ШТАММ БАКТЕРИЙ PSEUDOMONAS AERUGINOSA 449, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ПСЕВДОМОНОЗА ПУШНЫХ ЗВЕРЕЙ Российский патент 2001 года по МПК C12N1/20 A61K39/104 C12N1/20 C12R1/385 

Изобретение относится к биотехнологии и ветеринарии и предназначено для производства вакцинных препаратов против синегнойной инфекции пушных зверей, преимущественно песцов и лисиц.

Синегнойная инфекция распространена повсеместно, наносит значительный экономический ущерб звероводству и представляет опасность здоровью людей. В зверосовхозах ежегодно регистрируются энзоотипии среди норок, песцов и лисиц. Зарегистрированы случаи болезни у кроликов, нутрий, хорей. В последние годы стали отмечать синегнойную инфекцию у собак домашнего содержания.

Патология при синегнойной инфекции как у людей, так у животных очень разнообразна - поражение репродуктивной системы, септические процессы в организме, поражение желудочно-кишечного тракта у молодых животных, поражение молочных желез и т.д. У лисиц и песцов она протекает с поражениями гениталий и сопровождается нарушением процесса беременности - абортами, рассасыванием эмбрионов, пропустованием самок.

Возбудитель псевдомоноза обладает серотиповой вариабельностью, поэтому эффективность специфической профилактики определяется полнотой антигенного состава входящих в вакцину компонентов.

Известен вакцинный штамм Pseudomonas aeruginosa PA-7 второго серотипа, используемый для изготовления анатоксин-вакцины против синегнойной инфекции (SU N 1202109, опубл. 15.06.86).

Однако известный штамм не содержит антигены возбудителя псевдомоноза пушных зверей и не обеспечивает формирование иммунитета против синегнойной инфекции пушных зверей.

Наиболее близким аналогом является штамм Pseudomonas aeruginosa N202 шестого серотипа, входящий в состав инактивированной вакцины против псевдомоноза пушных зверей, преимущественно норок ("Ветеринарные препараты". Справочник, под ред. Д.Ф.Осидзе., М.: Колос, 1981,).

Однако известный производственный штамм имеет нестабильные вирулентные и иммуногенные свойства и, более того, не позволяет профилактировать псевдомоноз песцов и лисиц, вызываемый возбудителями других серовариантов.

Задачей изобретения является получение штамма Pseudomonas aeruginosa для изготовления эффективной вакцины против псевдомоноза пушных зверей независимо от серологического профиля возбудителя.

Технический результат изобретения заключается в получении нового штамма Psendomonas aeruginosa 449₂, способного продуцировать основные факторы патогенности в оптимальных значениях и позволяющий изготовить вакцину против любых серовариантов синегнойной палочки не только для песцов и лисиц, но и других восприимчивых к данной инфекции зверей и животных.

Сущность изобретения: штамм бактерий Pseudomonas aeruginosa 449₂ выделен от самки песца з/с "Пионер" и депонирован в коллекции штаммов - возбудителей заболеваний пушных зверей музея бактериальных и вирусных культур Научно-исследовательского института пушного звероводства и кролиководства (НИИПЗК) им. В.А. Афанасьева и имеет регистрационный номер 449₂.

Штамм Ps. aeruginosa 449₂ предназначен в качестве продуцента протеолитических ферментов (щелочной протеазы и эластазы) при изготовлении специфического иммунного препарата против синегнойной инфекции песцов и лисиц.

Штамм бактерий Pseudomonas aeruginosa НИИПЗК N 449₂ характеризуется следующими признаками и свойствами.

Генетические маркеры:
Серовариант 03 (Habs)
Пиоцинотип 288858
Штамм 449₂ протеолитический, слизеобразующий, с адгезивной активностью в отношении эритроцитов кролика.

Морфологические свойства. Производственная культура представляет собой тонкие прямые грамотрицательные палочки, размером 2-3 х 0,5 микрона. Палочки подвижные, монотрихи, спор не образуют, в мазках располагаются поодиночке и рядами.

Культуральные свойства. Аэроб, оптимальная температура роста при 32-37^oC, сохраняет способность к росту и размножению при 42^oC. Растет почти на всех питательных средах с pH 8,0. На поверхности МПБ образует характерную серовато-серебристую пленку. Образует пигмент пиоцианин. Лучшей средой культивирования является среда Iensen'a, обогащенная солями и аминопептидом. На МПА образует S- и R-формы, с преобладанием S-форм.

Биохимическая активность. Высокая кислотообразующая активность в отношении глюкозы и галактозы; в аэробных условиях расщепляет сахара с образованием глюконовой кислоты без газа, разжижает желатин, свертывает молоко, не вызывает образования индола и сероводорода. Образует цитохромоксидазу, вызывает гидролиз ацетамида.

Антигенные свойства. Штамм вырабатывает экзотоксин А, щелочную протеазу, эластазу, внеклеточную слизь, обладает адгезивной активностью.

Токсигенные свойства. В жидкой питательной среде вырабатывает экзотоксин А (РПГА 1:32), щелочную протеазу (показатель гидролиза казеина 112), эластазу (РП 1:16), внеклеточную слизь в МПБ и МПА. Титр адгезина в РГА 1:8.

Хранение штамма. При температуре 6±2^oC в ампулах в лиофилизированном состоянии более трех лет; в пробирках в столбике полужидкого агара, приготовленного на бульоне Мартена с добавлением 0,5 %-ного глютамата натрия и 1%-ного глицерина, под вазелиновым маслом в течение трех месяцев; в пробирках на скошенном агаре не более 14 дней.

Контроль за состоянием штамма. Контролируют морфологические, биохимические, культуральные и вирулентные свойства не реже 1 раза в три месяца. Антигенные свойства (протеазу и эластазу) проверяют перед производством иммунного препарата. Штамм предварительно культивируют в среде Iensen'a.

Показатель гидролиза казеина щелочной протеазой в реакции диффузии в казеиновый агар должен быть не менее 112, а титр эластазы в реакции супернатанта с моновалентной антиэластазной сывороткой в 1%-ном агаре Пурифайта должен быть не менее 1:16.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Штамм бактерий Pseudomonas aeruginosa 449₂ культивируют на бульоне Мартена или синтетической среде при 32^oC в течение 18-20 часов при постоянном встряхивании на шуттель-аппарате. По истечении срока инкубации культуру проверяют на чистоту роста в мазках, окрашенных по Грамму.

Далее из выросшей культуры отбирают пробу, центрифугируют ее при 6000 об/мин в течение 20 мин. Надосадочную жидкость сливают и исследуют на содержание: экзотоксина А в реакции преципитации (РП) с антитоксической сывороткой и/или на щелочную протеазу в реакции гидролиза казеина и/или на эластазу в РП с моновалентной антиэластазной сывороткой. Титры должны составлять: экзотоксина А - не ниже 1:4, щелочной протезы - не ниже 1:32, эластазы - не ниже 1:16.

После контроля выросшей культуры на токсигенность и протеолитическую активность отделенную бакмассу подвергают инактивации любым известным способом и добавляют адъювант, например гидроокись алюминия.

Пример 2. Полученную по примеру 1 вакцину проверяют на безвредность на 9 песцах. Вакцину вводят внутримышечно в область бедра правой лапы в дозах: трем песцам по 1,0 мл, трем - по 2,0 мл и трем по 3,0 мл.

Проводят ежедневное наблюдение за песцами в течение 7 дней с индивидуальным прощупыванием места инъекции. Термометрию песцов проводят дважды на 2-й и 4-й дни после введения препарата.

Результаты исследования показали, что все песцы вели себя обычно, корм поедали полностью, агрессивность не наблюдалась. Температура тела была в пределах нормы - 37-39^oC. При прощупывании места инъекции вакцины не было обнаружено опухания конечности, болезненности.

Пример 3. Полученной вакциной иммунизируют песцов на ферме, неблагополучной по синегнойной инфекции, для исследования влияния иммунизации на результаты воспроизводства, поскольку основная патология при синегнойной инфекции проявляется именно в период воспроизводства.

В данном хозяйстве среди песцов отмечаются случаи абортов, пропустования самок, рождение мертвых щенков. При этом у абортированных самок на последних сроках беременности (за неделю до срока щенности) при бактериологическом исследовании была выделена культура синегнойной палочки 03 и 09 сероваров.

Полученной по примеру 1 вакциной иммунизируют 50 самок песцов внутримышечно в дозе 1,5 мл. В качестве контроля служат другие 50 самок, аналогичные по возрасту, окрасу и условиям содержания и кормления.

Установлено, что применение вакцины повысило плодовитость песцов опытной группы на 0,7 щенка. Вакцина предотвратила рассасывание плодов у некоторых самок опытной группы, в то время как у некоторых самок контрольной группы был зарегистрирован приплод всего в 4-5 щенков. Это чаще всего обусловлено рассасыванием плодов в первой половине беременности.

Таким образом, вакцина на основе штамма 449₂ позволит предотвратить скрытые потери при воспроизводстве пушных зверей в хозяйствах, неблагополучных по синегнойной инфекции.

Изобретение относится к биотехнологии и ветеринарии и предназначено для производства вакцинных препаратов против синегнойной инфекции пушных зверей, преимущественно песцов и лисиц. Штамм бактерий Pseudomonas aeruginosa депонирован в коллекции штаммов - возбудителей заболеваний пушных зверей музея бактериальных и вирусных культур Научно-исследовательского института пушного звероводства и кролиководства (НИИПЗК) им. В.А. Афанасьева и имеет регистрационный номер 449₂. Штамм относится к 03 сероварианту. Штамм культивируют на бульоне Мартена или синтетической среде при 32^oC в течение 18 - 20 ч при постоянном встряхивании. После контроля выросшей культуры на токсигенность и протеолитическую активность отделенную бакмассу подвергают инактивации. Далее добавляют адьювант-гидроокись алюминия и расфасовывают. Изобретение позволяет предотвратить скрытые потери при воспроизводстве пушных зверей в хозяйствах, неблагополучных по синегнойной инфекции, независимо от серологического профиля возбудителя.

Штамм бактерий Pseudomonas aeruginosa 449₂, используемый для изготовления вакцины против псевдомоноза пушных зверей.