АНДРОСТАНЫ Российский патент 2000 года по МПК C07J1/00 A61K31/568 

Предпосылки изобретения
Ссылки на родственные заявки
Данная заявка является частичным продолжением заявки США N 08/127908, поданной 28 сентября 1993 г., которая, в свою очередь, является частичным продолжением заявки США N 07/903604, поданной 24 июня 1992 г., которая, в свою очередь, является частичным продолжением заявки США N 07/708936, поданной 31 мая 1991 г., которая, в свою очередь, является частичным продолжением заявки США N 07/638185, поданной 7 января 1991 г., в настоящее время отозванной.

Заявка относится также к частичному продолжению других заявок на патенты США N 07/903604, 08/077359, поданных 15 июня 1993 г., и к находящейся на рассмотрении заявке на патент США N 07/903525, поданной 24 июня 1992 г. (частичное продолжение заявки США N 07/707862, поданной 31 мая 1991 г., которая, в свою очередь, является частичным продолжением заявки США N 07/638743, поданной 7 января 1991 г., в настоящее время отозванной), озаглавленной "Экстреновые стероиды в качестве нейрохимических инициаторов изменений функции гипоталамуса человека и связанные с ними лекарственные препараты и способы лечения"; и к частичному продолжению заявки на патент США N 07/903525, переданной правопреемнику и находящейся на рассмотрении, к заявке на патент США N 08/077140, поданной 15 июня 1993 г. Каждая из вышеупомянутых заявок на патент США вводится в настоящее описание посредством ссылки.

В конечном счете эта заявка может относиться к находящейся на рассмотрении заявке на патент США, озаглавленной "Ароматные препараты, содержащие феромоны человека", поданной 24 марта 1992 г., заявка США N 07/856435.

Область техники
В общих чертах настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям и способам осуществления изменения функции гипоталамуса человека и тем самым изменения поведения и физиологии человека, опосредованные гипоталамусом. Более конкретно, изобретение относится к использованию определенных андростеновых стероидов в качестве нейрохимических регуляторов физиологических поведенческих реакций.

Описание предшествующего уровня техники
Настоящее изобретение относится к определенным соединениям, а именно андростановым стероидам, в частности андростеновым стероидам и родственным соединениям, которые будут здесь описаны, и к способам применения этих соединений в качестве полухимических продуктов, предназначенных для изменения функции гипоталамуса в целях воздействия на дальнейшее поведение и физиологию человека, например для ослабления тревожных состояний. Андростановые стероиды, типичным представителем которых является тестостерон, характеризуются стероидной структурой, имеющей четыре кольца, и метилированием в 13-положении и в 10-положении. Андростены представляют собой подгруппу андростанов и имеют по крайней мере одну двойную связь. В своей работе, которая входит в настоящее описание в виде ссылки Ohloff, G. et al. (Helv. Chim. Acta (1983), 66: 192-217) показали, что несколько членов этой группы стероидов обладают запахом, который изменяется в зависимости от различных изомерных, диастереомерных и энантиомерных форм. Сообщалось, что некоторые члены этой группы действуют у различных видов млекопитающих, подобно феромону, как например 5α-андрост-16-ен-3-он и 5α-андрост-16-ен-3α-ол у свиней (Melrose, D. R. et al. Br. vet J. (1971) 127: 497-502). Эти 16-андростены, продуцированные у хряка, вызывают у свиноматок реакцию на спаривание (Claus, et al., Experimentia (1979) 35: 1674-1675).

В некоторых исследованиях отмечается, что у некоторых видов различные характеристики определенных 16-андростенов (включая 5α-андрост-16-ен-3α-ол и 5α-андрост-16-ен-3-он), такие как концентрация, метаболизм и локализация, являются диморфными по полу (Brooksbank et al., J. Endocr. (1972) 52: 239-251, Claus, et al., J. Endocr. (1976) 68: 483-484; Kwan, et al., Med. Sci. Res. (1987) 15: 1443- 1441). Так, например, 5α-андрост-16-ен-3α-ол и 5α-андрост-16-ен-3-он были обнаружены в различных концентрациях в периферической крови, слюне и в подмышечных выделениях мужчин и женщин (Kwan, Т.К. et al., Med. Sci. Res. (1987) 15: 1443-1444) и было высказано предположение, что их функционирование в качестве феромона человека воздействует, в некоторой степени, на осуществление выбора и формирование суждений (Id.: смотри также Gower, et al., "The Significance of Odorous Steroids in Axillary Odour", в Perfumery, pp. 68-72, Van Toller and Dodd, Eds., Chap-man and Hall, 1988); Kirk-Smith, D.A. et al. Res. Comm. Psychol. Psychiat. Behav. (1978) 3:379). Отмечалось, что андростенол (5α-aндpocт-16-eн-3α-oл), присутствующий в мужском одеколоне и женских духах, обнаруживает феромоноподобную активность (Andron^TM для мужчин и Andron^TM для женщин, Jovan). Заявка на патент Японии, принадлежащая Кокай, относится к парфюмерным композициям, содержащим андростенол и/или его аналоги. 5α-андростадиен-3β-ол (и, возможно, 3α-ол) были также найдены в подмышечных выделениях человека (Gower, et al., смотри выше на стр.57-60). С другой стороны, в литературе существуют небольшие разногласия относительно того, играет ли феромон действительно какую-либо роль в половом или репродуктивном поведении млекопитающих, в частности людей. Смотри: Beauchamp, G.K., et al., "The Pheromone Concept in Mammalian Chemical Communication: A Critique", в: Mammalian Olfaction, Reproductive Processes and Behaviour, Doty R. L., Ed., Academic Press, 1976). Смотри также выше: Gower, et al., на стр. 68-73.

В одном из вариантов своего осуществления настоящее изобретение относится к несистемному интраназальному введению определенных андростановых и андростеновых стероидов для воздействия на специфическую, поведенческую или физиологическую реакцию у человека, например на снижение отрицательной эмоциональной реакции, снятия депрессивных состояний и влияние на определенные черты характера. В частности, введение через нос обеспечивает контактирование нейрохимических рецепторов до сих пор не изученной нейроэндокринной структуры, обычно известной как сошниково-носовой орган ("VNO"; также известный, как "Якобсонов орган") с одним или несколькими стероидами или с препаратами, содержащими такой(ие) стероид(ы). Этот орган является доступным через ноздри большинства высших животных - от змей до человека и ассоциируется, между прочим, с рецепцией феромона у определенных видов (смотри Muller-Schwarze and Siverstein, Chemical Signals, Plenum Press, New York (1980)). Аксоны нейроэпителия сошниково-носового органа, расположенного выше неба, образуют сошниково-носовой нерв и имеют непосредственную синаптическую связь с дополнительной обонятельной луковицей, благодаря чему они осуществляют опосредованную передачу сигнала от этой луковицы в кортикально-медиальный миндалевидный базальный передний мозг и гипоталамусные ядра клеток головного мозга. В качестве нейрохимических рецепторов в VNO могут также служить дистальные аксоны нервных окончаний. Stensaas, L.J. et al., J. Steroid Biochem. and Molec. Biol (1991) 39: 353. Этот нерв имеет непосредственную синаптическую связь с гипоталамусом.

Johnson, A. et al., (J. Otolaryngology (1985) 14: 71-79) приводят доказательства присутствия сошниково-носового органа у большинства взрослых людей, но при этом делают заключение о том, что этот орган является, вероятно, нефункциональным. Об оспаривающих это положение результатах сообщают Stensaas, L. et al.; и Moran, D.T., et al., Garcia-Velasco, J. and M. Mondragon; Monti-Bloch, L. and B. Grosser, в своей работе J. Steroid Biochem. and Molec. Biol. (1991), 39, где предполагается, что VNO является функциональным хемочувствительным рецептором.

Из сказанного очевидно, что было бы желательно идентифицировать и синтезировать полухимические продукты и феромоны человека, и разработать лекарственные препараты и способы их применения для влияния на функцию гипоталамуса. Это изобретение основано на неожиданном открытии факта того, что при интраназальном введении человеку, определенные нейрохимические лиганды, в частности андростановые стероиды, более конкретно андростеновые стероиды и родственные соединения или фармацевтические композиции, содержащие андростаны, андростены или родственные соединения, специфически связываются с хеморецепторами определенных носовых и нейроэпителиальных клеток, и это связывание генерирует ряд нейрофизиологических реакций, приводящих к изменению функции гипоталамуса индивидуума. При введении надлежащим образом воздействие этих соединений на гипоталамус оказывает влияние на функцию вегетативной нервной системы и множество поведенческих или физиологических явлений, включающих, но ограничивающихся ими, тревогу, предменструальный синдром, страх, агрессию, голод, кровяное давление и другие поведенческие и физиологические функции, обычно регулируемые гипоталамусом: Otto Appenzeller. The Autonomic Nervous System. An introduction of basic and clinical concepts (1990); Korner, P.I. Central nervous control of autonomic cardiovascular function, and Levy, N.M. and Martion, P.J. Neural control of the heart, обе ссылки находятся в руководстве по физиологии; Раздел 2: Cardiovascular System - the heart. Vol. I, Washington Dc, 1979, American Physiological Society; Fishman, A.P., et al. editors, Handbook of Phisiology. Section 3, Respiratory System, Vol. II. Control of breathing. Bethesda M.D. 1986, American Physiological Society.

В некоторых случаях вводят один андростановый стероид или родственное соединение, в других случаях вводят комбинацию андростановых стероидов и/или родственных соединений.

Сущность изобретения
Соответственно, целью изобретения является получение новых стероидных соединений, которые представляют феромоны и которые являются подходящими для интраназального введения индивидууму.

Другой целью этого изобретения является получение соединений, которые могут быть использованы для изменения функции гипоталамуса, и которые обладают следующими преимуществами: 1) они могут быть введены непосредственно в хеморецепторы в носовом ходу и в сошниково-носовой орган без использования пероральных фармацевтических форм или игл - т.е. неинвазивно; 2) эти лекарственные средства действуют на нервную систему, а не через систему кровообращения, что позволяет воздействовать на функцию головного мозга без учета гематоэнцефалического барьера; 3) они непосредственно воздействуют на гипоталамус, так как существует только один синапс между рецепторами феномена и гипоталамусом; и 4) эти лекарственные средства обеспечивают в высокой степени специфический эффект, вследствие чего значительно снижается возможность возникновения нежелательных побочных явлений, поскольку сенсорные нейроны передают информацию в конкретный участок головного мозга.

Дополнительные цели, преимущества и новые признаки изобретения будут частично изложены в нижеследующем описании и частично станут понятными специалистам в данной области после ознакомления с этим описанием или могут быть изучены посредством осуществления изобретения на практике.

Цели этого изобретения достигаются путем получения нового стероидного соединения, подходящего для интраназального введения индивидууму. Это соединение является андростановым стероидом, имеющим формулу

где P₁ выбран из группы, состоящей из оксо, α-(β-)-гидрокси, α-(β-)-ацетокси, α-(β-)-пропионокси, α-(β-)-метокси, α-(β-)-низшего ацилокси, α-(β-)-низшего алкилокси, α-(β-)-бензилокси; P₂ выбран из группы, состоящей из метила, гидроксиметила, ацилоксиметила, алкоксиметила, низшего алкила, гидроксиалкила, ацилоксиалкила и алкоксиалкила; P₃ отсутствует или выбран из группы, состоящей из водорода, метила, гидроксиметила, ацилоксиметила, алкоксиметила, низшего алкила, гидроксиалкила, ацилоксиалкила и алкоксиалкила; P₄ выбран из группы, состоящей из водорода, оксо, галогена, гидрокси, алкокси и ацилокси; P₅ представляет один или два заместителя, при этом P₅ является одним или двумя атомами водорода или метильными группами, метиленом или одним или двумя атомами галогена; P₆ является водородом или галогеном; и "a", "b", "c", "d", "e", "f" и "h" являются альтернативными участками для необязательных двойных связей при условиях, что:
I: если "f" и "h" отсутствуют и P₂ является метилом, то P₅ не может быть двумя атомами водорода;
II: если "h" присутствует, P₃ является метильной группой, P₅ является водородом, то:
(a) P₁ не может быть водородом, если отсутствуют "e" и "a" и присутствует "b"; или
(b) "d" не может присутствовать, если P₁ является оксо, "b" присутствует и "e" отсутствует;
(с) P₄ не может быть водородом, если отсутствует "c" и "d", присутствует "b", P₁ является оксо и P₂ является метилом или гидроксиметилом;
(d) P₄ не может быть оксо, если отсутствуют "e", "c" и "d", "b" присутствует, и P₁ является оксо;
(е) P₄ и P₆ не могут быть водородом, если P₁ является оксо, "e" и "b" присутствуют, а "c" и "d" отсутствуют;
(f) P₄ не может быть водородом, если P₁ является β-гидрокси, "c" присутствует, а "a", "b", "e" и "d" отсутствуют;
(g) P₄ не может быть водородом, если P₁ является метокси, "a" и "c" присутствуют и "e", "a" и "d" отсутствуют;
III: P₄ и P₆ не могут быть водородом, если P₁ является оксо, "b" присутствует, P₆ является метиленом, а "a", "e", "c" и "d" отсутствуют;
IV: P₄ и P₆ не могут быть водородом, если P₁ является β-гидрокси, "c" присутствует, P₅ является метиленом, а "a", "e", "b" и "d" отсутствуют;
V: P₄ и P₆ не могут быть водородом, если P₁ является оксо, "b" и "f" присутствуют, P₅ является метилом, а "e", "а", "c", "d" и "h" отсутствуют.

Один класс предпочтительных стероидов имеет "b" в качестве двойной связи, в особенности, когда "h" также является двойной связью. Еще один предпочтительный класс стероидов имеет P₂ в качестве гидроксиметила и "c" в качестве двойной связи. Другой предпочтительный класс имеет "b" в качестве двойной связи и P₅ в качестве метилена.

Под галогеном подразумевают F, Cl, Br или I. Термин "низший алкил", "низший алкокси" и т.д. означает углеродные цепи, содержащие от 1 до 6 атомов углерода, предпочтительно от 1 до 4 атомов углерода.

Другие цели данного изобретения достигаются путем осуществления способа изменения функции гипоталамуса и/или функции вегетативной нервной системы индивидуума. Лиганд для хеморецептора на поверхности носовой нейроэпителиальной клетки обеспечивают там, где клетка является частью ткани иной, чем обонятельный эпителий; и лиганд вводят в носовой ход индивидуума так, чтобы он специфически связывался с хеморецептором, вызывая таким образом изменение функции гипоталамуса индивидуума.

Все воплощения данной заявки относятся к функциональным эквивалентам и включают функциональные эквиваленты стероидных структур, раскрытых в этих воплощениях (вариантах), и к таким модифицированным стероидам, которые обладают вышеупомянутой функциональной эквивалентностью, при этом модифицированные стероиды так или иначе подробно описаны.

Фиг. 1 иллюстрирует синтез андроста-4,16-диена-3-она, aндpocтa-4,16-диeн-3α-oлa и андроста-4,16-диен-3β-ола.

Фиг. 2 иллюстрирует синтез андроста-5,16-диен-3α-ола и андроста-5,16-диен-3β-ола.

Фиг. 3 иллюстрирует альтернативный синтез андроста-4,16-диена-3α-она.

Фиг. 4 является графическим изображением электрофизиологического воздействия на рецепторный потенциал при локальном введении конкретных стероидов в сошниково-носовой орган женщин (4A) и в обонятельный эпителий (4C). Фиг. 4B представляет графическое сравнение воздействия андростана на рецепторный потенциал VNO мужчин и женщин.

Фиг. 5 является графическим изображением электрофизиологического воздействия локального введения конкретных стероидов в сошниково-носовой орган мужчин (5A) и женщин (5B).

Фиг. 6 иллюстрирует различные автономные реакции женщин на андростан: А = рецепторный потенциал нейроэпителия сошниково-носового органа; В = изменение кортикального альфа-ритма на электроэнцефалограмме (%); С = изменение кожно-гальванической реакции (кОм); D = изменение периферического артериального пульса (количество подсчетов в минуту); E = изменение температуры кожи (^oC); и F = изменение частоты дыхания (количество подсчетов в минуту).

Фиг. 7 иллюстрирует изменения рецепторного потенциала VNO после введения 5 женщинам двух различных андростанов.

Фиг. 8 иллюстрирует сексуальную диморфность в локальных и автономных ответных реакциях на стимуляцию в VNO вомероферинами. Различные вомероферины (200 фмоль) и контрольный разбавитель вводили 30 мужчинам и 30 женщинам (возраст от 20 до 45 лет), как описано. Квадратики обозначают среднюю ответную реакцию по популяции.

Фиг. 8A и В: EVG ответных реакций измеряют, как описано, у мужчин (А) и у женщин (В).

Фиг. 8C и D: электродермальную активность измеряют как описано. Изменения (измеренные в kΩ) в ответной реакции, вызванные введением вомероферинов в VNO каждого субъекта, представлены для мужчин (С) и женщин (D).

Фиг. 8E и F: альфа-кортикальную активность измеряют как описано. Изменения в ответной реакции, вызванные введением вомероферинов в VNO мужчин (Е) и женщин (F).

Фиг. 8G и H: температуру кожи (ST) измеряют как описано. Изменения в ответной реакции, вызванные введением вомероферинов в VNO каждого субъекта, представлены для мужчин (G) и женщин (Н).

Соединения на фигурах:
А = ацетат 1,3,5(10),16-эстратетраен-3-ила,
В = андроста-4,16-диен-3-он,
С = 1,3,5(10),16-эстратетраен-3-ол,
D = 3-метокси-эстра-1,3,5(10),16-тетраен,
E = андроста-4,16-диен-3α-ол,
F = андроста-4,16-диен-3β-ол.

Фиг. 9 иллюстрирует электроольфактограммы мужчин и женщин, индуцированные путем стимуляции OE ольфактантами и вомероферинами А: 400 фмолей ольфактантов 1-карвона и цинеола, а также 200 молей вомероферинов A, B, C, D и F; и стереоизомер E нанесли отдельно в OE 20 субъектов (как мужчин, так и женщин) и зарегистрировали каждую EVG реакцию, как описано. Ольфактанты, а также E и B вызвали значительную (p < 0,01) местную ответную реакцию. В: 400 фмолей ольфактанов 1-карвона и цинеола не вызвали значительную EVG реакцию при подаче в VNO мужчин и женщин.

Фиг. 10 иллюстрирует электрофизиологическое воздействие следующих вомероферинов на сошниково-носовой орган 20 женщин:
G = андрост-4-ен-3-он,
H = андроста-4,16-диен-3,6-дион,
J = 10,17-диметилгон-4,13(17)-диен-3-он,
К = 1,3,5(10),16-эстратетраен-3-ол-метиловый эфир,
L = 1,3,5(10),16-Эстратетраен-3-ил-пропионат,
EVG = электровомероназограмма,
GSR = кожно-гальваническая реакция,
EDA = электрическое сопротивление кожи,
ST = температура кожи.

Фиг. 11 иллюстрирует электрофизиологическое воздействие вомероферинов на сошниково-носовой орган 20 мужчин:
М = 1,3,5(10)-эстратриен-3-ол.

Фиг. 12 иллюстрирует стадии синтеза для примеров 10-14.

Фиг. 13 иллюстрирует стадии синтеза для примеров 15-20.

Фиг. 14 иллюстрирует стадии синтеза для примеров 22-24.

Фиг. 15 иллюстрирует стадии синтеза для примеров 25-26.

Фиг. 16 иллюстрирует стадии синтеза для примеров 27-28.

Фиг. 17A показывает частоту дыхания и данные ЭКГ для мужчин при испытаниях андроста-5,16-диен-3β,19-диола в VNO.

Фиг. 17B показывает частоту дыхания и данные ЭКГ для женщин при испытаниях андроста-5,16-диен-3β,19-диола в VNO.

Фиг. 18A, 18B и 18C показывают данные EVG, GSR и ST в виде диаграмм у женщин для четырех андростанов и андроста-5,16-диен-3β,19-диола.

Фиг. 19A, 19B и 19C показывают данные EVG, GSR и ST в виде диаграмм у мужчин при испытаниях пяти андростанов, идентифицированных на фиг. 18.

Фиг. 20A и 20B показывают данные EEG у мужчин и женщин для андростана A4/N3.

Фиг. 21A и 21B показывают данные EEG у мужчин и женщин для андростана A3/N3.

Фиг. 22A и 22B показывают данные EEG у мужчин и женщин для андростана A13/N1.

Фиг. 23A и 23B показывают данные EEG у мужчин и женщин для андрост-5,16-диен-3β-диола.

Фиг. 24A и 24B показывают данные EEG у мужчин и женщин для андростана A6/N3.

Подробное описание изобретения
I. Определения
"Эмоциональная реакция" является кратковременным чувственным состоянием. Типичными отрицательными эмоциональными реакциями являются чувство нервозности, напряженности, стыда, беспокойства, раздражительности, гнева, ярости и т.п. "Настроения" представляют более продолжительные эмоциональные состояния, такие как: чувство вины, уныние, безнадежность, заниженная самооценка, раскаяние, страдание, подавленность и т.п. "Черты характера" являются более долговременными аспектами индивидуальной личности. Типичными отрицательными чертами характера являются обидчивость, склонность к постоянному раскаянию и самоосуждению, упрямство, раздражительность, ожесточенность, робость, леность и т.п.

"Андростановые стероиды" являются алифатическими полициклическими углеводородами, характеризующимися четырехкольцевой стероидной структурой метилированной в 10- и 13-положениях. Андростен представляет подгруппу андростанов, что означает, что данное соединение имеет по крайней мере одну двойную связь. Обычно, если соединение не является гонаном, то подразумевается, что оно имеет 18-углеродную группу. Однако в данном описании 18-норандростаны рассматриваются андростановые стероиды. Кроме того, все производные, которые имеют описанные выше структурные свойства, также относятся к андростановым стероидам.

"Хеморецептор" представляет молекулу рецептора, присутствующую на поверхности "хемосенсорной" нейроэпителиальной клетки, которая стереоспецифическим образом связывается с конкретным лигандом или лигандами. Это специфическое связывание инициирует трансдукцию сигнала, который стиму лирует афферентный нервный импульс. Хеморецепторы найдены, между прочим, во вкусовых сосочках языка, обонятельном эпителии и сошниково-носовой ткани.

Используемый в настоящем описании термин "эстреновые стероиды" означает алифатические полициклические углеводороды с четырехкольцевой стероидной структурой, по крайней мере одной двойной связью в A-кольце, не метилированные в 10-положении и с оксо-, гидроксилом или гидроксильным производным в 3-положении, таким как алкокси, сложный эфир, бензоат, ципионат, сульфат или глюкуронид. Производные с такими структурными характеристиками также относятся к эстреновым стероидам.

Нижеследующая структура представляет четырехкольцевую стероидную структуру, которую обычно относят к андростану и экстреновым стероидам. При описании местоположения групп и заместителей применяли следующую систему нумерации:

Термин "сексуально диморфный" относится к лекарственному средству, продуцирующему различные действия или различные ответные реакции у мужчин и женщин.

Термин "эффективное количество" лекарственного средства означает интервал количества и/или концентрации, которое(ая) вызывает желательное физиологическое и/или психологическое воздействие при введении лекарственного средства индивидууму, нуждающемуся в таком лечении. В данном случае таким индивидуумом является индивидуум с физиологической или поведенческой особенностью, которая обычно регулируется гипоталамусом, причем если еще в данном случае желательно оказать воздействие на функцию гипоталамуса или черты характера. Эффективное количество данного лекарственного средства может варьироваться в зависимости от той функции, на которую оказывают воздействие, желательного эффекта, способа введения и т.д. Так, например, если стероид вводят в виде раствора, который наносят на кожу лица человека, то эффективная концентрация составляет от 1 мкг/мл до 100 мкг/мл, предпочтительно от 10 до 50 мкг/мл и наиболее предпочтительно от 20 до 30 мкг/мл. Если стероид вводят непосредственно в VNO, то эффективное количество составляет от около 1 пг (пикограмма) до около 1 нг (нанограмма), более предпочтительно от около 10 пг до около 50 пг. Когда стероид вводят в носовой ход в виде мази, крема, аэрозоля и т. п., эффективное количество составляет от 100 пг до около 100 мкг (микрограмм), предпочтительно от около 1 нг до около 10 мкг. Некоторые лекарственные средства могут быть эффективными, когда их вводят определенными способами, но являются неэффективными, когда их вводят другими способами.

"Гипоталамус" является частью промежуточного мозга, включающего вентральную стенку третьего желудочка, расположенного ниже гипоталамической борозды и включающего структуры, образующие дно желудочка, включая зрительный перекрест, серое вещество бугра головного мозга, воронку и сосцевидные тела. Гипоталамус регулирует вегетативную нервную систему и контролирует некоторые физиологические и поведенческие функции, например так называемые ответные реакции на атаку и отступление, половое поведение, водный баланс, сахарный и жировой обмены, голод, осуществляет регуляцию температуры тела, внутреннюю секрецию и другие функции. Гипоталамус является также источником вазопрессина, который регулирует кровяное давление, и окситоцина, который стимулирует роды и выделение молока. Все гипоталамические функции потенциально моделируемы посредством описанной здесь полухимической терапии.

Используемый в настоящем изобретении термин "лиганд" представляет молекулу, которая действует, как химический сигнал посредством специфического связывания с молекулой рецептора, присутствующей на поверхности рецепторной клетки, вследствие чего происходит стимулирование трансдукции сигнала через клеточную поверхность. Связывание лигандов с рецепторами, чувствительными к химикотерапевтическим препаратам, может быть измерено. Ткань, чувствительная к химикотерапевтическим препаратам, например сошниково-носовой нейроэпителий или обонятельный нейроэпителий, содержит множество клеток-нейрорецепторов, каждая из которых имеет по крайней мере один рецептор на своей поверхности. Многие молекулы рецептора имеют одинаковую лигандную специфичность.

Поэтому, когда ткань подвергается воздействию лиганда, который обладает специфичностью (например, при воздействии на VNO полухимических продуктов), может быть измерено суммарное изменение рецепторного потенциала поверхности клетки.

Используемый в настоящем изобретении термин "низший алкил" означает разветвленную или неразветвленную насыщенную углеводородную цепь, содержащую от 1 до 4 атомов углерода, например, такую как метил, этил, н-пропил, изобутил и т.д. В настоящем описании термин "алкокси" используют в его общепринятом смысле, что означает группу -OR, где R является алкилом, который здесь определен.

"Феромон" представляет вещество, которое обеспечивает химические средства коммуникации между членами одинаковых видов через секрецию и носовую рецепцию. Феромоны млекопитающих обнаруживаются обычно посредством рецепторов в сошниково-носовом органе носа. Обычно феромоны действуют на развитие, репродукцию и родственное поведение. "Полухимический продукт" - более общий термин, который включает феромоны и описывает вещество от любого источника, который функционирует как хемосенсорный медиатор; связывается со специфическим нейроэпителиальным рецептором и индуцирует физиологические или поведенческие эффекты.

"Вомероферин" представляет полухимический продукт, физиологическое действие которого опосредуется сошниково-носовым органом.

Пикограмм (пг) равен 0,001 нанограмма (нг), нг равен 0,001 микрограмма (мкг), мкг равен 0,001 мг.

II. Варианты осуществления изобретения
А. Андростаны, используемые в настоящем изобретении
Изобретение направлено на группу определенных андростановых стероидов. Типичным андростаном является тестостерон (17-гидрокси-андроста-4-ен-3-он).

Андростаны, особенно подходящие для использования в настоящем изобретении (см. таблицу в конце описания), включают такие соединения, где независимо: P₁ = оксо, α-гидрокси, β-гидpoкcи; P₂ = метил, низший алкил гидроксиметил, гидроксиалкил; P₃ = водород или метил; P₄ = водород, гидрокси или оксо; P₅ = водород или метил; и обычно в 4- или 16-положении по крайней мере одна двойная связь.

Предпочтительными андростанами являются андроста-4,16-диен-3-он (P₁ = оксо, h = двойная связь, P₂, P₃ = метил, P₄, P₅, P₆ = водород, коммерчески доступный от Steraloids, Inc), андроста-4,16-диен-3β-ол (P₁ = β-ОН, b, h = двойная связь, P₂, P₃ = метил, P₄, P₅, P₆ = водород, и 6-кето-андроста-4,16- диен-3-он (P₁ = оксо; b, h = двойная связь, P₂, P₃ = метил, P₅, P₆ = водород, P₄ = оксо), синтез которых здесь описан.

Очевидно, что данная подгруппа андростанов является новой. Здесь описан синтез нижеследующих соединений, которые на графике (см. таблицу в конце описания) обозначены следующим образом: 17-метилен-андрост-4-ен-3β-ол (A3/N3), 17-метилен-6-оксо-андрост-4-ен-3-он (A6/N3) и 6β-ОН-андроста-4,16-диен-3-он (A11/N1).

Глава первая включает андростаны, на которые направлено изобретение, но которые не ограничивают его область. Диаграммы синтеза иллюстрируют синтез промежуточных и подструктурных соединений, предназначенных для получения таких андростанов.

Новые андростаны.

17-Метиленандрост-4-ен-3α-ол (A4/N3)
17-Метиленандрост-4-ен-3β-ол (A3/N3)
6β-Гидроксиандроста-4,16-диен-3-он (A13/N1)
6β-Гидрокси-17-метил-18 -норандроста-4,13(17) -диен-3-он (A13/N4)
Андроста-5,16-диен-3β,19-диол (19-гидроксипроизводное A2/N1)
17-Метиландрост-4-ен-3,6-дион (A6/N3)
17-Метил-18-норандроста-4, 13(17)-диен-3α-ол (A4/N4)
17-Метил-18-норандроста-4, 13(17)-диен-3β-ол (A3/N4)
17 β-Метиландрост-4-ен-3,6 -дион (17β-метиловое производное A6/N2)
3-Метокси-17-метиленандроста-3,5-диен (A8/N3)
6β-Гидрокси-17-метиленандрост -4-ен-3-он (A13/N3)
17-Метиленандроста-1,4-диен-3-он (A11/N3)
6β-Гидроксиандроста-1,4,16-триен-3-он (6β-гидроксипроизводное A11/N1)
6β-Гидрокси-17-метиландроста -1,4-диен-3-он (6β-гидроксипроизводное A11/N3)
17β-Метиландрост-4-ен-3α-ол (17β-метиловое производное A4/N2)
17β-Метиландрост-4-ен-3β-ол (17β-метиловое производное A3/N2)
3-Метокси-17-метил-18-норандроста-3,5,13(17)триен (A8/N4)
Синтез подструктур
В соответствии с таблицей (см. в конце описания) ниже приводятся примеры синтеза промежуточных соединений в данном ряду (А1 через A11) или колонке (N1 через N4)
Тип А
А1:


А2:


Указанная субструктура является коммерчески доступной, например от DEHYDRO EPI ANDROSTERONE.

Далее примеры синтеза промежуточных соединений см. в конце описания.

Метиландростены.

German Off. 2631915 описывается получение

с метильной группой в одном любом из следующих положений 1α,2α,4,6α,6β,7α и 16

6-метиландроста-4,6-диена-3-он
5 German Off. 2428679.

Синтез 17-метиландростенов


Daniel Bertin and Lucien Nedelac, Memories Presentes a la Societe Chimique, 1964, N 345, p. 2140.

Следовательно, синтезируемые соединения включают эти соединения вместе с теми соединениями, которые получены из них: т.е. N1 с метилом в 1α,2α,4,6α,6β,7α или 17, объединенные с A1, A3, A4, A5, A8, A9, A10 или A11, а также с A2 или A6 с 17-метилом.

Галогенандростены см. в конце описания.

А также

Заявка на Европейский патент EP 208497.

Синтезируемые соединения поэтому включают эти соединения вместе с такими соединениями, из которых они получены, т. е. (4-хлор, 4-бром, 6α-хлор, 6α-бром, 6β-хлор, 6β-бром или 6β-йод)-A1 в сочетании с N1, N2, N3 или N4.

Кроме этого, (17-фтор, 17-хлор, 17-бром или 17-йод)-N1 в сочетании с A1, A2, A3, A4, A5, A6, A8, A9, A10 или A11.

B. Способы синтеза.

1. Получение производных соединений, замещенных в 3-, 5-, 6-, 18- и 19-положении.

Соединения, использованные в способах этого изобретения, представляют андростановые стероиды, замещенные в 3-, 5-, 6-, 18- и 19-положениях. Многие из 3- и 5- замещенных стероидов являются известными соединениями, которые могут быть получены из 17-гидрокси- и 17-оксостероидов (которые являются коммерчески доступными и производятся, например, фирмой Aldrich Chemical Со. ) путем элиминирования или восстановления до Δ16-гомолога. Синтез большинства из этих соединений описан ранее Ohioff (Охлоффом). Как показано на фиг. 1, 17β-гидрокси-5α-андростан-3-он (I) и метилхлорформиат (а) в пиридине дают метилкарбонат, 17β-мeтoкcикapбoнилoкcи-5α-aндpocтaн-3-oн (II), который обеспечивает исходный материал для 5α-андрост- 16-ен-(3-он и 3-олов) (Охлофф, на стр. 200).

Алкоксипроизводные получают из их соответствующих гидроксистероидов путем взаимодействия с алкилирующим агентом, таким как триметилоксонийфторборат, триэтилоксонийфторборат или метилфторсульфонат в инертном хлоруглеродном растворителе, таком как метиленхлорид. Альтернативно, алкилирующие агенты, такие как алкилгалогениды, алкилтозилаты, алкилмезилаты и диалкилсульфат, могут быть использованы с основанием таким, как NaOH, KM или KOBut, оксид серебра или оксид бария в полярных апротонных растворителях, например, ДМФ (N, N-диметилформамиде), DMCO (диметилсульфоксиде) и гексаметилфосфорамиде.

Обычные методики для синтеза стероидов известны специалистам в данной области. Когда должно быть определено время протекания реакции и температуры, их можно определить обычным методом. После добавления необходимых реагентов смесь перемешали в инертной атмосфере и ежечасно брали аликвоты. Аликвоты анализировали с помощью хроматографии, контролируя таким образом исчезновение исходного материала с момента начала реакции. Если исходный материал не расходовался в течение двадцати четырех часов, смесь нагревали до флегмы и ежечасно, как прежде, анализировали аликвоты, до тех пор, пока не исчезал исходный материал. В этом случае смесь перед началом осуществления реакции охлаждали.

Очистку продуктов осуществляли методами хроматографии и/или кристаллизации, известными специалистам в данной области.

2. Получение 19-ОН-производных.

Синтез 19-ОН-андроста-4,16-диен-3-она
Это соединение описано, как промежуточное соединение при синтезе 19-оксо-3-аза-А-гомо-5β-андростана (Habermehl, et al., Naturforsch. (1970) 25b: 191-195). Способ синтеза этого соединения приводится ниже.

С. Лекарственные препараты и способы их применения.

Вариантом настоящего изобретения является способ изменения функции гипоталамуса индивидуума. Другим вариантом является изменение автономной функции индивидуума. Эти автономные функции включают частоту сердечных сокращений, частоту дыхания, особенности электроэнцефалограммы (% кортикального альфа-ритма на электроэнцефалограмме), температуру тела, но при этом не ограничиваются только ими. Другие варианты включают способы ослабления отрицательной эмоциональной реакции, плохого настроения или коррекции отрицательных черт характера индивидуума. Другим вариантом является способ лечения предменструального синдрома. Все указанные варианты осуществляют посредством несистемного введения через нос определенных 16-андростеновых стероидов или комбинаций этих 16-андростеновых стероидов.

Этот способ введения отличается от альтернативных способов, например, таких как пероральное введение или инъекция, несколькими важными особенностями, благодаря которым осуществляют непосредственное контролирование с VNO, которое обеспечивают путем носового введения стероидного лиганда. В способах настоящего изобретения соответствующий лиганд вводят непосредственно в хеморецепторы в носовом ходу и сошниково-носовой орган, не прибегая к пилюлям или иглам, т.е. неинвазивно. Действие лекарственного средства опосредуется связыванием лигандов, описанных в настоящей заявке со специфическими рецепторами, представляемых нейроэпителиальными клетками в носу, предпочтительно в VNO. Кроме того, такой способ действия лекарственного средства осуществляется через нервную систему, а не через систему кровообращения, что позволяет воздействовать на функцию головного мозга без учета гематоэнцефалического барьера. Эти способы лечения дают возможность непосредственно воздействовать на гипоталамус через нервную систему, поскольку существует только одна синаптическая связь между рецепторами феромона и гипоталамусом. Поскольку сенсорные нейроны осуществляют передачу сигнала в конкретный участок головного мозга, то этот способ обеспечивает высокоспецифическое действие лекарственного средства, вследствие чего значительно снижается возможность нежелательных побочных эффектов.

Контактирование с VNO является важным потому, что VNO ассоциируется с хеморецептрно/феромональной функцией. VNO состоит из пары слепых трубчатых дивертикулов, которые находятся в нижнем крае носовой перегородки. VNO содержит нейроэпителий, аксоны которого имеют непосредственный синаптический контакт с миндалевидным телом и от него с гипоталамусом. Наличие VNO документально подтверждено для множества наземных позвоночных животных, включая плод человека; однако, обычно полагают, что у взрослых людей он является рудиментарным органом. (Смотри далее указанную ссылку Johnson et al.)
Лигандные вещества, описанные в настоящей заявке, или их сульфированные, ципионированные, бензоатированные, пропионатированные или глюкуронатированные производные могут быть введены непосредственно, но их предпочтительно вводят в виде лекарственных препаратов. Их получают в жидкой лекарственной форме, например, такой как растворы, суспензии или т.п., предпочтительно в виде стандартных лекарственных форм, подходящих для однократного введения точно определенных доз. Дозы жидких лекарственных средств могут быть введены в виде капель в нос или в виде аэрозоля.

Альтернативно активное соединение может быть получено в виде крема или мази, которые наносят местно в полость носа. В качестве другой альтернативы подачу лекарственного средства можно осуществлять посредством регулируемого высвобождения этих средств путем их включения в желатиновую капсулу целиком или в микроскопических концентрациях с использованием синтетических полимеров, таких как силикон, и природных полимеров, таких как желатин и целлюлоза. Скорость выделения можно регулировать путем надлежащего выбора полимерной системы, используемой для регулирования скорости диффузии (Langer, R.S. и Peppas, N.A., Biomaterials 2, 201, 1981). Природные полимеры, такие как желатин и целлюлоза, медленно растворяются в веществе, примерно от нескольких минут до нескольких часов, тогда как силикон сохраняет свою целостность в течение нескольких месяцев. Такие препараты включают стандартный фармацевтический носитель или наполнитель и одно или несколько активных андростеновых соединений формулы I. Кроме того, эти параметры могут включать другие лекарственные вещества, фармацевтические средства, носители, адъюванты и т. д.

Наиболее подходящим средством доставки полухимического лиганда является ингаляция естественно встречающегося феромона, присутствующего на коже другого человека. Несколько стероидов 16-андростена, включая 5α-андрост-16-ен-3α-ол и 5α-андрост-16-ен-3-он, 4,16-андростадиен-3-он, 5α-андроста-диен-3β-ол и, вероятно, 5α-андростадиен-3α-ол, являются природными соединениями, встречающимися у человека и могут присутствовать на коже. Приблизительно подсчитано, что максимальная концентрация природного стероида человека, 16-андростена, присутствующего на его коже, составляет от 2 до 7 нг/см². Определено, что во время близкого контакта, человек будет подвергаться воздействию не более, чем 700 нг натурального стероида. Так как эти соединения являются относительно нелетучими, то определенно, что во время близкого контакта, человек будет вдыхать не более, чем 0,7 пг натурального стероида, присутствующего на коже другого человека. Из этого вдыхаемого количества только 1% будет достигать рецепторов сошниково-носового органа. Поэтому, по максимальным оценкам, количество феромонов, воздействию которых обычно подвергается человек в натуральных условиях, должно составлять 0,007 пг.

Количество введенного полухимического лиганда будет, конечно, зависеть от индивидуума, подвергаемого лечению, тяжести заболевания, способа введения, частоты введения и от предварительного заключения врача. Однако разовая доза, состоящая из по крайней мере около 10 пг и вводимая непосредственно в полость сошниково-носового органа, является эффективной для обеспечения временной автономной реакции. При введении в носовую полость доза составляет примерно от около 100 пг до около 100 мкг, предпочтительно от около 1 нг до около 10 мкг, более предпочтительно от около 10 нг до около 1 мкг. Частота введения по желанию может находиться в диапазоне от ежечасной дозы до ежемесячной дозы, предпочтительно от 8 раз/день до 3-х раз в день. Мази, содержащие одно или несколько активных соединений и, необязательно, фармацевтические адъюванты в носителе, например, в таком как вода, солевой раствор, водный раствор декстрозы, глицерин, этанол и т.п., могут быть получены с использованием соответствующей основы, например, такой как вазелин, лярд или ланолин.

Ожиженные фармацевтические вводимые препараты могут быть получены, например, путем растворения, диспергирования и т.д. активного соединения, определенного выше, и необязательно фармацевтических адъювантов в носителе, например, таком как вода, солевой раствор, водный раствор декстрозы, глицерин, этанол и т.д., с образованием раствора или суспензии. По желанию вводимый лекарственный препарат может также содержать небольшие количества нетоксичных добавок, таких как смачивающие вещества или эмульгаторы, буферные растворы и т. п., например ацетат натрия, сорбитанмонолаурат, триэтаноламиннатрийацетат, триэтаноламинолеат и т.д. Современные способы приготовления таких лекарственных форм известны специалистам или могут быть найдены, например, в руководстве Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co, Easton, PA, 15^th Ed. 1975. В любом случае, вводимые лекарственные препараты или лекарственные средства будут содержать одно или несколько активных соединений в количестве, эффективном для ослабления симптомов у подвергаемого лечению пациента.

При аэрозольном введении активный ингредиент вводят предпочтительно в тонкодисперсной форме вместе с поверхностно-активным веществом и диспергатором. Типичное процентное содержание активных ингредиентов составляет от 0,001 до 2% по весу, предпочтительно от 0,004 до 0,10%.

Поверхностно-активные вещества должны быть, конечно, нетоксичными и предпочтительно растворимыми в диспергаторах. Характерным примером таких веществ являются сложные эфиры или неполные эфиры жирных кислот, содержащих от 6 до 22 атомов углерода, таких как эфиры капроновой, октановой, лауриновой, пальмитиновой, стеариновой, линолевой, олестеариновой и олеиновой кислот с алифатическим многоатомным спиртом или его циклическим ангидридом, например, таким как этиленгликоль, глицерин, эритрит, арабит, маннит, сорбит и ангидриды гексита, полученные из сорбита (сложные эфиры сорбитана, продаваемые под фабричной маркой "Spans") и полиоксиэтиленовые и полиоксипропиленовые производные этих сложных эфиров. Могут быть использованы объединенные сложные эфиры, например, смешанные или природные глицериды. Предпочтительными поверхностно-активными веществами являются олеаты или сорбитан, например такие, которые продаются под фабричной маркой "Arlacel С" (сесквиолеат сорбитана), "Span 80" (моноолеат сорбитана). Поверхностно-активное вещество может составлять 0,1-20% по массе композиции, предпочтительно 0,25-5%.

Балансом композиции является обычно пропеллент. Ожиженными пропеллентами обычно являются газы в обычных условиях, конденсированные под давлением. Подходящими ожиженными пропеллентами являются низшие алканы, содержащие до пяти атомов углерода, например бутан и пропан; фторированные или фторхлорированные алканы, например такие, которые продаются под фабричной маркой "Freon". Могут быть также использованы смеси вышеуказанных веществ.

При получении аэрозоля емкость, снабженную соответствующим клапаном, наполняют подходящим пропеллентом, содержащим тонкоизмельченный активный ингредиент и поверхностно-активное вещество. Таким образом ингредиенты поддерживают при повышенном давлении до тех пор, пока они не будут высвобождены с помощью клапана.

Еще одним способом введения является местное нанесение летучего жидкого препарата на кожу, предпочтительно на кожу лица индивидуума. Этот препарат будет обычно содержать спирт, например этанол или пропанол. В препарат может быть также включено приятное душистое вещество.

D. Определение состояний, связанных с эмоциональной реакцией, настроением и особенностями характера.

Эмоциональные состояния, связанные с эмоциональной реакцией, настроением и особенностями характера, определяют обычно с использованием вопросника. Так, например, индивидууму может быть дан вопросник, включающий ряд характерных прилагательных для ответов, которые описывают эмоциональное состояние. Индивидуум оценивает свое состояние, описанное посредством этих прилагательных для ответов, и определяет глубину ощущений по эталонной числовой шкале. На основании систематизации родственных прилагательных и статистического анализа оценок субъекта для каждого прилагательного определяют различные эмоциональные состояния.

Альтернативно, эмоциональные состояния могут быть определены посредством вегетативных изменений, например таких, которые применяют при полиграфических оценках (кожно-гальваническая реакция, частота пульса и т.п.) Cabanac, М. Annual Review of Phisiology (1975), 37: 415, Hardy, J.D., "Body temperature Regulation", Chapter 59, pp. 1417. В: Medical Phisiology, Vol. II Ed.; VB Mountcastle (1980); Wolfram Bouscein. Electrodermal Activity (Plenum Press, 1992).

Кроме того, могут быть оценены не относящиеся к речи факторы, такие как выражение лица и поза.

III. Примеры
Нижеследующие примеры приведены с целью иллюстрации, но не ограничения, изобретения. В этих примерах были использованы следующие сокращения: aq (водный), RT = комнатная температура; ПЭ = петролейный эфир (температура кипения (50- 70^oC)); ДМФ = N,N-диметилформамид; DMCO = диметилсульфоксид; ТГФ = тетрагидрофуран.

Пример 1. Андроста-4,16-диен-3-он (4).

Этот синтез проиллюстрирован на фиг. 1. Для превращения тестостерона в андроста-4,16-диен-3-он известно несколько методов. (Brooksbank et al., Biochem. J. (1950) AZ: 36). Альтернативно, в результате термолиза (460^oC) метилкарбоната тестостерона получали андроста-4,16-диен-3-он с выходом 90%. 17β-Метоксикарбонил-андрост-4-ен-3-он (IV) был получен путем взаимодействия тестерона (III) Fluka (Флука) с метилхлорформиатом/пиридином (а), с выходом 76% (после перекристаллизации из MeOH). Температура плавления 140-141^oC, [а] _D = +95,4^o (с= 1,10). ИК (CDCl₃): 1740s, 1665s, 1450s, 1280s. ¹H ЯМР (360 МГц): 0,87 (с, 3H); 1,20 (с, 3H); 3,77 (с, 3H); 4,53 (шир.т, J=8,1 Н); 5,75 (с, 1H). Раствор метилкарбоната IV в толуоле пиролизируют (b), как описано для 1. Перекристаллизация сырого продукта из ацетона при комнатной температуре дает чистый кетон 4 с 90% выходом. Т.пл. 127-129,5^oC, [а]_D = +118,9^o (с=1,32) ([3]: т.пл. 131,5-133,5^o (гексан), [а]_D ¹⁶ = +123±3,5^o (с=1,03)). ИК (CDCl₃): 3050w, 1660s, 1615м. ¹H ЯМР (360 МГц): 0,82 (с, 3H); 1,22 (с, 3H); 5,70 (м, 1H); 5,73 (с, 3H); 5,84 (м, 1H).

Пример 2. Андроста-4,16-диен-3α-ол (5) и 3β-ол (6).

Этот синтез проиллюстрирован на фиг. 1. Андроста-4,16-диен-3-он (4) восстановили при -55^oC с использованием трис(1,2-диметилпропил)гидридобората лития в ТГФ, как описано для получения 2 (фиг. 1). В результате хроматографии на силикагеле с использованием в качестве элюента CH₂Cl₂/этилацетата при соотношении 9:1 получили чистый аксиальный спирт 5 (выход 48%) и чистый экваториальный спирт 6 (выход 48%). Аналитические пробы затем очищали путем перекристаллизации (из ПЭ при -30^oC для получения 5, из циклогексана при комнатной температуре - для получения 6).

Данные для 5. Температура плавления: 77-79^oC, [а]_D = +120,6^o (с=1,26). ИК (CDCl₃): 3620м, 3440м шир., 1660м, 1595w. ¹H ЯМР (360 МГц): 0,79 (с, 3H); 1,02 (с, 3H); 4,07 (м, w_1/2≈10, 1H); 5,48 (д х д, J 5 и 2, 1H); 5,71 (м, 1H); 5,85 (м, 1H).

Данные для 6. Температура плавления: 116-119^oC, [а]_D = +53,9^o (с=1,28) ([47] : т. пл. 116-118^oC [a]_D ⁸ = +59,3^o (c=0,4)). ИК (CDCl₃): 3610м, 3420м шир. , 3050м, 1660м, 1590w. ¹Н ЯМР (360 МГц): 0,78 (с, 3H); 1,08 (с, 3H); 4,15 (м, w_1/2≈20, 1H); 5,30 (м, w_1/2≈5, 1H); 5,71 (м, 1H); 5,85 (м, 1H).

Пример 3. Андроста-5,16-диен-3α-ол (7).

Этот синтез проиллюстрирован на фиг. 2. К раствору спирта 8 (545 мг, 2,0 ммоль) в ацетоне (100 мл) при 0^oC в атмосфере N₂ быстро добавили реактив Джонса (i, 1,5 мл, около 4 ммоль). Через 5 минут смесь влили в разбавленный фосфатный буферный раствор (pH 7,2, 1200 мл) и экстрагировали простым эфиром. Экстракты промыли насыщенным водным раствором NaCl, сушили (NaSO₄) и выпарили, получив при этом, главным образом, андроста-5,16-диен-3-он в виде маслообразного продукта (567 мг). Сырой продукт растворили в ТГФ (7 мл) и восстановили с использованием трис(1,2-диметилпропил)гидридобората лития (с) при 55^oC, как описано для получения 2. Сырой продукт (530 мг) подвергли хроматографии на силикагеле (100 г) с использованием CH₂Cl₂/этилацетата при соотношении 4:1, получив при этом 280 мг (51%) чистого α-спирта (при первом элюировании) и 13 мг исходного спирта 8. Небольшую пробу 7 при комнатной температуре перекристаллизовали из ацетона/воды. Температура плавления: 1380^oC, [a] _D = - 77,5^o (с=1,2). ИК (CDCl₃): 3580м, 3430м, 1665w, 1590w. ¹H ЯМР (360 МГц): 0,80 (с, 3H); 1,06 (с, 3H); 4,02 (м, w_1/2≈8, 1H); 5,44 (м, 1H); 5,72 (м, 1H); 5,86 (м, 1H).

Пример 4. Андроста-5,16-диен-3β-ол (8).

Это соединение получили с выходом 73% с помощью известной методики (Marx, A.F., et al., Ger. Offen. 2, 631, 915; Chem. Abst. 87: 23614p (1977) из коммерческого (Fluka) 3β-гидрокси-андрост-5-ен-17-она (VII). Температура плавления 137^oC, [а]_D= -71,9^o (с=1,5) ([48]: т.пл. 140-141^oC [а]_D= 68^o). ИК (CDCl₃): 3600м, 3420м шир., 1670w, 1590w. ¹H ЯМР (360 МГц): 0,80 (с, 3H); 1,05 (с, 3H); 3,53 (м, w_1/2≈22, 1H); 5,38 (м, 1H); 5,72 (м, 1H); 5,86 (м, 1H). Этот синтез проиллюстрирован на фиг. 4.

Пример 5. Альтернативный синтез андроста-4,16-диен-3-она (25).

Последующий метод синтеза изображен на фиг. 3.

Дегидроэпиандростерон-п-толуолсульфонилгидразон (23)
Дегидроэпиандростерон (VII) (14,4 г, 50 ммоль) и п- толуолсульфонилгидразид (12,75 г, 68,5 ммоль) в сухом метаноле (300 мл) нагревали в колбе с обратным холодильником в течение 20 часов. Эту смесь перенесли в коническую колбу и охладили. Кристаллический продукт подвергли вакуумной фильтрации и промыли метанолом (50 мл). Путем последующего выпаривания фильтрата до 75 мл и 20 мл и осуществления кристаллизации после каждого выпаривания получили дополнительный сбор продукта. Общий выход составил 21,6 г (95%).

Андроста-5,16-диeн-3β-oл (24)
Дегидроэпиандростерон-п-толуолсульфонилгидразон (23) (22,8 г, 50,0 ммоль) в сухом тетрагидрофуране (1,0 л) охладили в бане со смесью сухого льда с изопропанолом. При добавлении н-бутиллития (125 мл, 1,6 М раствора в гексане, 200 ммоль) смесь перемешивали. Смесь нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение 24 часов. При охлаждении льдом добавили воду (50 мл). Смесь влили в насыщенный раствор хлорида аммония/льда (500 мл) и экстрагировали простым эфиром (х 2). Органические слои промывали насыщенным раствором бикарбоната натрия (500 мл) и насыщенным раствором хлорида натрия (500 мл), сушили (MgSO₄) и выпаривали в вакууме, получив при этом сырой продукт. Его очистили флэш-хроматографией на 190 г силикагеля 60, 230-400 меш, при использовании в качестве элюента этилацетата/гексана (при их соотношении 20: 80 - 50:50), при этом получили кристаллический продукт. Продукт перекристаллизовали из метанола (45 мл)/3% пероксида водорода (8 мл), промыли метанолом (30 мл)/водой (8 мл), при этом получили чистый продукт (6,75 г 50%).

Андроста-4,16-диен-3-он (25)
Раствор 10 г андроста-5,16-диен-3β-ола (24) в 475 см³ толуола и 75 см³ циклогексанона подвергли перегонке (собрали около 50 см³ дистиллята) для устранения влаги, добавили 5 г Al(Oprⁱ)₃ в 50 см³ толуола, и раствор в течение 1 часа нагревали в колбе с обратным холодильником. Затем добавили воду и путем перегонки с водяным паром удалили летучие примеси и остаток экстрагировали хлороформом. После выпаривания сухого экстракта и последующей кристаллизации остатка из хлороформа-гексана получили 7,53 г андростата-4,16-диен-3-она (25). Посредством хроматографии маточного раствора на нейтральном оксиде алюминия получили еще 0,97 г соединения (в общем 8,5 г, выход 86%).

Пример 6. Синтез андроста-3,5,16-триен-3-илметилового эфира (12).

К раствору андроста-4,16-диен-3-она (1,00 г, 3,70 ммоль) в 2,2- диметоксипропане (5,0 мл, 41 ммоль) и 5 мл ДМФ добавили метанол (0,2 мл) и моногидрат п-толуолсульфокислоты (26,4 мг, 0,139 ммоль). Смесь в течение 5 часов нагрели в колбе с обратным холодильником, после чего ее охладили и добавили бикарбонат натрия (152,5 мг). Суспензию распределили между 50 мл воды со льдом и 50 мл этилацетата. Органический слой промыли двумя 50 мл порциями воды и 50 мл солевого раствора, сушили над сульфатом магния, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. Маслообразный остаток растворяли в 50 мл горячего гексана и фильтровали через колонку с силикагелем 60, имеющую размеры 12 мм х 30 мм, используя 150 мл горячего гексана. Объединенные фильтраты концентрировали при пониженном давлении и перекристаллизовывали из ацетона/метанола, при этом получали белые кристаллы (468,0 мг, 1,645 ммоль, 44%), температура плавления 83-92^oC.

Пример 7. Синтез 17-метилен-андрост-4-ен-3-олов.

К 20 мл гомоандроста-4,17-диен-3-она (119,0 мг, 0,4184 ммоль) в 5 мл метанола добавили боргидрид натрия (6,0 мг, 0,16 ммоль) и 77 мкл воды. После перемешивания в течение двух часов дополнительно добавили боргидрид натрия (32,0 мг, 0,846 ммоль) и смесь перемешивали в течение всей ночи. После концентрирования при пониженном давлении (5% этилацетат/гексан, на силикагеле) получили более полярный (59,8 мг) и менее полярный (1,7 мг) продукт.

Пример 8. Синтез 17-метилен-6-оксо-андроста-4-ен-3-она.

К охлажденному раствору 20-гомоандроста-5,17-диен-3-ола (399,4 мг, 1,394 ммоль) в 50 мл ацетона добавили 2,67 М реактив Джонса (2,0 мл, 5,3 ммоль). После перемешивания в течение 1 часа реакционную смесь резко охладили изопропанолом (1,0 мл, 13 ммоль) и влили в 100 мл воды. Смесь три раза экстрагировали 50 мл порциями этилацетата и объединенные органические экстракты промыли 50 мл насыщенного раствора бикарбоната натрия и 50 мл солевого раствора. Затем органическую фазу сушили над сульфатом магния, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. Остаток перекристаллизовывали из 95% этанола, при этом получали почти белый порошок (177,8 мг, 0,5958 ммоль, 43%), температура плавления 113-115^oC.

Пример 9. Синтез 6β-он-андроста-4,16-диен-3-она.

К раствору, состоящему из андроста-3,5,16-триен-3- илметилового эфира (12) (200,5 мг, 0,7049 ммоль) в 5 мл 1,2- диметоксиэтана (ДМЭ) и 1 мл воды, при перемешивании в течение 90 минут по каплям добавили м-хлорпербензойную кислоту (МХПБК, 77,4%, 173,2 мг, 0,776 ммоль), суспендированную в смеси, состоящей из 5 мл ДМЭ, 1 мл воды, 0,40 г 5% (мас.) NaOH. После перемешивания в течение 18 часов при последующем перемешивании в течение 1,5 часа по каплям добавили МХПБК (247,0 мг, 1,11 ммоль), суспендированную в смеси, состоящей из 10 мл ДМЭ, 2 мл воды, 0,8 г 5% (мас.) NaOH. Реакционную смесь перемешивали в течение 0,5 часа и затем влили в 25 мл насыщенного раствора бикарбоната натрия. Водную смесь три раза экстрагировали 25 мл простого эфира и объединенные органические экстракты промывали 50 г 5% (мас.) тиосульфата натрия и тремя 50 мл порциями солевого раствора, сушили над сульфатом магния, фильтровали через целит и концентрировали при пониженном давлении. Полученный кристаллический остаток очистили препаративной тонкослойной хроматографией (ТСХ) (35% этилацетат/гексан на силикагеле), после чего дважды перекристаллизовали из водного раствора этанола, при этом получили кристаллы в виде блестящих белых пластинок (102,3 мг, 0,3571 ммоль, 51%), температура плавления: 165-166^oC.

Пример 10. 18-Нор-17-метиландроста-4,13(17)-диен-3-ол, 2 (см. фиг. 12).

К раствору 18-нор-17-метиландроста-4,13(17)-диен-3-она (1, 378,3 мг, 1,399 ммоль) в 7,5 мл безводного эфира добавили 59,7 г (1,57 ммоль) алюмогидрида лития (АГЛ). После перемешивания полученной суспензии в течение 30 минут
добавили 2,00 г глауберовой соли и смесь перемешали в течение еще 30 минут. Затем смесь фильтровали и экстрагировали четырьмя 25 мл порциями простого эфира. Объединенные фильтраты концентрировали при пониженном давлении, а затем подвергали препаративной тонкослойной хроматографии (силикагель GF, 1000 мкм, в качестве элюента использовали 5% этилацетат/метиленхлорид), при этом получили менее полярную фракцию (R_f 0,63, 34,5 мг, 0,127 ммоль, 9%) и более полярную фракцию (R_f 0,45, 273,8 мг, 1,005 ммоль, 72%).

(NA-1994A-209)
Пример 11. 18-Нор-17-метиландроста-3,5,13(17)-триен-3- илметиловый эфир, 3 (см. фиг. 12).

Раствор 18-нор-17-метиландроста-4,13(17)-диен-3-она (1, 0,86 г, 3,2 ммоль) в 2,2-диметилоксипропане (4,3 мл, 35 ммоль) и диметилформамиде (ДМФ, 4,3 мл), содержащий безводный метанол (0,17 мл) и моногидрат п-толуолсульфокислоты (21,3 мг), нагревали в течение 4-х часов в колбе с обратным холодильником и затем охладили. Добавили бикарбонат натрия (0,13 г) и смесь распределяли между 65 мл гексана и 40 мл смеси воды со льдом. Органическую фазу промывали двумя 40 мл порциями воды и 40 мл солевого раствора и затем фильтровали через колонку с силикагелем (200-400 меш), имеющую высоту 17 мм и диаметр 30 мм. После концентрирования объединенных фильтратов и последующей перекристаллизации их ацетона/95% этанола получили ярко-желтые кристаллы (489,6 мг, 1,721 ммоль, 54%), температура плавления: 95-101^oC. ТСХ (10% этилацетат/гексан, на силикагеле) показала наличие основного продукта при R_f 0,69, в котором присутствовали следовые количества примесей.

Пример 12. 18-Нор-17-метиландроста-4,13(17)-диен-6β-3-он, 4 (см. фиг. 12).

Реакцию осуществили способом, аналогичным способу, описанному D.N. Kirk and J. M. Wiles, J. Chem. Soc., Chem. Commun. 1974, 927. К перемешиваемому раствору 18-нор-17- метиландроста-3,5,13(17)-триен-3-илметилового эфира (477,0 мг, 1,677 ммоль) в 1,2-диметоксиэтане (ДМЭ, 26 мл) в течение 88 минут добавили 77% м-хлорпербензойную кислоту (МХПБК, 999,7 мг, 4,48 м-экв), суспендированную в ДМЭ (39 мл), воде (8 мл) и 5% (мас.) гидроксиде натрия (7,1 мл). После перемешивания в течение 20 часов реакционную смесь влили в насыщенный раствор бикарбоната натрия (50 мл) и экстрагировали тремя 50 мл порциями простого эфира. Объединенные органические экстракты промыли 50 г 5% (мас. ) пентагидрата тиосульфата натрия, тремя 50 мл порциями солевого раствора, сушили над сульфатом магния и фильтровали через диатомовую землю. Остаток промывали 25 мл простого эфира и объединенные фильтраты концентрировали при пониженном давлении до получения желтого сиропа. Посредством очистки с помощью препаративной ТСХ (силикагель GF, 1000 мкм, в качестве элюента использовали 35% этилацетат/гексан) получили не совсем белую кристаллическую пленку (132,1 мг, 0,4612 ммоль, 28%), при этом тонкослойная хроматография показала присутствие основного компонента (R_f 0,23), и примесного компонента (R_f 0,18).

(NA-1994A-223)
Пример 13. 17β-Метиландрост-4-ен-3,6-дион, 6 (см. фиг. 12).

К раствору 17β-метиландрост-5-ен-3β-ола (5, 135,5 мг, 0,4697 ммоль) (J. B. Jones и К. D. Gordon, Can. J. Chem. 1972, 50, 2712-2718) в ацетоне (15 мл) добавили реактив Джонса (2,67 М, 0,88 мл, 2,3 ммоль) и в течение 45 минут смесь перемешивали. Реакцию гасили добавлением 2-пропанола (0,44 мл). После перемешивания в течение еще 10 минут реакционную смесь вливали в 30 мл воды и экстрагировали тремя 15 мл порциями этилацетата. Объединенные органические экстракты промывали 15 мл насыщенного бикарбоната натрия 15 мл солевого раствора, сушили над сульфатом магния и фильтровали через диатомовую землю. Остаток промывали 10 мл этилацетата и объединенные фильтраты концентрировали при пониженном давлении. С помощью препаративной ТСХ (силикагель GF, 1000 мкм, в качестве элюента использовали 35% этилацетат/гексан) и перекристаллизации из водного раствора этанола получили блестящие, беловатые кристаллы (37,5 мг, 0,125 ммоль, 27%), температура плавления: 94-95^oC, гомогенные в соответствии с ТСХ (25% этилацетат/гексан, на силикагеле, R_f 0,39).

(NA-1994A-298)
Пример 14. 17β-Метиландрост-4-ен-3-ол, 8 (см. фиг. 12).

К раствору 17β-метиландрост-4-ен-3-она (7, 143,2 мг, 0,4999 ммоль) (J.B. Jones и K.D. Gordon, Can. J. Chem. 1972, 50, 2712-2718) в 2,8 мл безводного эфира добавили алюмогидрид лития (21,3 мг, 0,561 ммоль). После перемешивания суспензии в течение 30 минут добавили глауберову соль (0,76 г), и смесь перемешивали в течение еще 0,5 часа. Добавили простой эфир (10 мл) и суспензию фильтровали через диатомовую землю. Остаток промывали тремя 10 мл порциями простого эфира и объединенные фильтраты концентрировали при пониженном давлении. С помощью препаративной ТСХ (силикагель GF, 1000 мкм, в качестве элюента использовали 5% этилацетат/метиленхлорид) сырой продукт разделили на более полярный компонент (R_f 0,30, 77,9 мг, 0,270 ммоль, 54%) и менее полярный компонент (R_f 0,43, 10,3 мг, 0,0357 ммоль, 7%).

(NA-1994A-300)
Пример 15. 17-Метиленандроста-3,5-диен-3-илметиловый эфир, 10 (см. фиг. 13).

К 17-метиландрост-4-ен-3-ону (9, 2000 г, 7,0314 ммоль) в 2,2-диметоксипропане (9,4 мл, 76 ммоль) и ДМФ (9,4 мл) добавили 0,37 мл безводного метанола и 47,0 мг п-толуолсульфокислоты. После нагревания в колбе с обратным холодильником в течение 4-х часов реакционную смесь охладили и затем распределили между 140 мл гексана и 90 мл воды. Органическую фазу промыли двумя 90 мл порциями воды и 90 мл солевого раствора, сушили над сульфатом магния и фильтровали через колонку с силикагелем (200-400 меш), имеющую диаметр 30 мм и высоту 37 мм. Затем элюирование продолжили с использованием 200 мл гексана. После концентрирования объединенных фильтратов при пониженном давлении и перекристаллизации остатка из ацетона/метанола получили бледно-желтые пластинки (1,5291 г, 5,1231 ммоль, 73%), температура плавления 97-99^oC, гомогенные в соответствии с ТСХ (25% этилацетат/гексан, на силикагеле, R_f 0,72).

(NA-1994A-226)
Пример 16. 17-Метиландрост-4-ен-6β-ол-3-он, 11 (см. фиг. 13).

К перемешанному раствору 17-метиландроста-3,5-диен-3- илметилового эфира (10, 500,1 мг, 1,676 ммоль) в ДМЭ (10 мл) в течение 15 минут добавили МХПБК (318,6 мг, 1,846 ммоль) в ДМЭ (10 мл) и воду (4 мл). После перемешивания в течение 30 минут смесь влили в 50 мл насыщенного бикарбоната натрия и экстрагировали тремя 50 мл порциями простого эфира. Объединенные органические экстракты промывали 50 мг (мас.) пентагидрата тиосульфата натрия и тремя 50 мл порциями солевого раствора, сушили над сульфатом магния и фильтровали через диатомовую землю. Остаток промывали 25 мл простого эфира и объединенные фильтраты концентрировали при пониженном давлении. С помощью флэш-хроматографии (45% этилацетат/гексан, на силикагеле) и последующей перекристаллизации из водного раствора этанола получили бледно-желтые кристаллы (187,1 мг, 0,6228 ммоль, 37%), температура плавления 192-194^oC, ТСХ (35% этилацетат/гексан, на силикагеле) показали наличие основного (R_f 0,17) и примесного (R_f 0,13) компонентов.

(NA-1994A-232)
Пример 17. 17-Метиландрост-1,4-диен-3-он, 12 (см. фиг. 13).

Раствор 17-метиландрост-4-ен-3-она (9, 1,0001 г, 3,5160 ммоль) и 2,3-дихлор-5,6-дициано-1,4-бензохинона (ДДХ, 2,43 г, 10,7 ммоль) в диоксане (60 мл, свежедистиллированный после нагревания в колбе с обратным холодильником в течение ночи, в присутствии натрия) нагревали в колбе с обратным холодильником в течение 6 часов и затем охладили при вихревом размешивании в водопроводной воде. Добавили метил-трет-бутиловый эфир (МТБЭ, 50 мл) и суспензию фильтровали через диатомовую землю. Остаток промыли двумя 50 мл порциями МТБЭ и объединенные фильтраты концентрировали при пониженном давлении. После флэш-хроматографии остатка (20% этилацетат/гексан, на силикагеле) и последующей перекристаллизации из 95% этанола получили беловатые кристаллы (498,9 мг, 1,767 ммоль, 50%), температура плавления: 155-157^oC.

Пример 18. 17-Метиландроста-1,3,5-триен-3-ил-бензоат, 13 (см. фиг. 13).

Реакцию осуществляли адаптированным способом, описанным R.W. Draper et al. , Arzneim.-Forsh, 1982, 32, 317-322, следующим образом: в масляной бане (68-73^oC) в атмосфере аргона в течение 18 часов перемешали 17-метиленандроста-1,4-диен-3-он (12, 389,0 мг, 1,378 ммоль), безводный пиридин (4,7 мл, 58 ммоль) и бензоилхлорид (1,2 мл, 10 ммоль). После охлаждения льдом реакционную смесь влили в 40 мл смеси, состоящей из льда и 1 н. HCl, и экстрагировали тремя 20 мл порциями метиленхлорида. Объединенные органические экстракты промыли 40 мл холодной 1 н. HCl, 40 мл насыщенного бикарбоната натрия и 40 мл солевого раствора, сушили над сульфатом магния и фильтровали через диатомовую землю. Остаток промыли 10 мл метиленхлорида и объединенные фильтраты концентрировали при пониженном давлении. После флэш-хроматографии остатка (4% этилацетат/гексан, на силикагеле) получили желтое твердое вещество (0,43 г, 1,1 ммоль, 81%).

(NA-1994A-284)
Пример 19. 17-Метиландроста-1,4-диен-6β-ол-3-он, 14 (см. фиг. 13).

Реакцию осуществляли адаптированным способом, описанным R.W. Draper et al. , Arzneim. -Forsh, 1982, 32, 317-322, следующим образом: к 17-метиландроста-1,3,5-триен-3-ил-бензоата (13, 0,43 г, 1,1 ммоль) в 6,6 мл в ДМЭ в течение 20 минут при перемешивании добавили МХПБК (211,4 мг, 1,225 ммоль) в ДМЭ (6,6 мл) и воду (2,7 мл). Перемешивание продолжалось в течение 30 минут и затем реакционную смесь влили в 35 мл насыщенного бикарбоната натрия. Смесь экстрагировали тремя 35 мл порциями этилацетата. Объединенные органические экстракты промыли 35 г 5% пентагидрата тиосульфата натрия, тремя 35 мл порциями солевого раствора, сушили над сульфатом магния и фильтровали через диатомовую землю. Остаток промыли 10 мл этилацетата и объединенные фильтраты концентрировали при пониженном давлении. После осуществления препаративной ТСХ (силикагель GF, 1000 мкм, 50% этилацетат/гексан в качестве элюента) получили желтое кристаллическое твердое вещество (83,7 мг, 0,280 ммоль, 25%) гомогенное в соответствии с ТСХ (50% этилацетат/гексан, на силикагеле, R_f = 0,50).

(NA-1994A-292)
Пример 20. Андроста-1,4,16-триен-6β-ол-3-он, 16 (см. фиг. 13).

В масляную баню (70-73^oC) в атмосфере аргона поместили андроста-1,4,16-триен-3-он (15, 500,0 мг, 1,863 ммоль), безводный пиридин (6,4 мл, 79 ммоль) и бензоилхлорид (1,6 мл, 14 ммоль) и перемешали в течение 18 часов. После охлаждения льдом смесь влили в 50 мл смеси, состоящей из льда и 1 н. HCl и экстрагировали тремя 25 мл порциями метиленхлорида. Объединенные органические экстракты промыли 50 мл холодной 1 н. HCl, 50 мл насыщенного бикарбоната натрия и 50 мл солевого раствора, сушили над сульфатом магния и фильтровали через диатомовую землю. Остаток промыли 10 мл метиленхлорида и объединенные фильтраты концентрировали при пониженном давлении. После осуществления флэш-хроматографии остатка (2% этилацетат/гексан, на силикагеле) получили желтые кристаллы (0,47 г, 1,3 ммоль, 68%) промежуточного бензоата. Эти кристаллы растворяли в хлороформе (30 мл) с МХПБК (240,0 мг, 1,391 ммоль). После перемешивания в течение 1 часа добавили дополнительное количество МХПБК (239,5 мг, 1,388 ммоль) и реакционную смесь перемешивали в течение еще одного часа. Затем смесь промывали 30 г 5% (мас.) пентагидрата, тиосульфата натрия, 30 мл насыщенного бикарбоната натрия, 30 мл солевого раствора, сушили над сульфатом магния и фильтровали через диатомовую землю. Остаток промыли 10 мл хлороформа и объединенные фильтраты концентрировали при пониженном давлении. После осуществления флэш- хроматографии (40-45% этилацетат/гексан, силикагель) получили желтую смолу (106,1 мг, 0,3731 ммоль, 29%), при этом тонкослойная хроматография (40% этилацетат/гексан, на силикагеле) показала наличие основного компонента (R_f 0,34) и примесного (R_f 0,40) компонента.

(NA-1994A-276)
Пример 21. Андроста-4,16-диен-6β-ол-3-он, 16.

К раствору андроста-3,5,16-триен-3-илметилового эфира 12 (200,5 мг, 0,7049 ммоль) в 5 мл 1,2-диметоксиэтана (ДМЭ) и 1 мл воды по каплям, при перемешивании, в течение 90 минут добавили м-хлорпербензойную кислоту (МХПБК) (77,4%, 173,2 мг, 0,776 ммоль), суспендированную в смеси, состоящей из 5 мл ДМЭ, 1 мл воды, 0,40 г 5% (мас.) NaOH. После перемешивания в течение 18 часов по каплям при перемешивании в течение 1,5 часа добавили еще МХПБК (247,0 мг, 1,11 ммоль), суспендированную в смеси, состоящей из 10 мл ДМЭ, 2 мл воды, 0,8 г 5% (мас.) NaOH. Реакционную смесь перемешивали в течение 0,5 часа и затем влили в 25 мл насыщенного бикарбоната натрия. Водную смесь три раза экстрагировали 25 мл простого эфира и объединенные органические экстракты промыли 50 г 5% (мас.) тиосульфата натрия, тремя 50 мл порциями солевого раствора, сушили над сульфатом магния, фильтровали через целит и концентрировали при пониженном давлении. Полученный кристаллический остаток очистили с помощью препаративной ТСХ (35% этилацетат/гексан, на силикагеле), после которой осуществили 2-кратную перекристаллизацию из водного раствора этанола до получения блестящих белых пластинок (102,3 мг, 0,3571 ммоль, 51%), температура плавления: 165-166^oC.

Пример 22. 20-Гомоандроста-4,17-диен-3-он, 13 (см. фиг. 14).

К раствору 20-гомоандроста-5,17-диен-3-ола (1,0001 г, 3,4911 ммоль) в 100 мл толуола и 20 мл (0,19 ммоль) циклогексанона добавили изопропоксид алюминия (2,00 г, 9,79 ммоль) в 20 мл подогретого толуола. После нагревания в колбе с обратным холодильником в течение 4-х часов охлажденную реакционную смесь встряхивали в течение 1 минуты с 5 мл воды и 12,5 мл 3,6 н. серной кислоты. Органический слой промыли 50 мл солевого раствора, сушили над сульфатом магния, фильтровали через целит и концентрировали при пониженном давлении. После осуществления перегонки с водяным паром, осуществленной для удаления циклогексанона, нелетучий остаток растворяли в двух 10 мл аликвотах дихлорметана, сушили над сульфатом магния, фильтровали и концентрировали. Маслянистый остаток очищали с помощью флэш-хроматографии (15% этилацетат/гексан, на силикагеле) и перекристаллизации из водного раствора ацетона, в результате чего получили бесцветные игольчатые кристаллы (238,8 мг, 0,8400 ммоль, 24%), температура плавления: 130-134^oC [lit. (B.S. Macdonald et al., Steroids, 1971, 18, 753-766) температура плавления 129-131^oC].

(NA-1993A-99, 103B)
Пример 23. 20-Гомоандроста-4,17-диен-3-олы, 14 (см. фиг. 14).

К 20-гомоандроста-4,17-диен-3-ону (119,0 мг, 0,418 ммоль) в 5 мл метанола добавили боргидрид натрия (6,0 мг, 0,16 ммоль) и 77 мкл воды. После перемешивания в течение двух часов дополнительно добавили боргидрид натрия (32,0 мг, 0,846 ммоль) и смесь перемешивали в течение всей ночи. После концентрирования при пониженном давлении остаток очищали с помощью препаративной ТСХ (5% этилацетат/гексан, на силикагеле) при этом получили более полярный (59,8 мг) и менее полярный (1,7 мг) продукт.

(NA-1993A-99, 110 А, В)
Пример 24. 20-Гомоандроста-4,17-диен-3,6-дион, 15 (см. фиг. 14).

К охлажденному раствору 20-гомоандроста-5,17-диен-3-ола (399,4 мг, 1,394 ммоль) в 50 мл ацетона добавили 2,67 М реактива Джонса (2,0 мл, 5,3 ммоль). После перемешивания в течение 1 часа реакционную смесь резко охладили изопропанолом (1,0 мл, 13 ммоль) и влили в 100 мл воды. Смесь три раза экстрагировали 50 мл порциями этилацетата и объединенные органические экстракты промыли 50 мл насыщенного бикарбоната натрия и 50 мл солевого раствора. Затем органическую фазу сушили над сульфатом магния, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. Остаток перекристаллизовывали из 95% этанола, при этом получили почти белый порошок (177,8 мг, 0,5958 ммоль, 43%) температура плавления: 113-115^oC.

(NA-1993A- 91B)
Пример 25. 6β,19-Эпокси-17-йодандроста-4,16-диен-3- этиленкеталь, 18 (см. фиг. 15).

Смесь, состоящую из сырого 6β,19-эпокси-17-йодандрост- 16-ена (17, 1,38 г, 3,09 ммоль) (G. Habermehl and A. Haaf, Z. Naturforsch, 1970, 25b, 191-195), этиленгликоля (0,97 г, 16 ммоль), толуолы (50 мл) и моногидрата п-толуолсульфокислоты (20,3 мг, 0,107 ммоль), в течение 19 часов нагревали в колбе с обратным холодильником для азеотропного удаления воды (Deen-Stark). После охлаждения добавили этилацетат (100 мл) и реакционную смесь промыли 100 мл насыщенного бикарбоната натрия и 100 мл солевого раствора. Органическую фазу сушили над сульфатом магния и фильтровали через диатомовую землю. Остаток промыли 25 мл этилацетата и объединенные фильтраты концентрировали при пониженном давлении, при этом получили рыжевато-коричневое кристаллическое твердое вещество (1,47 г). Этот остаток суспендировали в безводном метаноле (40 мл), добавили ацетат калия (2,44 г, 24,9 ммоль) и отогнали примерно 26 мл метанола. Остаток концентрировали при пониженном давлении, добавили воду (50 мл) и смесь три раза экстрагировали 25 мл аликвотами метиленхлорида. Высушенные (натрийсульфатные) экстракты фильтровали через диатомовую землю и остаток промыли 10 мл метиленхлорида. После концентрирования объединенных фильтратов при пониженном давлении получили желтое твердое вещество, которое затем очистили флэш-хроматографией (5-7,5-10% этилацетат/метиленхлорид, на силикагеле) и в результате перекристаллизации из метанола получили светло-желтые игольчатые кристаллы (914,6 мг, 2,013 ммоль, 65%), температура плавления: 187-189^oC. ¹H-ЯМР: 6,13 δ, 1H, дд, 16-H; 5,82 δ, 1H, с, 4-H; 4,71 δ, 1H, д, 6α-H; 4,22 δ и 3,53 δ, 2H, AB, 19-H' с; 4,10-3,28 δ, 4M, mult., 3-кеталь H'c; 0,83 δ, 3H, с, 18-Ме.

(NA-1994A-141C)
Пример 26. Андроста-4,16-диен-19-ол-3-он, 19 (см. фиг. 15).

Безводный аммиак (примерно 75 мл) перегнали через КОH колонку в осушенную пламенем трехгорлую 250-миллилитровую колбу, снабженную впускным отверстием, магнитной мешалкой, конденсатором, охлаждаемым сухим льдом/ацетоном, и пробкой. Добавили раствор 6β,19-эпокси-17-йодандроста-4,16-диен-3- этиленкеталя (18, 880,4 мг, 1,938 ммоль) в безводном тетрагидрофуране (ТГФ, 45 мл), и затем - металлический натрий (0,20 г, 8,7 мг-атомов), разрезанный на мелкие кусочки. После перемешивания под давлением аргона в течение 30 минут реакционную смесь резко охладили добавлением абсолютного этанола (1,0 мл). Аммиак выпаривали в течение ночи, затем добавили 50 мл воды и смесь экстрагировали тремя 5 мл порциями метиленхлорида. Объединенные органические экстракты промыли 50 мл солевого раствора, сушили над сульфатом магния и фильтровали через диатомовую землю. После промывки остатка 10 мл метиленхлорида объединенные фильтраты концентрировали при пониженном давлении. Промежуточный продукт кеталь был нереакционноспособным, но в конечном счете он был гидролизован путем нагревания в течение 18 часов в колбе с обратным холодильником в присутствии 5 мл хлороформа и 2,5 мл 4 н. соляной кислоты. К охлажденной полученной после гидролиза смеси добавили этилацетат (50 мл) и слои разделили. Органическую фазу промыли 25 мл насыщенного бикарбоната натрия, 25 мл солевого раствора, сушили над сульфатом магния и фильтровали через диатомовую землю. Остаток промыли 10 мл этилацетата и объединенные фильтраты концентрировали при пониженном давлении. Полученную коричневую пену очищали с помощью флэш-хроматографии (50% этилацетат/гексан, на силикагеле), а затем препаративной ТСХ (50% этилацетат/гексан, на силикагеле GF, толщиной 1000 мкм), при этом получили частично кристаллическую пленку (66,7 мг, 0,233 ммоль, 12%). ¹H-ЯМР: 5,92 δ, 1H, с, 4-H; 5,87-5,64 δ, 2H, mult., 16,17-H'с; 4,10 δ и 3,94 δ, 2H, AB, 19-H'с; 0,79 δ, 3H, с, 18-Ме.

(NA-1994A-244D)
Пример 27. Андрост-5-ен-3β,19-диол-17-(п-толуолсульфонил)- гидразон, 2 (см. фиг. 16).

В колбе с обратным холодильником в течение 24 часов нагревали суспензию, состоящую из андрост-5-ен-3β,19-диол-17-она (1, коммерчески доступное соединение, поставляемое фирмой Research Plus, 512,5 мг, 1,684 ммоль) и п-толуолсульфонилгидразида (п-TsNHNH₂, 392,1 мг, 2,105 ммоль) в 2-пропаноле (6,0 мл). К охлажденной реакционной смеси добавили 20 мл простого эфира и при пониженном давлении удалили растворитель. Остаток растворяли в 10 мл простого эфира и раствор фильтровали через диатомовую землю. К фильтрату добавили 10 мл гексана и суспензию концентрировали при пониженном давлении. Остаток растворяли в 10 мл горячего бензола и охлажденную суспензию подвергали фильтрации. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении и затем подвергали флэш-хроматографии (40% этилацетат/гексан, на силикагеле), при этом получили темную смолу (0,69 г, 1,5 ммоль, 87%).

(NA-1993B-47)
Пример 28. Андроста-5,16-диен-3β,19-диол, 3 (см. фиг. 16).

В бане, содержащей смесь льда с ацетоном, и в атмосфере аргона охладили раствор андрост-5-ен-3β,19-диол-17-(п- толуолсульфонил)гидразона (2, 0,69 г, 1,5 ммоль) в безводном тетрагидрофуране (ТГФ, 35 мл), и по каплям при перемешивании в течение 1 минуты добавили н-бутиллитий (2,5 М в гексане, 3,7 мл, 9,3 ммоль). Реакционную смесь перемешивали 4 дня, в течение которых смесь постепенно нагрелась до комнатной температуры. Затем реакционную смесь влили в 50 мл насыщенного хлорида аммония со льдом и слои разделили. Водный слой дважды экстрагировали 25 мл порциями этилацетата. Объединенные органические фазы промыли 25 мл насыщенного бикарбоната натрия, 25 мл солевого раствора, сушили над сульфатом магния и фильтровали через диатомовую землю. Остаток промыли 10 мл этилацетата и объединенные фильтраты концентрировали при пониженном давлении. Остаточную желтую смолу подвергли флэш-хроматографии (50-55-60% этилацетат/гексан, на силикагеле) кристаллизовали из метил-трет-бутилового эфира/бензола, при этом получили рыхлые белые кристаллы (92,5 мг, 0,361 ммоль, 24%), температура плавления 169-171^oC.

(NA-1993B-66)
Пример 29. Электрофизиология при стимуляции андростаном VNO и обонятельного эпителия человека.

При регистрации локальных электрических потенциалов от сошниково-носового органа (VNO) человека и от обонятельного эпителия (OE) был использован неинвазивный метод. Локализованную газовую стимуляцию применили к обоим носовым структурам с использованием специально сконструированных катетер/электродов, соединенных с многоканальной системой доставки лекарства к месту действия. Этот электрод и система доставки описаны Monti и Grosser (J. Steroid Biochem. and Molec. Biol. (1991) 39: 573) и в находящейся на рассмотрении национальной заявке США 07/771414, которая вводится в настоящее описание посредством ссылки. Местная ответная реакция VNO и OE коррелировала с концентрацией лигандного раздражителя.

Исследование проводили с участием клинически здоровых (обследованных) десяти добровольцев - 2 мужчин и 8 женщин, в возрасте от 18 до 85 лет. Исследования проводили без общей или местной анестезии.

Катетер/электроды были предназначены для доставки локализованного раздражителя и одновременной регистрации ответной реакции. В случае регистрации VNO исследовали правую носовую ямку индивидуума с использованием носового зеркала (носовых расширителей) и определяли местоположение сошниково-носового отверстия, которое находилось возле места пересечения переднего края сошника и основания носа. Катетер/электрод осторожно направляли в отверстие VNO и кончик электрода помещали в полости органа на расстоянии от 1 до 3 мм от отверстия. Затем носовое зеркало удаляли. В случае OE процедура регистрации была аналогичной, за исключением положения катетера/электрода, который осторожно глубоко помещали в латеральную часть медиального слезно-носового потока, достигая обонятельной слизистой оболочки.

Через катетер/электрод осуществляли локализованную газовую стимуляцию. Через канал стимулирующей системы при комнатной температуре непрерывно пропускали поток чистого увлажненного воздуха, не имеющего запаха. Стимулирующие лигандные вещества разбавили пропиленгликолем, смешали с увлажненным воздухом и в течение от 1 до 2 секунд продували через катетер/электрод. Было установлено, что такое введение обеспечивает присутствие около 25 пг стероидного лиганда в носовой полости.

Результаты этого исследования представлены на фиг. 4A, 4B и 4C. Ответную реакцию измеряли в милливольтах-секундах (мВ х с). Андроста-4,16-диен-3-он вызывает значительно более сильную реакцию VNO у женщин, чем другие испытуемые соединения (фиг. 4A). Кроме того, ответная реакция VNO на андроста-4,16-диен-3-он является сексуально диморфной, т.е. она в два раза сильнее у женщин, чем у мужчин, (фиг. 4B). В противоположность этому реакция OE как у мужчин, так женщин является незначительной по сравнению с реакцией на сильно пахучее вещество, такое как гвоздика (фиг. 4C).

Пример 30. Измерение изменений рецепторного потенциала нейроэпителия VNO в ответ на различные стероиды.

Изменение рецепторного потенциала в ответ на пять различных лигандов измерили у 40 женщин (фиг. 5A) и 40 мужчин (фиг. 5B). Каждому человеку ввели 60 пг каждого из семи веществ, указанных на чертежах. Вещества вводили отдельно в течение 1 секунды с использованием методики, описанной в примере 10. Изменение потенциала нейроэпителия VNO зарегистрировали в зависимости от времени и интеграл изменения потенциала усреднили для каждого из 40 субъектов. Результаты показаны на фиг. 5. Сравнение фиг. 5A и 5B показало, что каждый стероид является сексуально диморфным по своей активности и что некоторые лигандные вещества являются более сильными для мужчин, в то время как другие являются более сильными для женщин.

Пример 31. Измерение автономных реакций на стимулирование VNO 16-андростеном.

Женщинам с использованием методики, описанной в примере 10, вводили андроста-4,16-диен-3-он и регистрировали различные параметры автономных реакций. В качестве контрольного вещества вводили также пропиленгликоль. Лиганд вводили в виде односекундного импульса. Изменение автономной функции отмечалось уже через 2 секунды и продолжалось в течение времени до 45 секунд. Как показано на фиг. 6, по сравнению с контрольным веществом пропиленгликолем андростан вызывал значительные изменения рецепторного потенциала в VNO (фиг. 6A), кожно-гальванической реакции (фиг. 6B), температуры кожи (фиг. 6C), % альфа-ритма коры головного мозга, измеренного на электроэнцефалограмме (фиг. 6D), периферического артериального пульса (фиг. 6E) и частоты дыхания (фиг. 6F).

Пример 32. Сравнение изменений рецепторного потенциала, индуцированных двумя андростановыми стероидами.

60 пг каждого лиганда и контрольного пропиленгликоля ввели 5 женщинам, как описано в примере 10.

Как показано на фиг. 7, андроста-4,16-диен-3β-ол вызывал большие изменения рецепторного потенциала, чем андроста-4,16-диен-3-он.

Пример 33. Психофизиологическое воздействие стимуляции VNO андростаном.

Психофизиологический эффект от стимуляции VNO андростаном измерили путем координированного введения феромона и оценки своего состояния субъектом с помощью вопросника перед и после введения лекарственных средств. Вопросник включал набор прилагательных для ответа, используемых как часть, входящую в стандартный вопросник Derogatis Sexual Inventory.

В исследовании участвовали 40 женщин, обладающих хорошим здоровьем в возрасте от 20 до 45 лет. Женщин произвольно распределили на группы: 20 женщин получали плацебо и 20 женщин получали примерно 20 пикограмм андроста-4,16-диен-3-она, вводимого, как описано выше в примере 10. Женщинам предлагали вопросник, состоящий из 70 пунктов, с помощью которого оценивали эмоциональные состояния непосредственно до введения и через 30 минут после введения плацебо или испытуемого вещества. Предлагаемый вопросник включал в себя 70 характерных прилагательных, которые впоследствии служили для оценки, основанной на их уместности по отношению к каждому настроению, ощущению или особенностям характера. При этом были получены результаты: изменения в таких ощущениях, как социальная адаптация, личное благополучие, активность/возбудимость и агрессивность до введения и через 30 минут после введения лекарственного средства, были незначительными у тех, кто подвергался воздействию 16-андростена, по сравнению с теми изменениями, которые наблюдались после введения контроля. Однако в высокой степени значительное снижение отрицательных эмоциональных реакций (нервный, напряженный, стыдливый, беспокойный, возбудимый, раздраженный, гневный, как было по T-критерию Стьюдента: p<0,0001 и дисперсионному анализу: p<0,04), уменьшение плохого настроения и коррекция отрицательных черт характера (чувствительный, опечаленный, заслуживающий порицания, виновный, полный раскаяния, грустный, безнадежный, обиженный, никчемный, жалкий, невезучий, горький, робкий, как было установлено по T-критерию Стьюдента: p<0,0004 и дисперсионному анализу: p<0,06), а также снижение общего негативизма (сочетание эмоциональной реакции и характера, как было установлено по T-критерию Стьюдента: p<0,0003 и дисперсионному анализу: p<0,05) наблюдалось после введения 16-андростена по сравнению с введением контроля.

В общем эти результаты позволяют предположить, что андроста-4,16-диен-3-он при его интраназальном введении оказывает седативное и/или снимающее чувство тревоги и/или антидепрессивное воздействие.

Пример 34. Лечение предменструального синдрома у женщин.

Женщины, страдающие предментсруальным синдромом (ПМС), получали лекарственный препарат, содержащий андростановый стероид (предпочтительно андроста-4,16-диен-3-он или андроста-4,16-диен-3α(β)-ол), подходящий для интраназального введения. Этот стероид наносили в виде мази при концентрации от около 1 мкг/мл до около 0,1 мл. Мазь наносили внутрь каждой ноздри три раза в день. В подобном способе лечения ПМС используют аэрозольный препарат этого же средства. Аэрозоль впрыскивают в каждую ноздрю три раза в день.

Пример 35. Электрофизиологические исследования.

Последующие электрофизиологические исследования осуществляли с участием 60 клинически здоровых добровольцев обоих полов (30 мужчин и 30 женщин), в возрасте от 20 до 45 лет. Анестезирующие средства не использовали и беременных женщин исключили.

Система стимуляции и регистрации состояла из "многофункционального минидатчика" (описанного в Monti-Bloch, L. and Grosser, B.I. (1991) "Effect of putative pheromones on the electrical activity of the human vomernasal organ and olfactory epithelium", J. Steroid Biochem. Molec. Biol. 19: 573-582).

Регистрирующий электрод представлял 0,3 мм серебряный шарик, прикрепленный к небольшой (0,1 мм) серебряной проволоке, изолированной Тефлоном^®. Поверхность электрода обработали сначала с целью получения внутренней поверхности из хлорида серебра и затем покрыли желатином. Его расположили в маленьком калиброванном тефлоновом катетере (диаметр = 5 мм) таким образом, что кончик электрода выступал наружу примерно на 2 мм. Тефлоновый катетер имел длину 10 см и включал расширение на конце для многоканальной системы доставки, которая обеспечивала доставку непрерывного потока воздуха, несущего дискретные импульсы хемосенсорного раздражителя. Поток воздуха сначала поступал в небольшую камеру и барботировался через раствор, содержащий или вомероферин или ольфактант в разбавителе или только разбавитель. Для быстрого изменения направления потока воздуха из камеры по пути, обходящему камеру, использовали соленоид. Это создавало в потоке воздуха дискретный импульс стимулятора. Систему катетера-электрода окружала вторая наружная тефлоновая трубка диаметром 2 мм и ее расположенный в центре конец был соединен с аспиратором, который обеспечивал непрерывно всасывание 3 мл/с. Такое концентрическое расположение наружной всасывающей трубки обеспечивало локализацию выделяющегося хемочувствительного раздражителя на площади, которую авторы назвали "миниполе" (диаметром примерно 1 мм), что помогало избежать диффузии веществ в область, находящуюся вне участка стимуляции или в дыхательную систему. Система стимуляции и регистрации может быть расположена либо на нейросенсорном эпителии в VNO, либо на поверхности обонятельного или респираторного эпителия.

Электровомероносограмма (EVG).

Запись осуществляли в спокойной обстановке, при этом субъекты находились в положении лежа на спине; многофункциональный минидатчик сначала стабилизировали в носовой полости, используя при этом носовой расширитель, помещенный в преддверии носа. Электрод сравнения и заземленный электроды состояли из серебряных дисков (8 мм), при этом оба были расположены на надпереносье.

Вход в VNO или в сошниково-носовое углубление отождествляли путем первой дилатации носового отверстия и преддверии носа. Для введения кончика тефлонового катетера и установления электродной системы в отверстие VNO, где ее стабилизировали в сошниково-носовом отверстии на глубину 1 мм, использовали бинокулярную лупу с шестикратным увеличением с галогеновой подсветкой. Испытание на адекватную деполяризацию в ответ на испытуемое вещество указывало об оптимальном размещении записывающего электрода.

Электрические сигналы от записывающего электрода поступали в DC усилитель, после чего их преобразовывали в цифровую форму, обрабатывали на компьютере и сохраняли. Измеряли полную амплитуду сигналов и интегрировали область, находящуюся под деполяризационной волной, при этом сигнал непрерывно контролировали на экране компьютера и на цифровом осциллографе. Артефакты, продуцируемые за счет дыхательных движений, устраняли путем тренировки индивидуумов к дыханию через рот при небно-глоточном закрытии.

Хемочувствительные стимуляторы. В тесте на обоняние были использованы цинеол, 1-карвон и вомероферины A, B, C, D, E и F. Образцы вомероферинов в концентрации 25-800 фмоль поставлялись в непрерывном потоке воздуха в течение периода времени от 300 мс до 1 с. Каждую серию коротких импульсов разделяли интервалы времени от 3 до 5 мин. Все компоненты линий, несущих испытуемый раздражитель, были выполнены из тефлона, стекла или нержавеющей стали и перед каждым применением их осторожно очищали и стерилизовали.

Электроольфактограмма (EOG). При регистрации обонятельного эпителия использовали тот же самый стимулирующий и записывающий многофункциональный минидатчик, который применяли для VNO. Кончик медленно вводили до тех пор, пока записывающий электрод не касался обонятельной слизистой оболочки. Об адекватном размещении сигнализировала деполяризация в ответ на импульс пахучего испытуемого вещества.

Активность коры головного мозга была индуцирована посредством стимуляции VNO вомероферинами, и стимуляции обонятельного эпителия пахучими веществами, обеспечиваемой 300-миллисекундными воздушными импульсами. Эту активность регистрировали с использованием электроэнцефалографических (EEG) электродов, размещенных в положениях Cz-A1. и Tz-A1 по международной системе 10120; заземленный электрод разместили на сосцевидном отростке височной кости. Электрическое сопротивление кожи (EDA) регистрировали, используя стандартные 8-миллиметровые серебряные электроды, находящиеся в контакте с ладонной кожей среднего и безымянного пальцев, через проходящую гелевую межфазную поверхность. Температуру кожи (ST) зарегистрировали с помощью небольшого (1,0 мм) термисторного датчика, помещенного в дольке правой ушной раковины. Периферический артериальный пульс (PAP) зарегистрировали с помощью плетизмографа, прикрепленного к кончику указательного пальца. Частоту дыхания (RF) измеряли с помощью регулируемого тензиометрического датчика, помещенного возле нижнего отдела грудной клетки. Все электрические сигналы усиливали (DC), преобразовывали в цифровые данные (МР-100, Системы Biopac) и непрерывно контролировали на компьютере.

Статистический анализ. Измерили и статистически проанализировали EVG или EOG, изменения полной амплитуды и частоту изменений других параметров. Значимость результатов определяли с использованием двустороннего Т-критерия Стьюдента или дисперсионного анализа (ANOVA).

Влияние вомероферинов на EVG. Было обнаружено, что каждый из вомероферинов продуцирует сексуально диморфный рецепторный потенциал (фиг. 8A - B). Осуществляли запись EVG для 30 мужчин и 30 женщин (в возрасте от 20 до 45 лет). Вомероферины разбавили и в виде односекундных импульсов вводили в VNO с интервалами между импульсами, составляющими "b" минут, в том случае, когда индивидуумы по опросу были не в состоянии "чувствовать запах" или осознанно ощущать какой-либо из вомероферинов. Это обнаружение находится в соответствии с результатами, сообщаемыми в работах (Monti-Bloch, L. and Grosser, B. I. (1991) "Effect of putative pheromonenes on the electrical activity of the human vomernasal organ and olfactory epithelium", J. Steroid Biochem. Molec. Biol. 39:573- 582, в которых указывалось, что ни обонятельный, ни вомерофериновый испытуемый раздражитель, доставляемый в VNO, не вызывает ощутимых восприятий при используемой концентрации.

Фиг. 8A иллюстрирует усредненную ответную реакцию мужчин (в возрасте от 20 до 38 лет) на разбавитель и на эквимолярные количества (100 фмоль) пяти вомероферинов (А, В, C, D и F) и на F, являющийся стереоизомером F. Профиль ответной реакции на каждое вещество был одинаковым для всех индивидуумов независимо от возраста, при этом не была обнаружена значимая разница ни с помощью T-критерия Стьюдента, ни с помощью дисперсионного анализа. Так, например, А, C и D оказали значительные воздействия (M₁₅=11,4 мВ, SD=3,6 мВ; M₇₆= 6,4 мВ, SD=2,5 мВ и M₃₄=15,1 мВ, SD=4,9 мВ; p<0,01), что находилось в соответствии со всеми индивидуальными случаями. Другие вомероферины деполяризовали рецепторы VNO в гораздо меньшей степени, но при этом средние амплитуды ответных реакций для различных индивидуумов отличались незначительно. Вомероферины, воздействующие на мужчин, вызывали большие ответные реакции, чем разбавитель (p<0,001). В, F и аналогичные концентрации ольфактантов вызывали значительно меньшие ответные реакции в VNO мужчин (фиг. 8A и 9)
Аналогичные экспериментальные данные были получены для 30 женщин (возрастом 20-45 лет). Из вомероферинов, F (100 фмоль) вызывал эффект с наибольшим значимым различием внутри группы (фиг. 8B), А индуцировал незначительный эффект, который имел значимое отличие от воздействия F (p<0,01). В обеих группах индивидуумов, активные вомероферины вызывали ответную рецепторную реакцию с большими стандартными отклонениями (фиг. 8). При изучении частотного распределения эффектов А и F соответственно у мужчин и женщин авторы обнаружили бимодальное распределение. В настоящее время проводятся исследования относительно значимости этих наблюдений.

E, являющийся стереоизомером F, не стимулирует VNO у женщин, тогда как F оказывает такое воздействие (фиг. 8B). Это является доказательством специфичности VNO-распознавания вомероферинов. В этом отношении интересно отметить, что в то время как F является превосходным вомероферином, E оказывает более сильное воздействие на обонятельный эпителий, чем F (фиг. 8B и 9).

Влияние вомероферинов на EOG. Для 20 индивидуумов, 10 мужчин и 10 женщин, регистрировали суммарный рецепторный потенциал от обонятельного эпителия (OE). В противоположность чувствительности VNO к вомероферинам, OE является менее чувствительным к этим веществам. Это является справедливым как для мужчин, так и для женщин. Средняя амплитуда рецепторного потенциала составляла в пределах от 2,3 мВ до 0,78 мВ. В этом исследовании B является единственным вомероферином, оказывающим значительное воздействие на OE (p<0,02). Из индивидуумов, опрошенных относительно восприятия запахов, 16 сообщили об отсутствии обонятельного восприятия, в то время как трое мужчин и одна женщина описали B как обладающий неприятным запахом. Полученные данные показывают, что при концентрациях, используемых в нашем исследовании, большинство вомероферинов является неэффективными стимуляторами обонятельных рецепторов, но при этом оказывают очевидное воздействие на рецепторы сошниково-носового органа.

Влияние ольфактантов на EVG и EOG. В противоположность вомероферинам ольфактанты 1-карвон и цинеол вызывают лишь незначительную локальную реакцию в VNO (фиг. 9B). Это является справедливым как для мужчин, так и для женщин. Как и ожидалось, эти ольфактанты при местном введении в OE вызывают сильную ответную реакцию как у мужчин, так и у женщин (p<0,01) (фиг. 9A). Разбавитель деполяризовал обонятельные рецепторы в меньшей степени, чем цинеол или 1-карвон (p<0,01), и он не вызывал обонятельного восприятия.

Рефлекторные воздействия вомероферинов. Исследования проводили с целью определения рефлекторных реакций центральной нервной системы (CNS) на стимуляцию VNO вомероферином. Сексуально диморфные локальные реакции, вызванные вомероферинами (фиг. 8A и В), отображались в автономных реакциях мужчин и женщин. У мужчин (фиг. 8C) А и C уменьшали сопротивление кожи (электрокожная активность = EDA) (p<0,01, n=30). У женщин (фиг. 8B) F и В вызывали большее уменьшение EDA, чем А или C (p<0,01, n=30).

Вомероферины А и C вызвали значительное увеличение температуры кожи (ST) (фиг. 8G) у 30 мужчин (p<0,01); однако D вызвал значительное уменьшение температуры (p<0,01). У 30 женщин (фиг. 8H) В и F вызвали значительное увеличение температуры (ST) (p<0,01) по сравнению с А и C. У мужчин вомероферины вызвали изменение EDA и ST с большими стандартными отклонениями, чем у женщин.

У мужчин и женщин во время введения в VNO воздушных импульсов (от 300 мс до 1 с), содержащих 200 фмоль вомероферина (фиг. 8G и H), регистрировали кортикальную активность от Cz и Tz. У мужчин (фиг. 8E) А, C и D значительно увеличивали активность кортикального альфа-ритма с задержкой 270-380 мс. D и А вызвали самое сильное воздействие (p<0,01). После подачи одиночного импульса активного вещества синхронизация EEG поддерживалась в течение от 1,5 до 2,7 мин. У женщин (фиг. 8F) одиночный импульс (200 фмоль) B и F, подаваемый в VNO, вызвал увеличение кортикального альфа-ритма независимо от ответной реакции обонятельных рецепторов. Авторы обнаружили характерную специфичность в ответной реакции VNO человека и обонятельного эпителия, что позволяет предположить, что они являются независимыми функциональными системами, имеющими отдельные связи с центральной нервной системой (CNS). (Brookover, C. (1914). The nervus terminalis in adult man. J. Comp. Neurol. 24:131-135). Существует также предварительное доказательство того, что EVG не связана с ноцирецепторными окончаниями тройничного нерва, так как применение местной анестезии (2% лидокаина) в респираторном эпителии носовой перегородки не блокирует и не снижает EVG (Monti-Bloch, L. and Grosser, B.I. (1991) "Effect of putative pheromonenes on the electrical activity of the human vomernasal organ and olfactory epithelium", J. Steroid Biochem. Molec. Biol. 39: 573-582).

Авторы провели дополнительные испытания, в которых использовали андроста-5,16-диен-3β,19-диол и четыре других андростана, идентифицированные посредством их положений на графике. Результаты показаны на фиг. 10-24. EEG, RF и EKG-реакции на андроста-5,16-диен-3β,19-диол были более сильными у женщин, чем у мужчин, в то время как ST, GSR и EVG-реакции были более сильными у мужчин. Некоторые женщины, которым вводили соединение, сообщили об ощущении счастья, которое является необычным, потому что такие сообщения обычно сопровождаются гораздо более высокими данными RF и GSR, чем те, которые показаны на фиг. 18B и 18C.

Очевидно, что рецепторы VNO являются более чувствительными к вомероферинам, чем к любому из испытуемых ольфактантов; для обонятельных рецепторов является справедливым противоположное утверждение. OE (обонятельный эпителий) может иметь клеточные рецепторы для некоторых вомероферинов, однако специфичность реакции VNO несомненно отличается от реакции OE. Половые различия были отмечены в отношении специфичности и воздействия двух групп вомероферинов А, C и D; и B и F. Это предполагает возможный половой диморфизм, связанный с рецепторами. Обнаружение этого факта позволяет предположить, что стимуляция VNO вомероферином приводит к активации компонентов вегетативной нервной системы у взрослого человека.

Кроме того, результаты указывают на то, что стимуляция VNO вомероферинами вызывает синхронизацию EEG (фиг. 8G и 8H). Таким образом, эти результаты свидетельствуют о том, что сошниково-носовая система реагирует на множество хемочувствительных раздражителей и что некоторые из них способны вызвать рефлекторную автономную активность.

Изобретение относится к новым андростановым стероидам формулы I

где P₁-оксо, α-(β-)гидрокси, α-(β-)-C_1-4-алкокси или α-(β-)бензилокси; P₂ - C_1-4-алкил, гидрокси-C_1-4-алкил; P₃ отсутствует или C_1-4-алкил; P₄ - водород, оксо или гидрокси; P₅ - один или два атома водорода, метил или метилен; P₆ - водород, которые являются лигандными полухимическими продуктами, связывающимися с нейроэпителиальными рецепторами. 7 з.п. ф-лы, 1 табл., 24 ил.

1. Андростаны общей формулы

где P₁ выбран из группы, включающей оксо, α-(β)-гидрокси, α-(β)-C_1-4-алкокси или α-(β-)бензилокси;
P₂ выбран из группы, включающей C_1-4-алкил или гидрокси-C_1-4алкил;
P₃ отсутствует или C_1-4алкил;
P₄ обозначает водород, оксо или гидрокси;
P₅ обозначает один или два заместителя, где P₅ представляет один или два атома водорода, метил или метилен;
P₆ обозначает водород;
a, b, c, d, e, f, h являются альтернативными участками для необязательных двойных связей,
при условии, что 1) одновременно не может быть следующее: a, c, d, e и f отсутствуют, b и h присутствуют, P₁ обозначает оксо, P₂ обозначает метил, P₃ обозначает метил, P₄ обозначает водород, P₅ обозначает водород и P₆ обозначает водород;
2) одновременно не может быть следующее: a, b, d, e и f отсутствуют, c и h присутствуют, P₁ обозначает β-гидрокси, P₂ обозначает метил, P₃ обозначает метил, P₄ обозначает водород, P₅ обозначает водород и P₆ обозначает водород;
3) одновременно не может быть следующее: a, c, d, e и f отсутствуют, b и h присутствуют, P₁ обозначает β-гидрокси, P₂ обозначает метил, P₃ обозначает метил, P₄ обозначает водород, P₅ обозначает водород и P₆ обозначает водород;
4) одновременно не может быть следующее: a, c, d, e и f отсутствуют, b и h присутствуют, P₁ обозначает α-гидрокси, P₂ обозначает метил, P₃ обозначает метил, P₄ обозначает водород, P₅ обозначает водород и P₆ обозначает водород;
5) одновременно не может быть следующее: a, c, e и f отсутствуют, b, d и h присутствуют, P₁ обозначает оксо, P₂ обозначает метил, P₃ обозначает метил, P₄ обозначает водород, P₅ обозначает водород и P₆ обозначает водород;
6) одновременно не может быть следующее: a, c, d, e и f отсутствуют, b и h присутствуют, P₁ обозначает оксо, P₂ обозначает метил, P₃ обозначает метил, P₄ обозначает оксо, P₅ обозначает водород и P₆ обозначает водород;
7) одновременно не может быть следующее: a, c, d, e и f отсутствуют, b и h присутствуют, P₁ обозначает оксо, P₂ обозначает гидроксиметил, P₃ обозначает метил, P₄ обозначает водород, P₅ обозначает водород и P₆ обозначает водород;
8) одновременно не может быть следующее: b, d, e и f отсутствуют, a, c и h присутствуют, P₁ обозначает метокси, P₂ обозначает метил, P₃ обозначает метил, P₄ обозначает водород, P₅ обозначает водород и P₆ обозначает водород;
9) одновременно не может быть следующее: a, c, d, и f отсутствуют, b, e и h присутствуют, P₁ обозначает оксо, P₂ обозначает метил, P₃ обозначает метил, P₄ обозначает водород, P₅ обозначает водород и P₆ обозначает водород;
10) одновременно не может быть следующее: a, c, d, e, f и h отсутствуют, b присутствует, P₁ обозначает оксо, P₂ обозначает метил, P₃ обозначает метил, P₄ обозначает водород, P₅ обозначает 2 атома водорода и P₆ обозначает водород;
11) одновременно не может быть следующее: a, b, d, е, f и h отсутствуют, c присутствует, P₁ обозначает β-гидрокси, P₂ обозначает метил, P₃ обозначает метил, P₄ обозначает водород, P₅ обозначает 2 атома водорода и P₆ обозначает водород;
12) одновременно не может быть следующее: a, c, d, e, f и h отсутствуют, b присутствует, P₁ обозначает β-гидрокси, P₂ обозначает метил, P₃ обозначает метил, P₄ обозначает водород, P₅ обозначает 2 атома водорода и P₆ обозначает водород;
13) одновременно не может быть следующее: a, c, d, e, f и h отсутствуют, b присутствует, P₁ обозначает α-гидрокси, P₂ обозначает метил, P₃ обозначает метил, P₄ обозначает водород, P₅ обозначает 2 атома водорода и P₆ обозначает водород;
14) одновременно не может быть следующее: a, c, e, f и h отсутствуют, b и d присутствуют, P₁ обозначает оксо, P₂ обозначает метил, P₃ обозначает метил, P₄ обозначает водород, P₅ обозначает 2 атома водорода и P₆ обозначает водород;
15) одновременно не может быть следующее: a, c, d, e, f и h отсутствуют, b присутствует, P₁ обозначает оксо, P₂ обозначает метил, P₃ обозначает метил, P₄ обозначает оксо, P₅ обозначает 2 атома водорода и P₆ обозначает водород;
16) одновременно не может быть следующее: b, d, e, f, и h отсутствуют, а и с присутствуют, P₁ обозначает метокси P₂ обозначает метил, P₃ обозначает метил, P₄ обозначает водород, P₅ обозначает 2 атома водорода и P₆ обозначает водород;
17) одновременно не может быть следующее: a, c, d, f и h отсутствуют, b и e присутствуют, P₁ обозначает оксо, P₂ обозначает метил, P₃ обозначает метил, P₄ обозначает водород, P₅ обозначает 2 атома водорода и P₆ обозначает водород;
18) одновременно не может быть следующее: a, c, d, f и h отсутствуют, b и e присутствуют, P₁ обозначает β-гидрокси, P₂ обозначает метил, P₃ обозначает метил, P₄ обозначает водород, P₅ обозначает 2 атома водорода и P₆ обозначает водород;
19) одновременно не может быть следующее: a, c, d, e, f и h отсутствуют, b присутствует, P₁ обозначает оксо, P₂ обозначает метил, P₃ обозначает метил, P₄ обозначает гидрокси, P₅ обозначает 2 атома водорода и P₆ обозначает водород;
20) одновременно не может быть следующее: a, c, d, e, f и h отсутствуют, b присутствует, P₁ обозначает оксо, P₂ обозначает метил, P₃ обозначает метил, P₄ обозначает водород, P₅ обозначает метилен и P₆ обозначает водород;
21) одновременно не может быть следующее: a, b, d, e, f и h отсутствуют, c присутствует, P₁ обозначает оксо, P₂ обозначает метил, P₃ обозначает метил, P₄ обозначает водород, P₅ обозначает метилен и P₆ обозначает водород и
22) одновременно не может быть следующее: a, c, d, e, и h отсутствуют, b и f присутствуют, P₁ представляет оксо, P₂ обозначает метил, P₃ отсутствует, P₄ обозначает водород, P₅ обозначает метил и P₆ обозначает водород. 2. Соединение по п.1, где c и h являются двойными связями. 3. Соединение по п. 2, где P₂ является гидроксиметилом и P₁ является β-гидрокси. 4. Соединение по п.1, где b является двойной связью и P₅ является метиленом. 5. Соединение по п.4, где P₁ является гидрокси или оксо и P₄ необязательно является оксо. 6. Соединение по п.1, где b и h представляют двойные связи. 7. Соединение по п. 6, где P₄ представляет гидрокси и P₁ представляет оксогруппу. 8. Соединение по п.1, выбранное из группы, включающей: 17-метилен-андрост-4-ен-3-ол; 17-метилен-6-оксо-андроста-4-ен-3-он; 6β-гидроксиандроста-4,16-диен-3-он; 18-нор-17-метиландроста-4,13(17)-диен-3-ол; 18-нор-17-метиландроста-3,5,13(17)-триен-3-ил метиловый эфир; 18-нор-17-метиландроста-4,13(17)-диен-6β-ол-3-он; 17β-метиландроста-4-ен-3,6-дион; 17β-метиландроста-4-ен-3-ол; 17-метиленандроста-3,5-диен-3-ил метиловый эфир; 17-метиленандроста-4-ен-6β-ол-3-он; 17-метиленандроста-1,4-диен-3-он; 17-метиленандроста-1,3,5-триен-3-илбензоат; андроста-1,4,16-триен-6β-ол-3-он; андроста-4,16-диен-6β-ол-3-он; 17-метиленандроста-4-ен-3,6-дион и андроста-5,16-диен-3β,19-диол.