ВЕЩЕСТВА, ПРОЯВЛЯЮЩИЕ АНТИМИКРОБНУЮ, АНТИГРИБКОВУЮ, АНТИПРОТОЗОЙНУЮ АКТИВНОСТИ Российский патент 2000 года по МПК A61K31/04 A61K31/06 

Изобретение относится к области экспериментальной медицины и биологии и может быть использовано в медицине, ветеринарии, сельском хозяйстве для борьбы с возбудителями бактериальной, грибковой и протозойной природы, а также для защиты живых организмов от лучевого поражения.

В настоящее время ассортимент средств с широким спектром активности по отношению к возбудителям бактериальной, грибковой и протозойной природы довольно ограничен.

Наиболее широкое применение для борьбы с патогенными микроорганизмами получили антибиотики. Однако, как правило, антибиотики обладают узкой специфичностью. Одним из наиболее универсальных антибиотиков является полимиксин, проявляющий активность в отношении большой группы грамотрицательных бактерий, но в отношении возбудителей грибковой и протозойной природы указанный антибиотик не эффективен.

Выбор средств для защиты живых организмов от радиоактивного излучения также достаточно ограничен.

Среди радиопротекторов наиболее эффективными являются серосодержащие соединения [Куна П. Химическая радиозащита. Москва, 1989 г., стр. 25 - 28].

Известно официально применяемое радиозащитное средство цистамин [Владимиров В.Г. и др. Радиопротекторы, структура и функция. Киев, 1989 г., стр. 139]. Индекс защиты указанного препарата не превышает 1,45. Недостатком средства является то, что он вызывает диарею.

Известным радиозащитным препаратом является меркамин (β-меркаптоэтиламин) [Машковский М.Д. Лекарственные средства, ч. 2, Москва, 1986 г., стр. 189].

Недостатками меркамина являются невысокий терапевтический индекс, небольшая длительность действия (0,5 - 1 час), малая отсроченность радиозащитного действия (15 - 30 мин).

Целью заявляемого изобретения является расширение арсенала средств, эффективных в отношении широкого круга патогенных микробов, грибков и простейших, а также расширение арсенала радиозащитных средств.

Указанная цель достигается тем, что в качестве антимикробных, антигрибковых, антипротозойных и радиозащитных веществ применяют производные арилнитроалкенов общей формулы

где R₁ - H, CH₃;
R₂, R₃ - одинаковые или различные заместители, выбранные из ряда H, OCH₃, OH, NO₂, (CH₃)₂N;
или R₂ и R₃ вместе - (-CH₂O-).

Арилнитроалкены и их производные давно известны в качестве химических соединений. Их получают реакцией конденсации ароматических альдегидов с первичными нитроалканами [В. В. Перекалин. Непредельные нитросоединения. Москва, 1966 г., стр. 119].

Известно, что β-нитростирол и некоторые его производные проявляют биологическую, в частности фунгицидную, активность [Г.Фойер. Химия нитро- и нитрозогрупп. Москва, 1973 г., ч. 2, стр. 194-195; Liebigs Annalen der Chemie, 1987 г., N 6, стр. 495-498; н.з. Японии N 62-42923, A 61 K 31/04, публ. 1987 г.; а.с. ГДР N 234782, A 01 N 33/18, публ. 1986 г.].

Однако в опубликованных источниках информации авторами не выявлено сведений о применении соединений, соответствующих заявляемой общей формуле, а именно 3,4-замещенных арилнитроалкенов при указанных в формуле заместителях и их сочетании в качестве веществ, проявляющих антимикробную, антигрибковую, антипротозойную активности, а также радиозащитное действие.

Следует отметить, что влияние природы и положения заместителей на биологические свойства и действие вещества не может быть точно определено и предсказано теоретически, несмотря на принципиальную известность некоторых общих закономерностей, поскольку существует ряд факторов, который проявляется лишь при экспериментальной проверке на живых организмах, например, способность проникать через мембраны, наличие равновесия между лечебным действием и детоксикацией в организме, побочные эффекты и другие факторы.

Исследования, проведенные авторами в опытах in vitro и in vivo, показали, что соединения заявляемой группы проявляют достоверно широкий спектр антимикробного, антигрибкового, антипротозойного действия и, кроме того, обладают радиозащитными свойствами. Минимальная концентрация, при которой проявляется активность указанных соединений, составляет 0,03%.

Все заявляемые вещества являются малотоксичными - средняя летальная доза составляет для мышей не более 1,5 г на 1 кг веса.

Примеры наиболее эффективных соединений с точки зрения активности и спектра действия, а также результаты их испытаний представлены ниже.

1. 3-метокси-4-гидрокси-β-нитроэтилен

2. 3-метокси-4-гидрокси-β-нитроэтилен

3. 4-диметиламино-β-нитроэтилен

4. 4-диметиламино-β-метил-β-нитроэтилен

5. 4,-w-динитроэтилен

6. 3,-w-динитроэтилен

7. 3,4-диметокси-β-нитроэтилен

Указанные соединения могут быть получены одним из известных методов из соответствующих ароматических альдегидов и нитроалкенов [В.В.Перекалин. Непредельные нитросоединения. Ленинград, 1982 г., стр. 55, 59, 61, 71, 73, 88, 89, 91, 95].

В испытаниях использовали музейные (с индексом "M") штаммы возбудителей и штаммы, выделенные (с индексом "B") из патологического материала, взятого от больных, и прошедшие не более 3-х лабораторных пассажей. Для каждого рода возбудителей использовали соответствующие оптимальные питательные среды. Был применен метод импрегнации исследуемыми веществами питательных твердых сред в дозах от 0,03 до 2,0%. Частично использовали метод диффузии в агаре по аналогии со стандартными методиками определения чувствительности к антибиотикам.

Метод диффузии в агаре осуществляли следующим образом.

Готовили среду АГВ (официальный стандарт), импрегнированную исследуемыми соединениями в концентрации от 0,1 до 2,0%. Среду разливали в чашечки Петри и после застывания из нее вырезали столбики диаметром 10 мм, которые накладывали на поверхность чашек Петри сразу же после посева на них испытуемых микроорганизмов (не менее 6 столбиков на культуру). Через сутки инкубации при 37^oC измеряли диаметр зон задержки роста культуры вокруг столбиков. Оценку результатов выполняли в соответствии с официальными нормативами тестирования антибиотикочувствительности: диаметр ≤20 мм соответствовал устойчивости культуры, 21-28 мм - ее умеренной устойчивости и ≥ 29 мм - чувствительности.

Параллельно проводили испытания чувствительности возбудителей к 15 антибиотикам по официальной инструкции Управления по внедрению новых лекарственных средств и медтехники (метод дисков).

В пределах каждого рода использовали несколько видов и штаммов возбудителя для выявления пределов штаммовых и видовых вариаций чувствительности к исследуемым веществам с целью оценки их вероятной общеродовой широты действия.

В таблице 1 представлены результаты испытаний соединений при концентрации 1,0%, при которой они подавляли размножение 5•10⁵ - 5•10⁷ микр. тел/мл, и сравнительные результаты испытаний чувствительности к 15 антибиотикам:
1 - пенициллин,
2 - ампициллин,
3 - гентамицин,
4 - карбенициллин,
5 - канамицин,
6 - линкомицин,
7 - левомицетин,
8 - оксациллин,
9 - полимиксин,
10 - рифамицин,
11 - ристомицин,
12 - стрептомицин,
13 - тетрациклин,
14 - эритромицин,
15 - цефалоспорин.

В таблице 2 представлены результаты испытаний чувствительности некоторых микроорганизмов к исследуемым соединениям методом диффузии в агаре.

В таблице 3 представлены результаты испытаний чувствительности патогенных грибов к исследуемым соединениям.

Проводили также испытания действия исследуемых соединений на трихомонады.

Использовали штаммы паразита, выделенные от больных. Трихомонады культивировали в среде 199 с добавлением 5,0% нативной сыворотки эмбрионов коров, углеводов и антибиотиков для подавления сопутствующей флоры. В культуральные пробирки на поверхность среды наслаивали вазелиновое масло. Опытные образцы содержали исследуемые соединения в концентрации 0,3%.

Было исследовано 7 исходных проб, содержащих подвижные формы паразита в количестве 5 - 8 клеток в 1,0 см³. Культивирование паразита в контроле при pH 5,8 - 6,5 и t = 37^oC удавалось в пределах 3 - 4-х пассажей (5 - 6 дней каждый пассаж). Во всех случаях культивирование подвижных форм в среде, содержащей испытуемые вещества, не удавалось. Уже после первого пассажа подвижные формы не воспроизводились.

Лечебно-профилактическое действие веществ определяли в опытах in vivo на мышах, зараженных внутрибрюшинно или интраназально бактериями псевдотуберкулеза и сальмонеллеза.

Испытуемые вещества в дозе < 20% ЛД₅₀/0,2 вводили внутрибрюшинно, внутримышечно и перорально в разные сроки от дня заражения. За 2 и 1 день до заражения (схемы 2, 1), в день заражения (схема 0) и после заражения через 1, 2, 3 и т.д. дней (схемы +1, +2, +3 и т.д.).

Учитывали ежедневные показатели смертности, вычисляли их кумулятивные вариации, на основе которых определяли результаты действия препарата по формуле
ИД = [(Б-А):Б]•100,
где ИД - индекс действия препарата, %;
А - кумулята смертности в опыте;
Б - кумулята смертности в контроле.

Результаты испытаний представлены в таблице 4.

Результаты испытаний показали наличие у всех исследуемых соединений лечебной и профилактической активности на моделях сальмонеллезной и псевдотуберкулезной инфекции.

При внутримышечном введении препаратов лечебно-профилактическое действие в виде снижения смертности животных составило 52,53%. Лечебное действие для сальмонеллеза варьировало в пределах 50,0% - 20,0%. Для псевдотуберкулеза профилактическое действие составило 50,0%.

Радиозащитное действие исследуемых соединений испытывали на белых мышах, самцах, с массой 18 - 20 г.

Дозы R₀ - 2, 4, 6, 8, 10, 15, 20 Гр (1 Гр = 100 рентген).

Срок наблюдения - 25 дней.

Метод учета: смертность в динамике, расчет кумулятивной смертности и фактические изменения дозы (ФИД).

Схема введения: 50 мг/кг по 0,2 мл в мышь.

1 группа - контроль,
2 группа - за 2 и 1 сутки до облучения.

Результаты испытаний радиозащитного действия исследуемых соединений представлены в таблице 5.

Как показали результаты испытаний, при профилактическом применении существенно снижается смертность облученных животных по сравнению с контролем для всех доз облучения. ФИД (ЛД₅₀ опыта/ЛД₅₀ контр.) = 1,39 - 1,43, что говорит о высоком радиозащитном эффекте указанных соединений, не уступающих по своему действию табельным средствам.

Таким образом, заявляемые вещества проявляют широкий спектр антимикробной, антигрибковой и антипротозойной активности и по спектру действия превосходят антибиотики. Кроме того, указанные соединения обладают высоким радиозащитным действием.

Благодаря описанным свойствам заявляемые вещества могут найти применение при лечении раневых инфекций, септических состояний, пневмонии, трахомы, оринтоза, трихомониаза, грибковых поражений, в ветеринарной практике - для профилактики и лечения сальмонеллезов. Кроме того, данные вещества могут быть использованы для защиты живых организмов от лучевого поражения. Возможно также применение заявляемых соединений в различных отраслях, где требуется антисептическая обработка материалов.

Изобретение относится к области экспериментальной медицины и биологии и может быть использовано в медицине, ветеринарии, сельском хозяйстве. Предложено новое средство для борьбы с возбудителями бактериальной, грибковой и протозойной природы, а также для защиты живых организмов от лучевого поражения. В качестве такого средства предложены производные арилнитроалкенов общей формулы

где R₁ - H, CH₃, R₂, R₃ - одинаковые или различные, заместители, выбранные из ряда Н, OCH₃, ОН, NO₂, (CH₃)₂N. Изобретение расширяет арсенал средств, эффективных в отношении широкого круга патогенных микробов, грибков и простейших, за счет этого действия снижается смертность облученных животных. 1 з.п.ф-лы, 5 табл.

1. Применение производных арилнитроалкенов общей формулы

где R₁ - H, CH₃,
R₂, R₃ - одинаковые или различные заместители, выбранные из ряда H, OCH₃, OH, NO₂ (CH₃)₂ N,
в качестве веществ, проявляющих антимикробную, антигрибковую, антипротозойную активности. 2. Применение по п.1 для снижения смертности облученных животных.