СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЖИЗНЕСПОСОБНОСТИ ЭМБРИОНОВ Российский патент 2000 года по МПК A61D19/00 A61D19/04 

Изобретение относится к сельскому хозяйству, в частности к биотехнологии, и может быть использовано при трансплантации эмбрионов сельскохозяйственных животных.

Для обеспечения высокой эффективности метода трансплантации эмбрионов в селекционных программах необходимо с высокой степенью точности прогнозировать приживляемость их после нехирургической трансплантации.

Однако до сих пор не существует объективных и вместе с тем простых методов определения качества эмбрионов и прогнозирования их выживаемости.

Существуют методы оценки качества эмбрионов in vitro, которые предполагают использование красителей, выявляющих ферментную активность (флуоресцин-диацетат) (2) или специальной метки, определяющей повреждение мембран при дефектных состояниях эмбриональных клеток (3). Однако эти методы не лишены недостатков, так как дополнительные манипуляции с эмбрионами в процессе их оценки могут стать причиной снижения или полной потери способности их к дальнейшему развитию, кроме того, они требуют дополнительных затрат на реактивы и усилий специалистов.

Более близким к предлагаемому является метод временного культивирования эмбрионов in vitro в лабораторных условиях для уточнения оценки качества по морфологическим критериям (1). Работу по оценке эмбриона проводят под стереомикроскопом с увеличением в 60-80 раз, учитывая стадию развития эмбриона, соответствие ее хронологическому возрасту, определяют морфологию зародышей и, исходя из этих критериев, оценивают качество зародыша и его пригодность для дальнейшего использования. Культивирование проводят в термостате при температуре 37^oC в течение 24-48 часов. После этого проводят вторую оценку их жизнеспособности под микроскопом. Эмбрионы, развившиеся соответственно ожидаемой стадии считают пригодными для целей трансплантации. К недостатку приведенного способа относятся дополнительные затраты времени и длительное нахождение эмбриона вне организма, что может привести к повреждениям его структур и снижению жизнеспособности.

Целью изобретения является повышение точности определения жизнеспособности эмбрионов крупного рогатого скота.

Поставленная цель достигается тем, что после морфологической оценки извлеченных эмбрионов их замораживают до температуры минус 196^oC, затем оттаивают и проводят повторную морфологическую оценку их качества. При этом учитывают изменение балльной оценки после оттаивания по сравнению с оценкой до замораживания.

Сущность способа заключается в том, что к жизнеспособным относят те эмбрионы, которые в процессе замораживания и оттаивания не снизили своей оценки.

Предлагаемый способ повышает точность определения жизнеспособности эмбрионов при замораживании и позволяет по степени изменения их качества прогнозировать результаты приживляемости после нехирургической трансплантации.

Вместе с тем, данный способ позволяет повысить эффективность метода трансплантации эмбрионов при размножении животных выдающихся генотипов, поскольку дает возможность использовать все полученные эмбрионы, включая и зародыши с оценкой качества 3 балла (табл. 1). По ныне действующей инструкции эмбрионы с оценкой 3 балла считаются непригодными для замораживания и подлежат выбраковке.

В связи с тем, что повторную оценку качества эмбрионов проводят после оттаивания, жизнеспособность эмбрионов можно определять непосредственно перед пересадками в удобное для этого время, исключая длительный процесс культивирования вне организма (24-48 час.). Кроме того, эмбрион в замороженном состоянии может находится длительное время, не теряя своей жизнеспособности.

Так как определение жизнеспособности в заявленном способе не зависит от перехода одной стадии развития в другую и способ позволяет определить жизнеспособность эмбрионов на любой стадии, включая позднюю бластоцисту, точность предлагаемого способа значительно выше по сравнению с прототипом.

Предлагаемый способ осуществляется следующим образом: эмбрионы крупного рогатого скота в возрасте 7-8 дней после нехирургического извлечения оценивают по стадии развития и морфологическим критериям по 4-х балльной шкале ("Инструкция по трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота", М., 1987). Затем их замораживают в среде Дюльбекко с 20% фетальной сыворотки теленка с использованием в качестве криопротектора 1,5М раствора глицерина в программируемом замораживателе ЭМБИ-К ("Методические рекомендации по замораживанию, хранению и оттаиванию эмбрионов крупного рогатого скота", М., 1991). Перед пересадками эмбрионы оттаивают, удаляют криопротектор и проводят повторную оценку по морфологическим критериям. На основании морфологического строения стадии развития и соответствия ее возрасту эмбрионы делят на категории (баллы):
- отличный (5) эмбрион идеальный, сферический, симметричный, с клетками одного размера, цвета и плотности, стадия развития соответствует возрасту;
- хороший (4) - эмбрион имеет незначительные изъяны, такие как несколько бластомеров, выделившихся из общей массы в перивителлиновое пространство, неправильную форму клеточной массы, несколько вакуолей, стадия соответствует возрасту;
- удовлетворительный (3) - морфологическое строение имеет серьезные замечания: присутствие разрушенных бластомеров, сильная вакуолизация, неоднородное окрашивание, низкая плотность клеточной массы, наличие множества клеток в перивителлиновом пространстве, отставание развития до 24 часов;
- плохой (2) - многочисленные вытесненные из общей массы бластомеры, нарушение межклеточных связей, дегенерированные клетки, клетки различного размера, много крупных вакуолей и гранул, отставание развития более 24 часов. Такие эмбрионы выбраковывают. В соответствии со степенью снижения качества эмбрионов после оттаивания по сравнению с качеством до замораживания определяют их дальнейшую жизнеспособность.

Изобретение иллюстрируется следующим примером.

В хозяйствах Московской области проведены пересадки эмбрионов нехирургическим методом животным-реципиентам. В реципиенты подбирали телок случного возраста (17-20 мес.) с живой массой 360-380 кг. Группы животных были сформированы по методу групп-аналогов. Все пересадки и манипуляции с эмбрионами проведены одними и теми же специалистами. Одной группе реципиентов пересажены эмбрионы, не изменившие своей качественной оценки после замораживания-оттаивания. Второй группе телок пересадили эмбрионы, которые после оттаивания снизили оценку на 1 балл, третьей группе животных пересадили зародыши со снижением качества более 1 балла (табл. 2). При неизменном качестве эмбрионов после криоконсервации их приживляемость составила 56,9%, тогда как при снижении качества на 1 балл стали стельными 43,1% реципиентов, а при снижении качества более 1 балла прижилось только 29,3% эмбрионов. То есть, при снижении балльной оценки после замораживания-оттаивания жизнеспособность эмбрионов также снизилась на 13,8% и 27,6% соответственно.

Из полученных данных следует, что жизнеспособность эмбрионов обратно пропорциональна степени снижения их качества после замораживания-оттаивания. Коэффициент корреляции составляет - 0,98 (p<0,001). При снижении балльной оценки приживляемость эмбрионов снизилась на статистически достоверную величину.

Способ определения жизнеспособности эмбрионов относится к сельскому хозяйству и может быть использован при трансплантации эмбрионов сельскохозяйственных животных. Сущность изобретения заключается в том, что качество эмбриона оценивают дважды: до замораживания, затем после замораживания и оттаивания и по результатам сравнения этих оценок определяют жизнеспособность эмбриона. К жизнеспособным относят эмбрионы, которые не изменили своей оценки в процессе криоконсервации. Способ позволяет повысить точность определения жизнеспособности эмбрионов при замораживании и по степени изменения их качества прогнозировать результаты приживляемости после нехирургической трансплантации. Способ также дает возможность использовать эмбрионы с оценкой 3 балла для замораживания. 2 табл.

Способ определения жизнеспособности эмбрионов крупного рогатого скота, включающий проведение двух оценок качества эмбриона, разделенных интервалом времени, и определение его жизнеспособности по результатам сравнения этих оценок, отличающийся тем, что, с целью повышения точности способа, качество эмбриона оценивают повторно после замораживания и оттаивания, и к жизнеспособным относят эмбрионы, которые не изменили своей оценки в процессе криоконсервации.