ШТАММ БАКТЕРИЙ STREPTOCOCCUS PYOGENES №289, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ВАКЦИН ПРОТИВ СТРЕПТОКОККОЗА ПУШНЫХ ЗВЕРЕЙ Российский патент 2005 года по МПК C12N1/20 A61K39/09 C12N1/20 C12R1/46 

Изобретение относится к области биотехнологии и ветеринарии и предназначено для производства вакцинных препаратов против стрептококковой инфекции пушных зверей, преимущественно песцов и лисиц.

Цель изобретения - выделение штамма для изготовления вакцины против стрептококкоза песцов.

Стрептококковая инфекция распространена повсеместно, наносит значительный экономический ущерб звероводству и представляет опасность здоровью людей. В зверосовхозах ежегодно регистрируются заболевания песцов и лисиц, кроликов, нутрий, хорей.

Патология при стрептококковой инфекции как у людей, так и у животных очень разнообразна - поражение верхних дыхательных путей и легких, поражение молочных желез. У молодняка лисиц и песцов она вызывает септические поражения организма и ранний отход в первые дни жизни.

Возбудитель стрептококкоза группы А носит антигенную структуру. М-вещество - белок, с которым связаны вирулентность и иммуногенность микробной клетки. Поэтому эффективность специфической профилактики определяется наличием М-фактора в антигенном составе входящих в вакцину компонентов.

Изобретение предназначено для производства вакцинных препаратов против стрептококковой инфекции пушных зверей, преимущественно песцов и лисиц. Штамм бактерий Streptococcus pyogenes №289 выделен от самки песца и депонирован в коллекцию штаммов возбудителей заболеваний пушных зверей музея бактериальных и вирусных культур Научно-исследовательского института пушного звероводства и кролиководства им. В.А.Афанасьева и имеет регистрационный номер 289 М-положительный.

М-положительный штамм культивируют на бульоне Тодда-Хевитта в течение 15-18 часов при 35-37°С. После проверки чистоты культуры отделенную биомассу подвергают инактивации прогреванием, готовят кислый экстракт. Далее добавляют адьювант - гидроокись алюминия и расфасовывают.

Изобретение позволяет предотвратить потери при воспроизводстве пушных зверей в хозяйствах, неблагополучных по стрептококкозу.

Известен вакцинный штамм "К-ДЕП" стрептококка серогруппы С, используемый для изготовления инактивированной ГОА-формолвакцины против стрептококкоза нутрий.

Патент №2097422 от 27.11.1997 г. Штамм выделен от нутрий, адаптирован к этому виду зверей и используется для изготовления профилактических препаратов против стрептококкоза нутрий.

Однако вакцинных штаммов стрептококка, выделенных от песцов и лисиц и применяемых для изготовления вакцины против стрептококкоза песцов и лисиц, до настоящего времени не зарегистрировано.

Технический результат изобретения заключается в получении штамма Streptococcus pyogenes №289, положительного по М-белку и позволяющего изготовить вакцину против Streptococcus pyogenes группы А на основе М-фактора патогенности.

Сущность изобретения: штамм бактерии Streptococcus pyogenes №289 выделен из самки песца и депонирован в коллекции штаммов-возбудителей заболеваний пушных зверей Музея бактериальных и вирусных культур Научно-исследовательского института пушного звероводства и кролиководства (НИИПЗК) им. В.А.Афанасьева и имеет регистрационный номер 289 М-положительный.

М-положительный штамм Streptococcus pyogenes №289 предназначен в качестве продуцента стрептококкового антигена М-белка при изготовлении специфического иммунного препарата при стрептококковой инфекции.

Штамм бактерий Streptococcus pyogenes НИИПЗК №289 характеризуется следующими признаками:

Генетические маркеры

- серовариант 24;

- М-положительный с высокой М-антигенной активностью.

Морфологические свойства

- гемолитический стрептококк типа А;

- производственная культура представляет собой неподвижные шаровидные кокки диаметром 0,8-1,0 μ, образующие цепочки, положительно окрашиваются по Грамму.

Культурные свойства

- факультативный анаэроб, оптимальная температура роста 37°С, верхняя и нижняя температурная граница 20°С и 24°С;

- на агаре с кровью образуют мелкие (102 мм в диаметре) полупрозрачные колонии, сероватые или бесцветные, которые не врастают в агар, с выраженной зоной гемолиза;

- в жидких питательных средах придонно-пристеночный рост;

- общепринятые среды для выращивания МПА с 5% дефибрированной крови барана, полужидкий агар с сывороткой, бульона Мартена с 0,2% глюкозы рН=7,4-7,6;

- хорошо сохраняется при условии лиофильного высушивания с сахорозожелатинозным стабилизатором, а также при быстром замораживании и хранении при 40°С.

Ферментативные свойства

- не разжижает желатин;

- свертывает молоко;

- свертывает и обесцвечивает лакмусовое молоко;

- ферментирует глюкозу, мальтозу, сахарозу;

- не расщепляет маннит, сорбит, дульцит.

Вирулентные свойства

- при внутрибрюшинном введение белым мышам LD/50 составляет 10×0,2 мл.

Антигенные свойства

- штамм содержит М-белок, обладает антигенными свойствами и стимулирует образование в сыворотки крови М-специфических антител, обладающих защитным действием против стрептококка.

Токсические свойства

- в жидкой и твердой питательной среде вырабатывает стрептококковый эритрогенный термолабильный экзотоксин и термолабильный нуклеопротеидный аллерген.

Хранение штамма

- при температуре 6±2°С

в лиофилизированном состоянии более 2 лет;

в пробирках на МПБ при +9°С 30 дней;

- в ампулах по 0,5 мл культуры Str. на среде Тодда-Хевитта при температуре 70°С более 3 лет.

Контроль за состоянием штамма

- морфологические, биохимические, культуральные и вирулентные свойства (М-фактор) проверяют перед производством иммунного препарата.

Технический результат заключается в получении нового штамма, способного продуцировать М-фактор патогенности в необходимом количестве для создания иммунитета против стрептококкоза.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами

Пример 1.

Штаммы культуры Streptococcus pyogenes культивировали на бульоне Тодда-Хевитта при 37°С. Через 12 часов культуру сеяли в пробирки с донорской человеческой кровью, не содержащей антител к Streptococcus pyogenes, и выращивали в течение 18-24 часов. По истечении срока инкубации культуру проверяли на чистоту роста в мазках, окрашенных по Грамму. Полученную культуру посеяли на среду Тодда-Хевитта, инкубировали в течение 6 часов. Полученной культурой в логарифмической стадии роста засевали 500 мл со средой Тодда-Хевитта, инкубировали в течение 18-20 часов при 37°С. После инкубации флаконы с культурой центрифугировали при 150 об/мин в течение 30 минут. Надосадочную жидкость сливали. В осадок добавляли 50 мл физиологического раствора, ресуспендировали и проверяли на чистоту роста в мазках, окрашенных по Грамму.

Полученную суспензию прогревали при 60°С 30 минут для инактивации стрептококковой культуры. После инактивации суспензию проверяли на стерильность. Суспензию вновь центрифугировали при 1500 об/мин - 30 минут. В надосадочную жидкость добавили 0,35 мл HCl. Полученную суспензию прогрели в водяной бане при 100°С в течение 10 минут.

Суспензию охладили, добавили каплю Фенола Красного в каждый флакон. Довели рН до 7,0. К полученной суспензии добавили адьювант - гидроокись алюминия. Полученный антиген проверили на наличие М-белка в реакции преципитации с контрольной сывороткой.

Пример 2.

Полученную по примеру 1 вакцину проверяли на безвредность на 9 песцах. Вакцину вводили в/м в область правого бедра в дозах:

- 3 песцам по 1,0 мл,

- 3 песцам по 2,0 мл,

- 3 песцам по 3,0 мл.

Проводили ежедневное наблюдение за песцами в течение 7 дней с индивидуальным прощупыванием места инъекции. Термометрию песцов проводили дважды на 2 и 4 дни после введения препарата.

Результаты исследования показали, что все песцы вели себя обычно: корм поедали полностью, агрессивность не наблюдалась. Температура тела была в пределах нормы - 37-39°С. При прощупывании места инъекции вакцины опухание конечности и болезненности не обнаружено.

Пример 3.

Полученной вакциной иммунизировали песцов на ферме, неблагополучной по стрептококкозу, для исследования влияния иммунизации на результаты воспроизводства, поскольку основная патология при стрептококковой инфекции проявляется в период воспроизводства и в первые три недели после рождения щенков. В данном хозяйстве отмечались случаи абортов, рождение мертвых щенков, гибель щенков в первые дни жизни. При этом у аборт-плодов и павших новорожденных щенков при бактериологическом исследовании была выделена культура Streptococcus pyogenes.

Полученной вакциной по примеру 1 иммунизировали 50 самок песцов в/м в дозе 1,5 мл, в качестве контроля служат другие 50 самок, аналогичные по возрасту, условиям кормления и содержания.

Установлено, что применение вакцины повысило плодовитость песцов опытной группы на 0,5 щенка. Вакцина предотвратила гибель щенков в первые дни жизни, в то время как у некоторых самок контрольной группы выход щенков составил 3-5 голов. Таким образом, вакцина из штамма Streptococcus pyogenes №289 позволяет предотвратить скрытые потери при воспроизводстве пушных зверей в хозяйствах, неблагополучных по стрептококкозу песцов.

Изобретение относится к области биотехнологии и ветеринарии. Штамм депонирован в коллекции штаммов-возбудителей заболеваний пушных зверей музея бактериальных и вирусных культур Научно-исследовательского института пушного звероводства и кролиководства (НИИПЗК) им. В.А. Афанасьева и имеет регистрационный номер 289 М-положительный. Штамм относится к стрептококкам группы А. Штамм культивируют на мясопептонном бульоне, в среде Тодда-Хевитта, среде Пайка при 37°С в течение 18-20 часов. После контроля выросшей культуры на вирулентность отделенную биомассу подвергают инактивации и дальнейшей экстракции путем добавления соляной кислоты. Далее добавляют адьювант-гидроокись алюминия и расфасовывают. Изобретение позволяет предотвратить потери при воспроизводстве пушных зверей в хозяйствах, неблагополучных по стрептококковой инфекции.

Штамм бактерий Streptococcus pyogenes № 289 (депонирован в НИИПЗК, рег. №289 М - положительный), используемый для изготовления вакцин против стрептококкоза пушных зверей.