ПРИМЕНЕНИЕ ДИМЕРА ЛИЗОЦИМА В КАЧЕСТВЕ ЛЕКАРСТВЕННОГО СРЕДСТВА И СОДЕРЖАЩИЕ ЕГО КОМПОЗИЦИИ Российский патент 2000 года по МПК A61K38/46 

Настоящее изобретение касается применения димера лизоцима по новому назначению и составов, содержащих такой димер, а именно для лечения определенных дисфункций естественных защитных механизмов.

Терапевтическая эффективность мономерных форм ферментов при лечении различных болезней известна уже в течение длительного времени. Лизоцим обнаружен Флемингом в 1922 году, но до 1950 года его ферментативные функции не были выявлены. Начиная с этого времени, появляются сообщения о его различных терапевтических эффектах. Известны противовирусные, противобактериальные, противовоспалительные и противогистаминные свойства лизоцима. Однако терапевтическое применение лизоцима ограничено из-за отрицательных побочных эффектов мономерной формы.

Известно, что изолированные димеризованные формы ферментов при сохранении всех благоприятных свойств известных мономерных форм не обладают никакими отрицательными побочными эффектами при использовании в терапевтических дозах. Противовирусные и противобактериальные составы, включающие в качестве активного ингредиента димер лизоцима или другие димеризованные ферменты, описаны в международной патентной заявке WO 89/11294. В ней сообщается, что при тестах in vitro димер лизоцима ингибирует пролиферацию ряда бактериальных штаммов, культивируемых на образцах культур, взятых у пациентов, в концентрациях 5 - 20 мг/мл. Известно об эффективности димера при лечении инфекции парвовируса бешенства (CPV) при оральном введении его дважды в день в дозе 1-2 мг/кг веса тела.

При клинических испытаниях, направленных на подтверждение противобактериальной и противовирусной эффективности димера лизоцима, обнаружено, что димер оказывает неожиданно сильное действие при лечении острых форм заболеваний пищеварительного и дыхательного трактов.

Известно, что бактериальные токсины составляют одну группу большого количества факторов вирулентности, которыми бактерии вызывают болезни. Некоторые последние открытия в области бактериальных токсинов касаются их взаимодействия с иммунной системой хозяина. Это взаимодействие вначале приводит к иммуномодуляции, а затем - к высвобождению цитокинов и других посредников, которые являются причиной большого количества физиологических нарушений, вызванных токсинами. Последний эффект специально изучали в отношении действий эндотоксина, который играет важную роль в патогенезе грамотрицательного сепсиса (см. Bayston, D.F., Cohen, J.: Bacterial endotoxins and current concepts in the diagnosis and retreatment of endotoxaemia; J. Med. Microbiol. 1990, 31: 73 - 83). Известна роль экзотоксинов в инфекциях, вызываемых Staphilococcus aureus и Streptococcus pyogenes, признание токсического шокового синдрома стафилококка вызывает повышенный интерес к экзотоксинам, вырабатываемым этими организмами.

Токсический шок - это серьезная болезнь, характеризующаяся высокой температурой, гипотензией, капиллярными кровотечениями, диффузной эритродермией, слизистой эритемой, почечной недостаточностью, гипокальцемией, гипоальбуминемией и шелушением при красной сыпи кожи. Многие случаи синдрома токсического шока связаны с применением вагинальных тампонов в течение менструации, однако чаще всего синдром описывают у обоих полов в несвязанных с менструацией условиях, зачастую после хирургических процедур, когда оставляют на месте перевязочный материал (например, носовые салфетки после ринопластики или сильного кровотечения). Обнаружено, что штаммы стафилококка, взятые из вагины пациентов, перенесших синдром токсического шока (TSS), продуцируют токсин 1 синдрома токсического шока (TSST-1), но источником микроорганизма, вырабатывающего TSST-1, также может быть скрытая инфекция. Начальная бактеремия может иметь скрытую форму, но по прошествии недель и даже месяцев это может привести к развитию локализованных инфекций. Таким инфекциям могут сопутствовать случаи синдрома сепсиса или септического шока. Реже встречающаяся, но более тяжелая форма бактеремии может встречаться при отсутствии доступа микроорганизмов в орган или при местной инфекции, и в таких ситуациях могут наблюдаться шок, эндокардит, распространенная внутрисосудистая коагулопатия и прекращение функционирования многих органов (см. Stevens, D. L. et al. : Gram-positive shock; Current Opinions in Infections Diseases, 1992, 5: 355 - 363).

Известно также, что подобные наблюдения относятся и к другой грамположительной бактерии. Например, инфекция Streptococcus pyogenes вызывает шок и в 30% случаев приводит к смерти. Streptococcus pneumonial вызывает пневмонию, которую зарегистрируют как имеющую высокий уровень устойчивости к пенициллину и тенденцию к развитию синдрома шока. Кроме того, пациенты, больные СПИДом, имеют более частые случаи пневмококковых инфекций, чем все население в целом.

Инфекция, вызванная грамотрицательной бактерией, может также приводить к сепсису и септическому шоку. Грамотрицательная бацилла и вибрион являются источником наиболее важных энтеротоксинов. Энтеротоксин представляет собой липополисахаридный (LPS) компонент внешней мембраны клеточных стенок грамотрицательных бактерий. Энтеротоксины прежде всего оказывают влияние на кишечный тракт и обычно вызывают понос. Наиболее частыми инфекциями, вызываемыми грамотрицательными бактериями у животных и людей, являются инфекции, вызываемые кишечной палочкой. Сопровождающее такие инфекции сильное обезвоживание может привести к смерти инфицированного индивидуума. Согласно статистике в развивающихся странах от острого поноса каждый год погибает приблизительно 3,2 миллиона детей. Приблизительно 30% всех случаев сепсиса вызваны грамотрицательной бактерией.

Из-за сепсиса инфекции, вызываемые грамположительными и грамотрицательными бактериями, представляют собой всегда серьезное заболевание во всех странах.

В Соединенных Штатах ежегодно регистрируют около 400000 случаев заболеваний приблизительно с 50%-ной смертностью.

Сепсис и септический шок являются предметом большого количества публикаций. Известно, что в патофизиологии септического шока, эндотоксимии и в других бактериальных интоксикациях главную роль играют посредники. К ним относятся фактор некроза опухоли (TNF), интерлейкин-1 (IL-1), интерферон (IFN), фактор деятельности тромбоцитов и eicosanoid (производные арахидоновой кислоты); причем наиболее важный из них - TNF, который оказывает влияние на метаболизм, а также на иммунную и фагоцитарную системы (см. Berkowitz, F. E.: Bacterial toxins in pathogenesis of infections; Current Opinions in Infections Diseases, 1991, 4: 332 - 337). Показано, что погибшие от септического шока пациенты имеют более высокие концентрации TNF и интерлейкина-1. Известно о повышенных уровнях TNF - α в плазме и в крови пациентов после септического шока. А также, что токсический эффект TNF - α может в большой степени не зависеть ни от концентраций TNF, ни от их присутствия в организме.

Исследована возможность модуляции каскада цитокинов в сепсисе и септическом шоке. Известно применение моноклональных антител против TNF и нейтрализация липополисахарида с помощью антилипополисахаридных средств. Однако антитела не повышают гибель бактерий. Частично благоприятные эффекты также наблюдаются при применении таких агентов, как дексаметазон и пентоксифилин, которые блокируют продукцию TNF макрофагами.

Известно, что другие цитокины также способствуют септическому шоку. В этой ситуации вводят препараты, которые модулируют каскад цитокинов при септическом шоке и обладают способностью воздействовать на возбудителя инфекции, так как защита хозяина зависит от тех же самых цитокинов, вызванных воспалением. Поиск средств для предотвращения септического шока является главной задачей, цель которой заключается в оказании помощи большому количеству пациентов. Для этих целей существенным является управление уровнем TNF.

Такой же критической является роль TNF и в другом защитном механизме - лихорадке, которая является типичной физиологической реакцией на инфекцию фактически для всех высших животных и человека. Пять пирогенных цитокинов (интерлейкин-1, TNF, интерферон, интерлейкин-2 и интерлейкин-6) в настоящее время считаются основными эндогенными посредниками лихорадочной реакции, ингибирующей преоптические термочувствительные нейроны, которые обычно облегчают снижение высокой температуры и подавляют резкое повышение температуры в организме человека. Лихорадка и ее медиаторы могут причинять вред как органу, в который они вторгаются, так и хозяину. За последние годы накоплено значительное количество данных, подтверждающих, что интерлейкин-1, TNF и интерлейкин-6 являются медиаторами патофизиологических нарушений при инфекциях. Поскольку эндогенные пирогены способствуют патологическому процессу при различных инфекциях, то потенциальный вред хозяину причиняют как медиаторы, так и лихорадочная реакция. Наиболее убедительное свидетельство этого получено при изучении грамотрицательного сепсиса. Имеется доказательство, что эндогенные пирогены являются промежуточным звеном для системных и локальных проявлений сепсиса, вызванных инфекциями грамположительных бактерий, СПИДом, инфекциями спирохет, менингитом, респираторным дистресс-синдромом у взрослых, гнойным артритом и микобактериозом. Хотя приведенные данные противоречат наблюдению, что лихорадочная реакция непосредственно повышает сопротивление инфекции у экспериментальных животных, тем не менее сущность процесса эволюции заключается больше в сохранении видов, чем в выживании индивидуума. Очевидно, вредные системные воздействия пирогенных цитокинов на последствия подавления инфекций (например, грамотрицательного сепсиса) адаптируются как благоприятные локальные воздействия лихорадки при менее внезапных и быстро развивающихся инфекциях. Поэтому, ускоряя гибель безнадежно инфицированных индивидуумов, природа убивает индивидуумов, которые являются опасными для видов. Таким путем виды в целом могут быть защищены от эпидемических болезней (см. Mackowiak, P.A.: Mechanism of Fever; Current Opinions in Infectious Diseases, 1992, 5 :348-354).

Фундаментальная концепция лихорадки, вызванной патогенными микроорганизмами, заключается в том, что экзогенные пирогены, независимо от их происхождения или структуры, вызывают лихорадку, индуцируя клетки хозяина (прежде всего макрофаги) вырабатывать эндогенные пирогены. Соответственно могут быть эффективны терапевтические методы, основанные на применении антиэндогенных антител пирогена и антагонистов эндогенных рецепторов пирогена. Одна из возможностей заключается в блокировании биосинтеза TNF. Исследования на животных показывают, что в каскаде реакции на инфекционную болезнь TNF может быть синтезирован прежде IL-1 и других цитокинов. Известно, что ингибирование биосинтеза TNF также означает и прекращение биосинтеза IL-1. Но ингибирование биосинтеза TNF также означает, что прекращаются вредные воздействия некоторых внезапных и безнадежных инфекционных болезней.

TNF также известен как один из посредников воспалительных процессов. Во многих случаях воспаление - это первая стадия болезни с естественным течением, сопровождающаяся развитием септического шока. В случаях, когда нарушена целостность тканей, например, при ранах, восприимчивых к инфекции, ранениях, в особенности брюшных ранах (перитоните), болезнях желудочно-кишечного тракта, таких как острые инфекции, сопровождающие аппендицит, острых бактериальных и вирусных инфекциях, наблюдаемых при послегриппозной пневмонии, опухолевых болезнях, особенно в фазе разложения опухолей, и т.п., воспаление является первым симптомом увеличения синтеза TNF. Таким образом управление уровнем TNF является желательным при лечении таких инфекционных болезней.

Еще более значительной является роль TNF непосредственно при заболевании СПИДом. СПИД характеризуется сильно выраженным иммунодефицитом. Главный показатель СПИДа - это уменьшение числа лимфоцитов CD4+. Число клеток, инфицированных ВИЧ, этиологическим возбудителем СПИДа, относительно невелико (≤1 из 100 - 1000) даже в моноядерных клетках периферической крови (PBMC) пациентов, больных СПИДом. В то время, как инфицированы в основном лимфоциты CD4+, эти клетки не являются исключительными мишенями для поражения ВИЧ. Недавно получены доказательства того, что спектр клеток - мишеней для ВИЧ может быть весьма широк. Явные различия наблюдаются в последствиях действия инфекционной болезни ВИЧ на моноциты (макрофаги) по сравнению с Т-лимфоцитами. В то время, как Т-лимфоциты имеют тенденцию разрушаться, моноциты (макрофаги) устойчивы к длительному заболеванию. Поэтому моноциты (макрофаги) могут сохранять ВИЧ внутри себя подобно другим клеткам организма. Тип реакции моноцита (макрофага) на инфекцию ВИЧ может влиять на установление скрытого состояния инфекции в хозяине; причем эта реакция может также приводить к патогенным нарушениям, вызываемым растворимыми факторами, синтезируемыми инфицированными клетками (см. Tashifumi Natsuyama et al.: Cytokines and HIV infection: Is AIDS а Tumor Necrosis Factor disease?; AIDS 1991, 5: 1405-1417). Многие ученые сообщают, что линии Т-клеток человека, инфицированные вирусом человеческого Т-клеточного лейкоза (HTLV-1) высоко чувствительны к инфекции ВИЧ и вызывают сильное действие, относящееся к заболеванию клетки, вместе с повышенной репликацией ВИЧ. Кроме того, инфицированные ВИЧ клетки чувствительны к повреждениям этих клеток супернатантом. Анализ титра вируса после лечения этим супернатантом показывает, что фактор, синтезируемый Т-клетками (MT-2), повышает репликацию ВИЧ. Фактор идентифицирован и обозначен как TNF - α и это открытие совпадает с сообщениями о том, что Т-клетки (MT-2) синтезируют TNF - β. То же самое действие наблюдается при использовании TNF - α. TNF - β и TNF - α выборочно уничтожают инфицированные ВИЧ клетки и повышают репликацию ВИЧ. Известно, что линии Т-клеток, инфицированных ВИЧ, а также свежие изолированные клетки линии PBMC от инфицированных ВИЧ индивидуумов дают на TNF реакцию, приводящую к повышенным уровням TNF. Можно предположить, что такое же самое повышение экспрессии ВИЧ должно происходить in vivo. Фактически, повышающее действие TNF может быть нейтрализовано антителами против TNF. Повышение репликации ВИЧ после лечения TNF - α и TNF - β доходит до величины около 10 (см. Yakarnam, A. et al.: Tumor necrosis factors (α,β) induced by HIV-1 in peripheral blood monocellular cells potentate virus replication; AIDS 1990, 421 - 427).

Имеются также подтверждения, что различные цитокины могут воздействовать на репликацию ВИЧ. При применении очищенных моноядерных фагоцитов из нормальной периферийной крови в течение нескольких часов после экспозиции вируса ВИЧ наблюдают индукцию как IL-6, так и TNF - α. Такую индукцию цитокина также наблюдают при использовании ВИЧ, инактивированного высокой температурой. На основании многих наблюдений, а также сообщений Toshifumi Matsuyama et al. (op. cit.) сделан вывод, что СПИД представляет собой болезнь, вызываемую цитокином или TNF. При СПИДе среди множества цитокинов основными молекулами, повышающими репликацию ВИЧ, и индуцирующими их собственную экспрессию, а также экспрессию других цитокинов, являются TNF - β и TNF - α. Доказано, что TNF - α стимулирует высвобождение других цитокинов в клетках различных типов и поэтому является ключевым цитокином каскада цитокинов в первом защитном механизме.

Предположено, что многие симптомы, связанные со СПИДом, можно объяснить высвобождением цитокинов, имеющих различные биологические функции. Повышение синтеза двух хорошо известных пирогенов, таких как IL-1 и TNF - α, может объяснить наличие лихорадки, наблюдаемой у пациентов, больных СПИДом. TNF может участвовать в кахексии, связанной со СПИДом. Как TNF - α, так и TNF - β работают как иммуномодуляторы и молекулы-эффекторы при цитотоксичности, вызываемой моноцитом-медиатором. Кроме того, TNF отвечает за активацию иммунного ответа и может непосредственно уничтожать инфицированные ВИЧ клетки, повышая таким образом репликацию ВИЧ. Предложен также иммунологический механизм для объяснения истощения клеток CD4-T при СПИДе (Hatsuyama et al., op. cit.). Известно, что саркома Kaposi, относящаяся к СПИДу, также вызвана TNF - α. TNF может быть получен из кератиноцитов с помощью физиологических стимулов типа ультрафиолетового света, который способствует индукции IL-6 в коже и развитию саркомы Kaposi при СПИДе. В испытаниях in vitro TNF - α может повреждать миелин и олигодендроциты; к тому же обнаружено, что некоторые линии клеток, полученные из глиомы, чувствительны к антипролиферативному действию TNF - α. Можно сделать вывод, что дисфункция центральной нервной системы у больных СПИДом является результатом действия TNF - α. Некоторые сообщения указывают, что уровни TNF - α и IL-1 в сыворотках существенно повышаются с развитием СПИДа и ARC (комплекс болезней, связанных со СПИДом), причем они попадают в диапазон нормальных контрольных значений при испытаниях сыворотки бессимптомных носителей ВИЧ. Согласно Matsuyama et al. (op. cit.) СПИД - это болезнь, вызываемая как TNF, так и ВИЧ. Это показывает, что установление контроля над индукцией TNF может привести к осуществлению эффективной терапии для пациентов, больных СПИДом.

Следующие основные открытия позволяют решить вышеописанные проблемы и найти новые терапевтические применения димера лизоцима при вышеупомянутых патологических состояниях:
1. Димер лизоцима ингибирует синтез TNF.

2. Димер лизоцима стимулирует синтез IFN- α.

3. Димер лизоцима повышает фагоцитарную активность.

Соответственно целью настоящего изобретения является создание фармацевтических составов, терапевтически пригодных для лечения болезней, связанных с чрезмерно высокими уровнями описанного выше TNF (фактора некроза опухоли).

Другой целью настоящего изобретения является создание фармацевтических составов, пригодных для профилактики болезней, связанных с чрезмерно высокими уровнями описанного выше TNF.

Еще одной целью настоящего изобретения является создание фармацевтических составов и гигиенических изделий, пригодных для терапии и предотвращения болезней, связанных с увеличением и чрезмерно высокими уровнями TNF.

Согласно изобретению указанные цели могут быть достигнуты новым использованием димеризованной формы лизоцима и новыми фармацевтическими составами, содержащими димер лизоцима в качестве активного компонента, а именно:
- применением димера лизоцима для изготовления лекарственного средства для ингибирования биосинтеза фактора некроза опухоли у животных и человека;
- применением димера лизоцима для изготовления фармацевтического препарата для лечения болезней, связанных с чрезмерно высокими уровнями фактора некроза опухоли;
- применением димера лизоцима для изготовления фармацевтического препарата для профилактики болезней, связанных с чрезмерно высокими уровнями фактора некроза опухоли;
- применением димера лизоцима для изготовления лекарственного средства для управления высвобождением индуцируемым ВИЧ фактора некроза опухоли у бессимптомных носителей и у пациентов, имеющих комплекс болезней, связанных со СПИДом;
- применением димера лизоцима для изготовления фармацевтических составов для лечения СПИДа;
- применением димера лизоцима для изготовления фармацевтического препарата для предотвращения и/или лечения сепсиса и септического шока;
- применением димера лизоцима для изготовления фармацевтического препарата для предотвращения и/или лечения кахексии;
- применением димера лизоцима для изготовления фармацевтического препарата для предотвращения и/или лечения лихорадки;
- введением инъекций, содержащих димер лизоцима в количестве 0,01 - 10 мг/мл, предпочтительно 0,1 - 1,0 мг/мл, апирогенного стерильного состава, включающего физиологически приемлемый растворитель и фармацевтически приемлемый консервант;
- введением внутривенно вышеуказанных инъекций в однократной или многократной дозе 0,02 мг/кг веса тела;
- пропитанные тампоны и антисептическая одежда, а также мази или гели, содержащие эффективные дозы димера лизоцима для предотвращения сепсиса и септического шока и для лечения инфицированных ран;
- вагинальные тампоны, пропитанные эффективной дозой димера лизоцима для применения во время менструации.

В качестве димеризованной формы лизоцима предпочтительно используют изолированный очищенный димер лизоцима. В некоторых случаях возможно применение составов, которые помимо димера лизоцима также содержат небольшие фракции тримера и высших олигомеров фермента.

Инъекции согласно настоящему изобретению могут также применять внутримышечно и подкожно. В некоторых случаях можно также соответствующим образом применять тот же самый жидкий состав (одновременно или независимо) при внутриматочном и интрауддеральном (введении внутрь вымени) или локальном введении - в конечном счете вместе с другими местными препаратами.

Предпочтительные апирогенные стерильные составы, включающие, по крайней мере, один физиологически приемлемый растворитель и/или, по крайней мере, один фармацевтически утвержденный консервант, состоят из апирогенной стерилизованной воды или водного фосфатного буферного раствора (PBS) в качестве растворителя, а также тиомерсала в качестве утвержденного консерванта для протеиновых фармацевтических препаратов.

Димеризованную форму лизоцима получают в процессе контролируемой полимеризации мономера фермента, сопровождаемой аккуратной очисткой, в частности при удалении мономерной формы, имеющей упомянутые токсические побочные эффекты, а также тримеров и высших фракций олигомера постреакционной смеси. Для получения димерной формы фермента можно использовать любой известный способ полимеризации. Способ его получения, включающий стадии очистки, описан в международном патенте WO 91/10731.

Предыдущие предварительные клинические испытания димера лизоцима не обнаруживают никаких мутагенных или тератогенных эффектов, либо они очень слабо выражены. Единственная токсичная доза при оральном/кожном введении (LD₅₀) не поддается измерению (> 2000 мг/кг), а при внутривенном введении LD₅₀ составляет > 1000 мг/кг.

Новое применение димера лизоцима согласно изобретению подтверждено при испытаниях in vivo, а также доказана его эффективность in vivo при клиническом применении. Проведены также некоторые сравнительные испытания.

Ингибирующее действие на высвобождение TNF эффективно выявляют благодаря более широкому спектру действия димера лизоцима, а именно его способности индуцировать высвобождение IFN, а также вызываемое им повышение фагоцитоза. Эти два упомянутых свойства являются важными факторами в естественных защитных механизмах. Соответственно терапевтическое и профилактическое действие вышеупомянутых новых применений димера лизоцима поддерживается естественными защитными механизмами, а также одновременно усиливается ими.

Далее настоящее изобретение иллюстрируется примерами, в которых приводятся ссылки на прилагаемые чертежи, графически иллюстрирующие результаты наиболее важных испытаний:
Фиг. 1 иллюстрирует подавление высвобождения IFN in vitro в культуре лимфоцитов, оптимально стимулируемой ConA в присутствии димера лизоцима при различных разбавлениях.

Фиг. 2 иллюстрирует уровень IFN в крови новорожденных (определенный экспериментально).

Фиг. 3 иллюстрирует уровень IFN в крови новорожденных (определенный экспериментально) при сравнительном испытании терапевтической эффективности лекарственных средств согласно изобретению.

Пример 1.

Для определения иммуноактивности димера лизоцима исследуют человеческие периферийные димоциты крови с анализом при помощи активируемого флюоресценцией анализатора клеток (FACS).

Митогенная стимуляция периферийных лимфоцитов человека - это хорошо отработанный метод проверки реактивности наиболее важных клеток иммунной системы. Для того чтобы проверить влияния терапевтических веществ на активацию и пролиферацию лимфоцитов от здоровых доноров крови, в оптимальную дозу добавляют митоген, затем окончательно измеряют количественный ответ лимфоцитов, имеющих иммунорелевантные параметры. Результаты сравнивают с контрольным значением, полученным при отсутствии медикаментозного лечения.

Для стимуляции лимфоцитов используют ConA при концентрации 20 мг/мл в среде. Начальная концентрация клеток составляет 10⁶ клеток/мл. Краткоживущие культуры содержат в инкубаторе с CO₂ в течение одного (рецепторы IL-2 на лимфоцитах и HLA-Dr) или двух дней (для всех других испытаний). Следующие параметры измерений получены в качестве критериев клеточной активации:
- неоптерин (маркер для иммунной активации),
- b-2-микроглобулин (также маркер активации),
- интерлейкин-2 (лимфоцит-T-хелпер, полученный из аутокринного и паракринного вещества),
- интерлейкин-6 (гормон клеточной дифференцировки),
- фактор некроза опухоли - TNF (вазоактивный, множественно сильнодействующий интерлейкин),
- интерферон-a (фактор дифференцировки, в частности для B-лимфоцитов),
- тимидинкинза (фермент, регулируемый в пролиферативных клетках),
- рецептор лимфоцита интерлейкин-2 (акцепторная молекула для аутокринного и паракринного действия IL-2),
- лимфоцит Ki-67 (экспрессия антигена в активированных и пролиферативных клетках),
- лимфоцит HLA-Dr (антиген гистосовместимости класса II, регулируемый в течение иммунной реакции).

Следующие наблюдения получены в культуре супернатанта в отношении продуктов клетки.

Концентрация неоптерина, синтезируемого T-лимфоцитами в течение иммунного ответа в стимулируемых культурах, в настоящих экспериментах не заметно повышена выше контрольных значений при применении димера лизоцима в стимулируемых ConA клетках без использования тестируемого димера. При применении повышенной концентрации тестируемого димера значения неоптерина были немного выше.

Аналогично, значения β -2-микроглобулина при всех концентрациях димеров лизоцима колеблются вокруг контрольного значения.

Рецепторы IL-2, взятые с поверхности лимфоцита в течение развития культуры и предоставляющие информацию относительно общего оборота рецептора IL-2, находятся на сопоставимом уровне с рецепторами IL-2 на поверхности лимфоцита (см. ниже) и оказывают хорошее подавление при самой высокой концентрации тестируемого димера.

Интерлейкин-6 проявляет четкую тенденцию зависимости дозы от высших значений при более высоких концентрациях. Эта молекула имеет очень важное значение в кроветворении, клеточной дифференцировке и иммунной реакции. При тестировании первые три значения должны быть экстраполированы, так как самый высокий стандарт составляет только 2000 пг/мл.

Результаты, касающиеся остальных молекул, приведены ниже в таблице 1. В отличие от интерлейкина-6 TNF - α неожиданно обнаружен в супернатантах культуры в значительно меньших концентрациях за исключением двух последних шагов разбавления, которые оказываются неэффективными для подавления концентрации TNF.

Концентрацию тимидинкиназы измеряют в цитоплазме лимфоцитов после замораживания и оттаивания клеточных гранул. Тимидинкиназа отрегулирована в разделяющихся клетках и является хорошим маркером для клеточной пролиферации. Данные из таблицы 1 показывают снижение самых высоких тестируемых концентраций димера лизоцима; в других разбавлениях не обнаружено какой-либо четкой тенденции. Интерферон-a, в свою очередь, при тех же самых условиях обнаруживает значения, превышающие контрольные значения одного CanA при более высоких концентрациях. Видимое увеличение происходит со второго значения до третьего разбавления.

Маркеры лимфоцитов: HLA-Dr/CD3, маркер тканевой совместимости, выражен на активированных T-лимфоцитах в течение иммунной реакции. Полученные результаты показывают определенный процент активированных T-клеток в контрольной культуре; причем при различных концентрациях димера лизоцима в культурах значения колеблются вокруг контрольных значений.

Рецепторы IL-2 лимфоцитов: интерлейкин-2 является цитокином, синтезируемым лимфоцитами-T-хелперами после активации при помощи IL-1. IL-2 обладает аутокринным и паракринным действием. Лимфоциты-T-хелперы не только синтезируют IL-2, но также стимулируются этой молекулой для пролиферации. Рецепторы для IL-2 на поверхности лимфоцитов-T-хелперов отрегулированы после активации. Таблица 1 показывает, что при самой высокой концентрации димера лизоцима имеется заметное подавление рецепторов IL-2 на лимфоцитах, в то время как остальные значения не отличаются больше, чем в пределах ширины биологического спектра. Таблица 1 также содержит данные, относящиеся к Ki-67/CD8 и Ki-67/CD4. Ki-67 - это молекула пролиферации, появляющаяся в клетках, подвергнутых митозу. Ki-67 является важным параметром для оценки стимулируемых клеток и для диагноза опухоли. В полученных результатах наблюдается небольшое ингибирование клеточной пролиферации в супрессоре Ki-67 клеток (CD8) при двух самых высоких дозах димера лизоцима. В лимфоцитах-хелперах (CD4) при самой высокой дозе появляется существенное увеличение процента положительных клеток. При более низких дозах процент клеток с экспрессией Ki-67/CD4 слегка превышает контрольное значение.

Маркировка подавления TNF показана на фиг. 1.

Перечисленные выше иммунологические параметры, выбранные в зависимости от их потенциальной важности для иммунного ответа, анализируют методом, основанным на измерении влияния тестируемого вещества на оптимально стимулируемые ConA периферические лимфоциты человека, который является устойчивым, чувствительным и дает возможность оценить большое количество различных параметров. При некоторых концентрациях димеров лизоцима имеются заметные различия в результатах испытаний по сравнению со значениями испытаний лимфоцитов, стимулируемых только одним ConA, в то время как в примере с TNF и IFN- α наблюдаемые эффекты находятся четко в пределах диапазона всех тестируемых разбавлений.

Пример 2.

Лабораторные испытания выполняют для определения действия димера лизоцима на фагоцитарную функцию in vitro клеток молока и крови. Ранее было установлено, что при стандартном тестировании in vitro димер лизоцима не ингибирует пролиферацию микроорганизмов, выделенных из инфицированных молочных желез коров. Поскольку при клиническом применении введение димера лизоцима интрауддерально и одновременно внутривенно эффективно устраняет инфекционные заболевания молочных желез у коров, очевидно, что главным противобактериальным механизмом в молочных железах коров является фагоцитоз. Соответственно для определения действия димера лизоцима на фагоцитоз при испытаниях in vitro используют кровь и молоко как здоровых, так и инфицированных коров. Для сравнения эксперименты проводят при той же самой концентрации тестируемого вещества и том же самом времени инкубации, используя клетки, полученные от здоровых и инфицированных коров или даже от инфицированной и здоровой частей молочной железы той же самой коровы, чтобы устранить различия индивидуального ответа.

При тестировании крови или молока здоровых и инфицированных коров добавляют как очищенную димерную форму, так и смесь димера и малых фракций тримеров и высших олигомеров лизоцима в концентрациях 25 - 0,25 мг/мл, затем смесь инкубируют при 37^oC в течение 0,5 - 24 часов. Для каждого образца определяют процент фагоцитирующих клеток (индекс фагоцитоза по методу Wisniewski et al) и процент NBT-положительных гранулоцитов (согласно Park).

Димер лизоцима усиливает фагоцитарную активность лейкоцитов при испытаниях in vitro. Это воздействие зависит от дозы и времени инкубации. Для активации лейкоцитов молока необходимы более высокие концентрации димера лизоцима, чем для активации лейкоцитов крови. Чрезмерно высокие концентрации димера несколько снижают in vitro фагоцитарную активность. Выбранные результаты приведены в таблицах 2 и 3, в которых термин "димер лизоцима +" используется для обозначения состава, содержащего малую фракцию тримеров и высших олигомеров лизоцима, как указано выше в описании. Результаты главным образом показывают, что как только реакционная смесь после полимеризации не содержит никаких цитотоксических мономерных форм димера, сопоставимые результаты получают для высокоочищенного и менее чистого димеризованного лизоцима.

Ясно, что степень очистки димера лизоцима не оказывает никакого заметного влияния на наблюдаемую фагоцитарную активность лейкоцитов молока. Впоследствии может оказаться, что клетки эффектора могут быть гранулоцитами.

В дальнейших примерах излагаются результаты исследований in vitro. Для клинических испытаний используют состав 2 мг димера лизоцима в 10 мл раствора PBS. Этот препарат обозначен как KLP-602.

Пример 3.

При внутривенном введении KLP-602 стимулируют фагоцитарную активность гранулоцитов крови у здоровых и больных и у здоровых новорожденных жеребят, а также у молочных коров после интрауддерального введения. Это влияние проявляется в увеличении числа нейтрофилов и повышении способности поглощать стафилококки и снижать NBT. Это явление происходит прежде всего в течение первых 12-24 часов после инъекции препарата. Эффект KLP-602 на фагоцитарную активность в вымени зависит от дозы и лекарственной формы и реакции отдельного животного.

Димер лизоцима используют для терапии инфекционных болезней рогатого скота, свиней, лошадей и собак. В различных дозах и в различных интервалах времени препарат вводят внутривенно, внутримышечно, подкожно, интрауддерально и внутриматочно. Медикаментозному лечению подвергают 346 коров, 274 новорожденных, 110 свиноматок и кабанов, 294 поросят, 709 молочных поросят, 35 жеребят и 107 собак. Альтернативное лечение применяют как контрольное. Благодаря природе подопытных животных, ни одно не было оставлено без терапевтического лечения по этическим причинам. Однако выводы можно было сделать при сравнении с клинической картиной лечения болезней, известной из ветеринарной литературы.

Пример 4.

При проведении испытаний на детенышах уровень в крови INF и TNF определяют для группы здоровых и инфицированных животных, причем последних не подвергают лечению в первые 12 часов инфекционного заболевания, затем дают антибиотики и проводят лечение димером лизоцима в высокоочищенной форме. Полученные результаты графически иллюстрируются на фиг. 2 и 3, показывая соответственно уровни TNF и IFN. На фиг. 2 и 3 представлены истинные результаты, наблюдаемые на образцах крови четырех отдельно идентифицированных новорожденных. На фиг. 2 и 3 линия 1 представляет собой результаты в крови здорового жеребенка, а линия 2 - результаты инфицированного, но не подвергнутого лечению жеребенка (уровень IFN на 12-ый час, равный 45 U/мл, не показан, но диаграмма указывает значение направлением линии 2). Затем животное было подвергнуто известному лечению на 12-ый час и линия 3 показывает результаты у жеребенка после лечения антибиотиками, линия 4 - результаты у жеребенка после лечения KLP-602.

В группе, которой вводят димер лизоцима, после одной или двух инъекций KLP-602 выздоравливают более 90% детенышей, страдающих от гастроэнтерита, и более чем 85% детенышей, больных острой бронхопневмонией. Очень характерным является быстрое исчезновение таких симптомов, как лихорадка и понос. Лечение этим лекарственным препаратом не требует обеспечения животных дополнительными жидкостями. Время и скорость выздоровления превосходят таковые значения у контрольной группы, подвергнутой лечению антибиотиками.

Пример 5.

KLP-602 наиболее эффективен при лечении болезней, поражающих свиней. 100% или почти 100% животных выздоравливают от следующих болезней: послеродовая агалактия (синдром ММА), дизентерия, пиометра, грипп и коли-бактериоз. Применение лекарственного средства в случаях отека и бронхопневмонии дает менее очевидные, но все же значительно лучшие результаты, чем получаемые при альтернативных способах лечения. Наблюдаемое незамедлительное снижение поноса (обычно в течение первых 24 часов) и лихорадки, а также возобновление секреции молока особенно важно в случаях послеродового воспаления вымени и матки, что спасает жизнь поросят. В таблице 4 показана эффективность терапии KLP-602 по сравнению с альтернативными методами лечения.

Пример 6.

100% жеребят, страдающих от энтерита, и 83,3% жеребят, больных бронхопневмонией, при лечении KLP-602 выздоравливают быстрее, чем контрольная группа, которой вводят известные препараты.

Пример 7.

KLP-602 тестируют при лечении некоторых болезней у собак, например, типа фолликулита (эффективность составляла 100%), инфекционных заболеваний верхних и нижних дыхательных путей и инфекционных заболеваний желудочно-кишечного тракта, характерными симптомами которых является понос. В этой группе более всего распространен парвовирус, который, как известно, является практически неизлечимой болезнью. Однако и при заболеваниях парвовирусом наблюдают около 75% случаев выздоровления.

При испытаниях на животных, пораженных естественно возникающими болезнями, сделано несколько важных наблюдений.

1. Терапия является эффективной и очень простой при лечении болезней, имеющих многофакторные этиологию и патогенез (такие болезни распространены в популяциях животных и с ними тяжело справляться особенно в питомниках, где очень легко происходит распространение эпидемических болезней). Такие открытия доказывают модулирующий эффект димера лизоцима на естественные защитные механизмы.

2. Терапия является эффективной для болезней, которые при их естественном течении вызывают эндотоксический шок или другие нарушения типа длительной лихорадки, сопровождающейся высокой температурой, и оказывают воздействие на состояние животного в течение длительного периода времени после выздоровления, причиняя таким образом большой вред животным, таким как лошади (жеребята), которых разводят для гонок и других спортивных состязаний, а также, главным образом, для пищевой промышленности, когда издержки производства имеют критическое значение. Быстрое выздоровление позволит существенно сократить затраты на лечение таких болезней.

3. Результаты, наблюдаемые in vivo, подтверждают подавление уровней TNF при лечении димерами лизоцима различных возникающих естественным путем инфекционных болезней и таким образом подтверждают заявляемое изобретение.

Пример 8.

Исследования действия димера лизоцима на активность антибиотиков против различных микроорганизмов проводят для выбора бактерии для дальнейших испытаний, определения доз антибиотиков, наиболее эффективных для отобранных микроорганизмов, и определения диапазона концентраций димера лизоцима, в пределах которого будут наблюдаться ожидаемые эффекты. В экспериментах используют две серии лиофилизированного очищенного димера лизоцима - одну, полученную в 1991 г. и другую - в 1992 г. В экспериментах применяют антибиотики, доступные на польском рынке, поставляемые польским изготовителем лекарств Polfa, такие как пенициллин, неомицин, эритромицин, цефалоспорин (SEFRIL).

Тестируемые антибиотики суспендируют в буферном растворе NaCl (PBS-Biomed) или в бычьей сыворотке. К суспензии добавляют димер лизоцима таким образом, чтобы в тестируемых образцах концентрации димера всегда составляли 5 мг/мл. В каждом испытании концентрации тестируемых антибиотиков различные в зависимости от варьирующей чувствительности используемых микроорганизмов.

Эффективность одного антибиотика или в комбинации с димером лизоцима тестируют в PBS или в суспензии бычьей сыворотки in vitro на Escherichia coli, Salmonella enteritidis, Staphylococcus aurens и Streptococcus uberis, полученных от больных животных. В экспериментах также используют лабораторные штаммы Sarcina lutea 9341 ATCC и Staphylococcus aurens 209 P.

Поскольку испытания носят предварительный характер, каждый антибиотик проверяют в отношении 1, 2 или 3 различных видов бактерии следующим образом.

1. Подготовка чашек Петри
В 0,05 мл 18-часового бульона культуры тестируемой бактерии добавляют 14 мл образца обогащенного агара (Biomed). Смесь перемешивают и выливают на чашку Петри диаметром 10 мм. После охлаждения и отверждения агара помещают стерильные цилиндры, которые заполняют растворами тестируемых антибиотиков.

2. Подготовка растворов антибиотиков
10 мг образца тестируемого антибиотика предварительно растворяют в PBS; затем требуемый объем этого раствора добавляют к определенному объему PBS или бычьей сыворотки для получения концентрации антибиотика, наиболее близкой к MIC (минимальная ингибирующая концентрация); каждый раз готовят растворы 3 различных концентраций.

3. Приготовление раствора димера лизоцима
10 мг лиофилизованного димера лизоцима предварительно растворяют в 10 мл PBS. Дальнейшие разбавления готовят либо с PBS или с бычьей сывороткой и добавляют к растворам антибиотиков, приготовленным ранее как описано выше. Тестируют следующие комбинации:
- антибиотик/PBS,
- антибиотик/PBS + димер лизоцима,
- антибиотик/сыворотка,
- антибиотик/сыворотка + димер лизоцима.

В каждом цилиндре концентрация антибиотика была той же самой; концентрация димера лизоцима составляет 5 мг/мл. После заполнения цилиндров растворами чашки Петри сохраняют при комнатной температуре в течение 2 часов, затем культуры инкубируют при 37^oC.

4. Получение результатов и оценка активности
Чашки Петри удаляют из нагревателя после 18-часовой инкубации и измеряют диаметр зоны ингибирования роста бактерий (отсутствие колоний) вокруг цилиндров.

Не обнаружено никакого различия в размерах зон ингибирования роста бактерий вокруг цилиндров, заполненных суспензиями антибиотика в PBS без и с добавкой димера лизоцима концентрацией 5 мг/мл. Размер зоны ингибирования был меньше вокруг цилиндров, заполненных суспензией антибиотика в бычьей сыворотке, однако больше вокруг цилиндров, заполненных антибиотиком + суспензией димера лизоцима в бычьей сыворотке. Зоны были больше, чем наблюдаемые вокруг цилиндров, заполненных суспензиями PBS, а также больше, чем вокруг цилиндров, заполненных суспензиями сывороток только антибиотиков, без добавки димера лизоцима.

Обнаружен феномен при испытаниях с пенициллином, используемым против Sarcina lutea. Ампицилин проявляет синергизм в комбинации с димером лизоцима при ингибировании in vitro роста Escherichia coli, Salmonella enteritidis и Staphylococcus epidermidis. Отмечено увеличение активности эритромицина в присутствии димера лизоцима против Staphylococcus aurens 209 P и Streptococcus uberis, а также в присутствии SEFRIL - против Staphylococcus aureus 209 P, Escherichia coli и Salmonella enteritidis и устойчивы к этому антибиотику.

Увеличение противобактериальной активности тестируемых антибиотиков наблюдается только при использовании бычьей сыворотки в качестве растворителя. Как правило, увеличение составляет в среднем 50%, но в некоторых случаях присутствие димера лизоцима приводит к увеличению активности антибиотиков на 100%.

Выводы
Димер лизоцима (без любого консерванта) в концентрациях 5 мг/мл обнаруживает in vitro синергизм с некоторыми антибиотиками, используемыми в MIC (минимальных ингибирующих концентрациях) в присутствии бычьей сыворотки при ингибировании роста бактерий. Результаты, полученные в настоящее время, несомненно свидетельствуют о необходимости дальнейших исследований.

Пример 9.

Синергизм с AZT при лечении пациентов, больных СПИДом:
Ito, M. et al. недавно сообщили, что TNF-a может быть антагонистом активности AZT против ВИЧ (Ito. M. et al.: "Tumor necrosis factor antagonizes inhibitory effect of azidothymidine on human immunodeficiency virus (HIV) replication Vitro; Biochem. Biophys. Res. Commun. 1990, 166; 1095-1101). Пациенты, больные СПИДом в прогрессирующей стадии, страдают от большого количества случайных инфекционных болезней. Некоторые инфекционные агенты могут стимулировать увеличение TNF, IL-6 и других цитокинов, которые могут либо подавлять иммунитет, либо усиливать репликацию ВИЧ.

Соответственно лечение только AZT недостаточно эффективно. Для увеличения активности AZT против ВИЧ предложено объединить лечение AZT с введением димера лизоцима в целях ингибирования синтеза TNF - фактора - антагониста активности AZT против ВИЧ.

Изобретение относится к медицине. Предложено применение димера лизоцима для модуляции естественных защитных механизмов у животных или человека. Вещество ингибирует высвобождение фактора некроза опухоли, усиливает фагоцитоз, увеличивает высвобождение интерферона и интерлейкина-6. 2 с. и 14 з.п.ф-лы, 4 табл., 3 ил.

1. Применение димеризованной формы лизоцима в качестве активного ингредиента лекарственного средства для модуляции естественных защитных механизмов у животных или человека, включающий, по крайней мере, одно из следующих действий: ингибирование высвобождения фактора некроза опухоли (TNF), уменьшение уровня TNF, усиление фагоцитоза, увеличение высвобождения интерферона, увеличение высвобождения интерлейкина-6. 2. Применение по п.1 для усиления защитных механизмов. 3. Применение по п.1 или 2 для понижения уровня TNF, превышающего 13,75 пг/мл. 4. Применение по любому из пп.1 - 3 для введения указанного лизоцима в единичной или повторяющейся дозе в количестве от 0,3 мкг до 1 мг на 10⁶ лимфоцитов периферической крови (PBL). 5. Применение по любому из пп.1 - 4 для профилактического или терапевтического применения. 6. Применение по п.5 для профилактики, по крайней мере, одного из следующих состояний: воспаления, лихорадки, сепсиса, септического шока, кахексии. 7. Применение по п.5 для терапевтического лечения, по крайней мере, одного из следующих заболеваний: сепсиса, септического шока, кахексии. 8. Применение по любому из пп. 1 - 5, где указанное лекарственное средство включает димеризованный лизоцим в комбинации с антибиотиком и/или AZT. 9. Применение по п. 8, где указанное лекарственное средство включает димеризованный лизоцим в комбинации с антибиотиком для увеличения антибактериальной активности антибиотика, по крайней мере, до 50%. 10. Применение по любому из пп. 1 - 9, где лекарственное средство представляет собой раствор для инъекций, включающий димеризованный лизоцим в количестве от 0,01 до 10 мг/мл, предпочтительно 0,1 - 1,0 мг/мл, апирогенной стерильной композиции, включающей, по крайней мере, физиологически приемлемый консервант. 11. Применение по любому из пп. 1 - 10 для введения в единичной или повторяющейся дозе 0,02 мг/кг веса тела. 12. Применение по любому из пп.1 - 7, где указанное лекарственное средство представляет собой гель или мазь для местного применения. 13. Применение по любому из пп.1 - 12 для пропитывания антисептической одежды или тампона эффективной дозой димеризованной формы лизоцима. 14. Фармацевтическая композиция для модуляции естественных защитных механизмов у животных или человека, включающих, по крайней мере, одно из следующих действий: ингибирование высвобождения фактора некроза опухоли (TNF), уменьшение уровня TNF, усиление фагоцитоза, увеличение высвобождения интерферона, увеличение высвобождения интерлейкина-6, включающая активный ингредиент и апирогенную стерильную композицию, включающую, по крайней мере, один физиологически приемлемый растворитель и/или, по крайней мере, один фармацевтически приемлемый консервант, отличающаяся тем, что в качестве активного ингредиента используют димеризованную форму лизоцима в количестве от 0,01 - 10 мг/мл, предпочтительно 0,1 - 1,0 мг/мл. 15. Фармацевтическая композиция по п. 14, отличающаяся тем, что она представляет собой комбинацию с антибиотиком и/или AZT. 16. Фармацевтическая композиция по п.15, в которой димеризованный лизоцим представлен в комбинации с антибиотиком для увеличения антибактериальной активности антибиотика, по крайней мере, до 50%.