СПОСОБ ОТБОРА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА НА УСТОЙЧИВОСТЬ К ТУБЕРКУЛЕЗУ Российский патент 1997 года по МПК A01K67/02 

Изобретение относится к сельскому хозяйству, а именно к животноводству, и может быть использовано в селекции крупного рогатого скота на повышение устойчивости, в частности, к туберкулезу.

На туберкулез, кроме главного этиологического фактора микобактерий, существенное влияние оказывает наследственная устойчивость к данному заболеванию. Генетические возможности животных по устойчивости к туберкулезу в пределах популяции имеют большое разнообразие и есть смысл в отборе таких животных, которые невосприимчивы к заболеванию туберкулезом. Данная проблема заслуживает внимания еще и потому, что туберкулез не поддается лечению и пока не разработаны надежные средства профилактики этого заболевания вакцинация не дает должного эффекта. Кроме того, туберкулез крупного рогатого скота (Micobakteria bovis) вызывает заболевание у человека. Поэтому мероприятия, направленные на решение проблемы изыскания способа отбора крупного рогатого скота устойчивого к туберкулезу имеют важное значение.

В ранее проведенных исследованиях для определения генетических маркеров устойчивости к туберкулезу использовали в основном полиморфные системы сыворотки крови [1] у коров черно-пестрой породы, где установлено, что животные с аллелем TfA и AH туберкулезом болеют чаще, чем коровы с другими аллелями. А также имеются исследования по изучению ассоциаций групп крови [2] с туберкулезом при оздоровлении ГПЗ "Канаш" Куйбышевской обл. С этой целью проводили отбор коров с группами крови, которые чаще встречались у здоровых животных.

Недостаточность этих исследований заключается в следующем. Во-первых, исследования проводились по частоте встречаемости в стаде отдельных факторов, что не может дать истинной картины так как туберкулез находится под полигенным контролем. Во-вторых, полиморфные системы групп крови и белков не ответственны непосредственно за резистентность организма к тому или иному заболеванию и может только косвенно указывать на вероятность таких связей. Генетические маркеры групп крови и белков или находятся на тех же хромосомах с генами, продукты которых отвечают за устойчивость, или могут быть в блоке с генами, определяющими устойчивость.

В отличие от вышерассмотренных генетических систем главный комплекс антигенов гистосовместимости ГКГС, который у крупного рогатого скота обозначается как BoLA-система, непосредственно отвечает за контроль иммунитета. По данным литературы обнаружены многочисленные сообщения о связи BoLA-системы с различными заболеваниями. Кроме того, результаты проведенных нами исследований ряда маркеров различных систем крови с заболеванием туберкулезом свидетельствует о том, что достоверность данных в оценке животных на устойчивость к туберкулезу повышалась при определении комплекса систем крови. В определении животных, восприимчивых к развитию туберкулезного процесса, высокие результаты были получены при анализе главного комплекса антигенов гистосовместимости, но при этом было показано, что использование комплексных систем крови значительно расширяет информацию о животном, выявляет истинно доминирующие ассоциации антигенов крови.

Целью данного изобретения является отбор крупного рогатого скота на устойчивость к туберкулезу с использованием генетических маркеров крови. Цель достигается тем, что для комплектования стад отбирают животных по комплексу маркеров устойчивости, а также проводят жесткий контроль по использованию быков-производителей.

Предлагаемый способ заключается в том, что для выявления животных, устойчивых к туберкулезу, в других породах, породных группах или линиях предварительно проводят сравнительный анализ иммуногенетических показателей у устойчивых и больных туберкулезом коров и выявляют наиболее значимые аллели с подтверждением разницы критерием χ² Тем самым определяют аллели, которые имеют наибольшее распространение среди устойчивых животных и одновременно у больных. Затем эти аллели можно использовать в качестве маркеров устойчивости.

Для того чтобы отобрать устойчивых животных к туберкулезу, необходимо сформировать две группы животных: здоровые и больные. При определении больных туберкулезом коров использовался комплексный подход, с учетом аллергической пробы проводили клинические исследования, патологоанатомические, серологические методы и для идентификации микобактерий бактериологическое исследование с применением биопробы. Аллергические исследования животных проводили в хозяйствах в соответствии с "наставлением по применению туберкулинов для диагностики туберкулеза у млекопитающих и птиц", утвержденным Главным управлением ветеринарии. Кроме туберкулинизации, поголовье крупного рогатого скота подвергали клиническому исследованию, где учитывались: упитанность, наличие или отсутствие кашля, увеличение подчелюстных, предлопаточных, коленной складки и надвымянных лимфатических узлов. Бактериологическое исследование проводили в области ветлаборатории. Из серологических методов были использованы реакция связывания комплемента (РСК) с антигеном СИБНИВИ и иммуноферментный анализ по методике E. Engvar, P. Perlman (1971). Группу больных туберкулезом составляли животные, положительно реагирующие по аллергической пробе, а также с клиническими признаками болезни, которые направлялись на мясокомбинат, где проводился отбор проб крови от животных с явной картиной туберкулезных изменений. Вторую группу составляли коровы, которые не давали ни одного положительного диагностического теста на туберкулез. При этом для исследований отбирали коров в возрасте 3-х и более лактаций. У животных кровь для анализа отбирали сразу после забоя в две пронумерованные пробирки, в одной содержалось 3 4 мл антикоагулянта. Содержимое пробирок тщательно перемешивают и закрывают пробкой. На каждую партию крови составляли ведомость, в которой указывали инвентарный номер животного, кличку, пол, дату рождения, клички и инвентарные номера и другие интересующие показатели. Затем кровь доставляли в лабораторию, где проводили исследования антигенов BoLA-системы и групп крови.

После чего проводили статическую обработку полученного материала. Частота антигенов, контролирующих их генов и среднее отклонение определяли по формуле

где,
f частота антигена, аллеля
P частота гена;
m среднее отклонение;
n число носителей данного антигена;
N общее число обследованных животных.

Для подтверждения разницы между частотой носителей антигенов BoLA-системы и аллелей групп крови в группе больных коров и группе здоровых используют критерий χ²

где,
a больные носителя антигена;
b здоровые носители антигена;
c больные, не несущие антигена;
d здоровые, не несущие антигена;
Кроме того, нами использован метод, оценивающий степень корреляции между антигеном и болезнью, критерий относительного риска (RR). Биологический смысл показателя определение степени риска развития болезни у носителей антигена по сравнению с особями, не несущими антиген. При этом выделяют животных, у которых RR>2.

где f фракция носителей антигена среди больных;
f фракция носителей антигена у здоровых.

Установление корреляции данных антигенов с туберкулезом у симментальского скота подчеркивает возможность использования их в чисто практических целях при оздоровлении хозяйства от данной инфекции.

Предлагаемый способ позволяет повысить эффективность проводимых противотуберкулезных мероприятий путем снижения процента заболевших животных за счет использования животных, устойчивых к туберкулезу, и получения от них, при соответствующем подборе, потомства с повышенной жизнеспособностью.

Пример 1. Генетические особенности симментальского скота, здорового и больного туберкулезом по антигенам BoLA-ситемы.

Исследования проводили на популяции симментальского скота степного типа в хозяйствах Ртищевского района Саратовской области. На основании диагностических исследований на туберкулез отобрали группу здоровых животных (все отрицательные реакции) в количестве 215 голов и группу больных туберкулезом (положительно реагирующие) в количестве 178 голов.

Для исследования распространения антигенов Главного комплекса гистосовместимости использовали двухступенчатый микроцитотоксический тест по Kissmeyer Nilson 1970 г, в модификации для крупного рогатого скота. Материалом для наших исследований являлись иммунные антилейкоцитарные сыворотки, которые были получены методами иммуникации внутрикожным введением суспензии лейкоцитов в количестве 50-70х10 клеток и трансплантацией кожи.

Выделение чистых лимфоцитов из крови крупного рогатого скота проводили следующим методом: в пробирку на 2 мл градиента плотности (фиколл-верографин, плотность 1,076) наслаивали 2 мл крови крупного рогатого скота, взятой на стабилизаторе, и центрифугировали 40 мин при 400 g. После этого в пробирке остаются следующие фракции: на дне слой эритроцитов, содержащий гранулоциты, над ним матовый слой, состоящий из градиента плотности и лимфоцитов, затем находится белое кольцо лимфоцитов с тромбоцитами; самый верхний слой плазма крови. Для исследований отбирали пипеткой слой, содержащий лимфоциты, таким образом, чтобы не попадали эритроциты. Полученные лимфоциты трижды промывали физиологическим раствором для удаления попавших тромбоцитов (10 мин при 100 g). Жизнеспособность лимфоцитов проверяли 1%-ным раствором трипановой сини. Поврежденные лимфоциты окрашиваются в течение 10 мин. Суспензия лимфоцитов, содержащая до 10% поврежденных клеток, пригодна для типирования.

Для цитотоксической реакции в классическом микроварианте использовали двухступенчатый метод Kismeyer Nilson. С этой целью использовали микроплазмы Terassaki, в лунки которых заливали вазелиновое масло. Количество клеток в суспензии 4000 в мм. К 1 мкл иммунной тестируемой сыворотки добавляли 1 мкл суспензии лимфоцитов, смесь ставили в термостат на 30 мин при 27^oC. Далее добавляли 2 мкл кроличьего комплимента и помещали в термостат еще на 60 мин. Затем окрашивали 1%-ным раствором трипанового синего и под микроскопом читали результаты реакции, которую оценивали по 4-бальной системе (по соотношению живых и мертвых клеток). В качестве контроля вместо тестируемой сыворотки использовали физиологический раствор.

Анализ проведенных исследований (табл. 1) показал значительные различия между здоровыми и больными туберкулезом.

В результате анализа полученных данных установлено, что в группе здоровых коров отмечается повышение частоты антигенов- А1, А4, А2. Для больных туберкулезом коров характерным является носительство антигенов А7, А10, А8, А11.

В данной зоне для симментальского скота при комплектовании стад необходимо проводить отбор животных с антигенами: А1, А4 А2 и недопускать к использованию животных с антигеннами: А7, А10, А8, А11.

Пример 2. Генетические особенности симментальского скота здорового и больного туберкулезом по группам крови.

Объектом для исследований служили те же животные, что и в примере 1. Отбирали две группы животных: здоровые и больные.

Исследование групп крови у крупного рогатого скота проводят, начиная с двухмесячного возраста. При этом можно использовать моноспецифические реагенты, выпускаемые Армавирской биофабрикой. Пробы крови в лаборатории хранят при температуре +4^oC не более 20 дней с момента сбора. Из этих образцов готовили 8 10 мл 1,5%-ной суспензии трижды отмытых физраствором эритроцитов. Отмывали эритроциты следующим образом: в центрифужную пробирку отливали 1 мл крови, добавляли 9 10 мл физраствора, перемешивали и центрифугировали в течение 3 6 мин при 1,5 2,0 тыс. оборотов в минуту. Такую операцию проводили трижды. Затем в пробирку с 9,75 мл физраствора добавляли 0,25 мл осадка эритроцитов одного животного и перемешивали. Данную суспензию использовали для постановки капельной серологической гемолитической реакции между эритроцитами животного и стандартными реагентами, специфичными к определенному эритроцитарному антигену. Одновременно с приготовлением суспензии эритроцитов размораживали при комнатной температуре реагенты (моноспецифические сыворотки), взбалтывали их и доводили до рабочего титра физиологическим раствором с рабочим раствором реагента и 2,5%-ной суспензией эритроцитов исследуемого животного ставили реакцию гемолиза в присутствии комплимента (нормальной кроличьей сыворотки).

При постановке реакции гемолиза в пробирки или лунки иммунологических блоков с двумя каплями соответствующего реагента, разведенного до рабочего титра, добавляли одну каплю суспензии эритроцитов, перемешивали и добавляли через 15 мин одну каплю комплимента (сыворотки крови кроликов). Содержимое хорошо встряхивали и ставили на 30 мин в термостат с температурой +28 - 30^oC. Через 60 мин инкубировали пластины доставали из термопласта и осуществляли читку реакции в проходящем свете. После этого пластины встряхивали вновь и ставили в термостат. Через 60 мин инкубирования проводили вторую (заключительную) читку. Результаты учета заносили в бланк протокола "Гемолитический тест" 0-1-2-3-4. Реакцию оценивали по 5-балльной шкале.

После выяснения антигенного состава в эритроцитах (типов крови) определенного животного устанавливали аллели, контролирующие синтез этих антигенов.

Затем проводили сравнительный анализ частот аллелей группы крови у коров, устойчивых и предрасположенных к туберкулезу, и выявляли аллели, маркирующие генные комплексы устойчивости. По результатам наших исследований (табл. 2) среди симментальского скота (п 304) Ртищевского района Саратовской области, устойчивого к туберкулезу, наибольшее распространение имели животные с аллелями: I₂Y₂I'; G₂O₂T₂; ; B₂G₂KY₂A'O', а среди больных . Таким образом необходимо расширить использование животных а аллелями, маркирующими устойчивость к туберкулезу.

Литература
Джумков В. А. и др. Изучение гинетических и биохимических показателей крови у крупного рогатого скота, больных туберкулезом. Сб. Ветеринария наука производству. Минск, 1983, N 20.

Шишков В.П. Слепченко А.Р. Главный комплекс гистосовместимости животных: теоритические и практические аспекты. Вестник с.-х. науки. 1983. N 10.5

Использование: животноводство. Сущность изобретения: с целью получения устойчивости крупного рогатого скота к туберкулезу отбор животных для воспроизводства проводят по маркерам устойчивости с учетом комплекса полиморфных систем крови. Впервые для исследований используются антигены Bo A-системы. 2 табл.

Способ отбора крупного рогатого скота на устойчивость к туберкулезу, включающий иммуногенетический анализ крови и отбор по отдельным антигенным факторам, отличающийся тем, что проводят отбор животных по комплексу аллелей групп крови и антигенов BoLA-системы, маркирующих устойчивость.