоматизацию аналитического процесса. Требуется замена предметных стекол, настройка и фокусировка оптического оборудования и телевизионной системы. Поэтому анализ большого числа образцов с его использованием требует больших временных затрат, при этом затруднительно отрегулировать положение предметного стекла с целью обеспечения ортогональности оптической оси микроскопа к его поверхности.

В части устройства в качестве ближайшего аналога можно принять устройство для транспортировки партии мазков, используемое в микроскопе по патенту США 4836667, (Ozeki), 06.06.89, G 02 B 21/26. Это устройство содержит прозрачное подвижное основание, средство для размещения партии мазков и средство для перемещения партии мазков. Однако это устройство не может быть использовано в автоматическом режиме, требует ручного перемещения предметных стекол с мазками, с его помощью нельзя обрабатывать мазки, нанесенные на ленту, оно требует перемещения в поперечном направлении и дополнительной фокусировки оптической системы. Производительность клеточного анализа с его помощью низка, а точность проведения анализа невысокая.

Сущность изобретения
Настоящее изобретение решает задачу создания высокопроизводительного способа анализа биологических материалов, позволяющего провести автоматизацию процесса исследования с одновременным повышением объективности и точности анализа.

Технический результат заключается в повышении производительности труда врача-лаборанта при одновременном повышении качества и объективности лабораторного исследования цитологических препаратов.

Дополнительный технический результат заключается в повышении надежности и экономичности анализа большого числа мазков (100 - 200 и более).

Дополнительный технический результат состоит в том, что устраняется необходимость иметь дорогостоящую систему автофокусировки, поскольку конструкция устройства транспортировки мазков обеспечивает прохождение пленки строго на глубине фокусного расстояния от объектива.

Технический результат достигается за счет того, что в способе исследования биологических материалов, заключающемся в изготовлении мазков биологического материала, размещении их в зоне исследования и осуществлении клеточного анализа, мазки биологических материалов изготавливают путем нанесения на гибкую прозрачную ленту, начало каждого последующего мазка осуществляют преимущественно через равные интервалы от начала предыдущего, наматывают ленту на подающую кассету, размещают на устройстве для транспортировки мазков в зону исследований и осуществляют последовательную подачу мазков в зону исследований, при этом в пределах одного мазка осуществляют медленную подачу ленты для поиска характерного цитологического изображения.

В качестве ленты используют лавсановую пленку.

В качестве ленты используют ацетилцеллюлозную пленку.

Для подачи ленты в поле зрения микроскопа используют шаговый двигатель.

Осуществляют медленную подачу ленты в пределах одного мазка в области, отстоящей от его начала на 2/3 - 3/4 длины мазка.

Устройство для транспортировки партии мазков биологических материалов в зону исследований, содержит подвижный корпус, размещенные на нем средства для размещения партии мазков и средства для перемещения партии мазков, корпус в нем снабжен крышкой, к которой подпружинены прижимные валики, а средства перемещения партии мазков выполнены в виде двух подающей и приемной кассет, установленных на валах с возможностью синхронного вращения и перемещения ленты с нанесенной на ней партией мазков через кювету, установленную в сквозном отверстии корпуса и заполненную иммерсионным маслом, при этом дно кюветы выполнено из оптически прозрачного материала, на выходе кюветы со стороны приемной кассеты размещен валик для отжима иммерсионного масла, прижимные валики установлены с возможностью контакта с кюветой и прижима к нему ленты с мазками.

В устройстве корпус снабжен зажимами для крепления его к предметному столику микроскопа.

Перечень фигур чертежей
Сущность изобретения поясняется чертежами, где на фиг. 1 изображена схема системы, реализующей заявленный способ, на фиг. 2 - устройство для транспортировки мазков в зону исследований.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения
Устройство для транспортировки мазков включает в себя корпус 1, имеющий зажимы 2 для крепления на предметном столике 3 микроскопа, разъемную откидную или съемную крышку (крышки) 4, состоящую, например, из двух половин с закрепленными на них подпружиненными прижимными валиками 5 и валиком 6 отжима иммерсионного масла 7, кювету 8 для иммерсионного масла 7 с дном из оптически прозрачного материала, валы 9 для кассет 10 и 11 - приемной и подающей, располагающихся в соответствующих гнездах, моторы 12, 13 быстрой и шаговой перемотки ленты 14, систему управления 15 перемоткой и соответствующее программное обеспечение.

Материал дна кюветы 16, пленки 14 и иммерсионное масло 7 подбирают таким образом, чтобы они имели максимально близкий (желательно равный) коэффициент преломления, например, п = 1,518. Все части устройства и пленка изготавливаются из материала, устойчивого к действию иммерсионного масла соответствующего вида. Для большинства масел этим требованиям отвечают металлы, силиконовая резина, ацетилцеллюлоза и целый ряд других видов пластмасс. Кроме того, желательно использование сортов масел с невысокой вязкостью.

Устройство устанавливается и закрепляется на предметном столике 3 микроскопа при поднятом вверх объективе 17. Открываются боковые крышки 4 устройства, в кювету 16 заливается необходимое количество (до метки) иммерсионного масла 7. В соответствующее гнездо вставляется подающая кассета 10 с пленкой 14. Начальный участок пленки 14, не содержащий мазков, вытягивается из кассеты 10, протягивается над кюветой 16 и закрепляется в приемной кассете 11. Закрываются боковые крышки 4, при этом прижимные валики 5 опускаются в кювету 16 и прижимают пленку 14 к ее дну. Пленку 14 перематывают до появления под объективом 17 первого мазка. Опускают объектив 17, погружают его в иммерсионное масло 7 и фокусируют изображение. Включают автоматическую перемотку пленки 14 в соответствии с заданной программой.

Пленка 14 протягивается через кювету 16 с заданной в зависимости от потребностей исследования скоростью (обычно 0,1 - 2,5 мм/сек). При этом происходит ее смачивание иммерсионным маслом 7 с обоих сторон. В результате между прозрачным дном кюветы 16, пленкой 14 и объективом 17 создается оптически однородная среда с заданным коэффициентом преломления, что обеспечивает высокую разрешающую способность и светосилу оптической системы 18. Кроме того, благодаря адгезивным явлениям пленка 14 в процессе движения прилегает к дну кюветы 16, сохраняется постоянным ее расстояние до объектива 17. После прохождения кюветы 16 пленка 14 проходит через валики 6 для отжима иммерсионного масла 7 и использованное масло стекает обратно в кювету 16, благодаря чему достигается его экономичное использование. Затем пленка 14 наматывается на приемную кассету 11, и при необходимости возможен ее повторный анализ. Если необходимо длительное хранение анализированного материала, пленку извлекают из приемной кассеты, осторожно протирают от остатков иммерсионного масла и подсушивают на воздухе в защищенном от пыли месте в течение 1 - 2 часов, после чего сворачивают обратно в кассету.

Возможны разнообразные режимы работы устройства в зависимости от анализируемого цитологического материала (мазки крови, красного костного мозга, спинномозговой жидкости и др.), задач исследования используемой компьютерной техники и программного обеспечения. В качестве примера приведем режим работы, целесообразный при анализе мазка крови с целью подсчета лейкоцитарной формулы. Мазки изготавливаются на пенке таким образом, чтобы расстояние от начала одного мазка до начала другого сохранялось строго постоянным, и мазки были разделены промежутками чистой пленки. Первый мазок выставляется в поле зрения микроскопа вручную, как это было описано выше. Затем осуществляется покадровая подача пленки с помощью шагового двигателя 12 на расстояние, соответствующее размерам поля зрения телекамеры (обычно 30 - 100 мкм при использовании объектива 100x), т.е. сканирование мазка. При этом осуществляется оцифровка и ввод в компьютер изображения каждого кадра, компьютерный анализ изображения с опознаванием различных типов клеток (нейтрофилов, эозинофилов, базофилов, лейкоцитов, моноцитов и др.) и подсчет количества как каждого вида клеток, так и их суммарного числа. После обнаружения заданного количества клеток (100 лейкоцитов при различных гемоцитологических исследованиях, 200 - 500 или более при необходимости повышенной точности анализа), рассчитывается процентное количество выявленных видов лейкоцитов и информация о пациенте записывается в память либо выводится на печать. Сканирование данного мазка прекращается и осуществляется быстрая перемотка ленты на расстояние, соответствующее началу следующего мазка, зафиксированное в памяти компьютера. Затем начинается анализ следующего мазка. Перед началом каждого мазка могут быть нанесены специальные метки, несущие информацию о пациенте (его номер, фамилию, диагноз и т.д.). Такие метки могут быть считаны анализатором изображения и введены в память компьютера. В качестве меток могут опознаваться и не содержащие клеток участки чистой пленки между соседними мазками. Кроме того, может быть предусмотрен выбор оптимального участка внутри мазка. Так, для мазков крови оптимальным при подсчете лейкоцитарной формулы обычно является участок, начинающийся на расстоянии 2 - 3 мм от конца мазка (от так называемой щеточки) и продолжающийся на 7 - 15 мм в глубь мазка. Наиболее информативная область мазка лежит в пределах от 2/3 - 3/4 от начала мазка и практически до его конца.

При стандартизированном изготовлении мазков с их фиксированными размерами этот участок может определяться автоматически, смещением на фиксированное расстояние от начала мазка, например, смещением на 40 мм от начала мазка при длине мазков 50 мм. Если мазки недостаточно стандартизированы по длине вследствие различной вязкости крови у пациентов и других причин, выбор оптимального участка скрининга может осуществляться следующим образом. После автоматического обнаружения начала мазка, как это было описано выше, происходит быстрая перемотка пленки до конца мазка, который опознается компьютером по исчезновению клеток крови и появлению чистой пленки. После этого осуществляется обратная перемотка пленки на расстоянии 2 - 3 мм, и в этом же направлении производится скрининг мазка на глубину 10 - 15 мм. После окончания скрининга пленка автоматически перематывается к началу следующего мазка и цикл повторяется. Наконец возможен автоматический выбор оптимального участка мазка по плотности расположения эритроцитов, по интенсивности окраски мазка, по средним размерам клеточных элементов и другим признакам.

Наиболее рационально использование устройства с движением пленки лишь по одной координате - длине. Это вполне возможно при анализе мазков крови, костного мозга и других биологических жидкостей, изготовленных общепринятыми методами. В этих условиях целесообразно делать более длинные и узкие мазки - шириной 5 - 10 мм и длиной 70 - 100 мм. Если необходимо движение и по двум координатам - длине и ширине, описанное устройство должно быть дополнено системой перемещения пленки по второй координате, аналогичной той, которая используется в устройстве - ближайшем аналоге. Однако это приведет к усложнению устройства. Кроме того, при установке устройства на предметном столике 3 необходимо добиться строго перпендикулярного расположения поперечной оси дна кюветы 16 и оптической оси объектива 17. Это может быть достигнуто путем оснащения устройства специальными микрометрическими винтами, регулирующими высоту расположения устройства на предметном столике микроскопа. В противном случае при перемещении пленки 14 по ширине будет изменяться расстояние от пленки до объектива 17, и возникнет необходимость в системе автофокусировки.

Способ осуществляют с помощью устройства для транспортировки мазков следующим образом. Пробу крови или иной биологической жидкости наносят на лавсановую пленку 14, ацетилцеллюлозную или иную прозрачную ленту последовательными мазками через равные интервалы. Предварительно выбирают длину "кадра", размечают ленту на кадры с помощью красителя. Мазки начинают строго от начала кадра. После высыхания мазков ленту 14 наматывают на подающую кассету 10 устройства для транспортировки мазков в зону исследований. Свободный конец ленты 14 протягивают под прижимными валиками 5, проводят через направляющие валики и кювету 16 с иммерсионным маслом 7 и закрепляют на приемной части механизма - кассете 11. Приемная и подающая кассеты 10 и 11 съемно размещены на валах 9, синхронно перемещаемых двигателем 12, 13 или ручным механизмом, и подают ленту 14 в зону исследований. Включают источник 20 света, размещенный с противоположной объективу 17 оптической системы 18 стороны, объектив 17 устанавливают на фиксированном расстоянии от ленты 14, настраивают и производят фокусировку однократно, обеспечивая таким образом оптимальное изображение мазка. Включают автоматическую покадровую подачу ленты 14, подачу осуществляет шаговый двигатель 12 с заданным временным интервалом. В зону оптической видимости объектива 17 подают отрезки ленты 14 с нанесенными на нее мазками крови. Интенсивность освещения поля, в котором находится образец, регулируют изменением раскрытия ирисовой диафрагмы, производят фокусировку системы 21 формирования светового луча. Изображение пробы исследуемо гемоцитологического материала наблюдают визуально через окуляры 22 микроскопа, подают на телевизионную камеру 23, с помощью которой можно записать видеоизображение, и на светочувствительный датчик 24. Датчик 24 генерирует электрический аналоговый сигнал, пропорциональный количественным характеристикам исследуемой пробы (например, количеству гемоглобина крови). На дисплее 25 наблюдают укрупненное изображение образца, на экране 26 отображаются результаты анализа. Можно получить распечатку результатов анализа с помощью принтера 27. Компьютер системы управления 15 управляет ходом аналитического процесса, подает команды на включение шагового двигателя 12 и подачу пленки с нанесенной на нее пробой в пределах одного кадра, запоминает результаты анализа каждой пробы. Для повышения разрешающей способности устройства предусмотрена система подачи иммерсионного масла. Она выполнена в виде кюветы 16, в которую залито масло и в котором размещены прижимные валики 5, лента 14 при вращении кассеты 10 смачивается маслом и, проходя по кювете 16 прилипает к ней, воздушный зазор между кюветой 16, объективом 17 и лентой 14 устраняется.

Программы анализа изображения для различных биологических жидкостей заложены в компьютер и выбираются в зависимости от типа жидкости и исследуемой ее характеристики. Заявленным способом проводят исследования мазков крови, спинномозговой жидкости: 1) подсчитывается количество эритроцитов, тромбоцитов, лейкоцитов на единицу площади мазка, 2) измеряется площадь эритроцитов, их оптическая плотность, площадь и оптическая плотность пеллора (углубления) эритроцитов, анализируется форма эритроцитов, 3) подсчитывается процентный состав различных типов лейкоцитов, 4) для каждого типа лейкоцитов определяется площадь клетки, площадь ядра, их оптическая плотность и цветность, ядерно-цитоплазматический индекс, количество гранул в цитоплазме и интенсивность их окраски, 5) определяется количество патологически измененных лейкоцитов. При исследовании спинномозговой жидкости: 1) подсчитывают количество и процентное соотношение лимфоцитов, липофагов, нейтрофилов, эозинофилов, эпителиальных клеток, опухолевых клеток; 2) определяют площади ядер цитоплазмы перечисленных типов клеток, их ядерно-цитоплазматический индекс, интенсивность и цветность окраски. Кроме того, заявленный способ применим для исследований мочи, мокроты, мазков экссудатов и транссудатов. При этом время проведения анализа целого ряда последовательных изображений мазков значительно сокращается. Особую актуальность и применимость способ будет иметь при проведении массовых обследований населения, когда число исследуемых проб велико и необходимо обеспечить высокую точность и объективность анализа.

Источники информации
1. RU 2088922, C1 (Медовый и др.), G 01 N 33/48, 27.08.97.

2. US 4887892, A (BACUS), G 02 B 21/08, 19.12.89.

3. US 5546323, A (BACUS), G 02 N 1/02, 13.08.96.

4. США 4836667, /Ozeki/, 06.06.89н

Изобретение относится к области медицины и биологии, может быть использовано для лабораторных исследований мазков крови, биологических жидкостей и суспензий для распознавания и измерения диагностических характеристик цитологических препаратов. Способ заключается в изготовлении мазков биологического материала, размещении их в зоне исследования и осуществлении визуальных исследований. Согласно изобретению мазки биологических материалов изготавливают путем нанесения на гибкую прозрачную ленту, начало каждого мазка осуществляют преимущественно с равным шагом, наматывают лету на подающую катушку, размещают на устройстве для подачи мазков в зону исследований и осуществляют последовательную подачу мазков в зону исследований. Устройство содержит подвижный корпус, средства для размещения партии мазков и средства перемещения. Последние выполнены в виде подающей и приемной кассет, установленных с возможностью синхронного вращения и перемещения партий мазков, нанесенных на ленту через кювету. Изобретение повышает производительность труда врача-лаборанта и улучшает качество и объективность лабораторного исследования цитологических препаратов. 2 с. и 4 з.п.ф-лы, 2 ил.

1. Способ исследования биологических материалов, заключающийся в изготовлении мазков биологического материала, размещении их в зоне исследования и осуществлении клеточного анализа, отличающийся тем, что мазки биологических материалов изготавливают путем нанесения на гибкую прозрачную ленту, каждый последующий мазок начинают преимущественно через равный интервал от начала предыдущего, наматывают ленту на подающую катушку, размещают на устройстве для транспортировки мазков в зону исследований и осуществляют последовательную подачу мазков в зону исследований, при этом в пределах одного мазка осуществляют медленную подачу ленты для поиска характерного цитологического изображения. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве ленты используют ацетилцеллюлозную пленку. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве ленты используют лавсановую пленку. 4. Способ по п.1, отличающийся тем, что подачу ленты в зону исследований осуществляют с помощью шагового двигателя. 5. Способ по п.1, отличающийся тем, что медленную подачу ленты с мазками крови осуществляют в области, отстоящей от начала мазка на 2/3 - 3/4 его длины. 6. Устройство для транспортировки партии мазков биологических материалов в зону исследований, содержащее подвижный корпус, размещенные на нем средства для размещения партии мазков и средства для перемещения партии мазков, отличающееся тем, что корпус снабжен крышкой, к которой подпружинены прижимные валики, а средства перемещения партии мазков выполнены в виде двух подающей и приемной кассет, установленных на валках с возможностью синхронного вращения и перемещения ленты с нанесенной на ней партией мазков через кювету, установленную в сквозном отверстии корпуса и заполненную иммерсионным маслом, при этом дно кюветы выполнено из оптически прозрачного материала, на выходе из кюветы со стороны приемной кассеты размещен валик для отжима имперсионного масла, прижимные валики установлены с возможностью контакта с кюветой и прижима к нему ленты с мазками. 7. Устройство по п.6, отличающееся тем, что корпус снабжен зажимами для крепления его к предметному столику микроскопа.