СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММУНОТРОПНОГО ПРОТИВОВИРУСНОГО ПРЕПАРАТА Российский патент 2001 года по МПК A61K35/60 

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и медицине, а именно, способ получения иммунотропного препарата, проявляющего высокую противовирусную активность к РНК- и ДНК-содержащим вирусам, производимого из животного сырья (молоки осетровых и лососевых рыб, тимус теленка, кровь цыплят, селезенка свиньи).

Известен способ получения противовирусных препаратов из Na-ДНК термолизом в кислой среде, или щелочным гидролизом с 0,3 N КОН. И в первом, и во втором случаях происходит деструкция и денатурация ДНК, что в конечном продукте приводит не только к снижению фармакологической эффективности, но и не обеспечивает стабильность и воспроизводимость этого эффекта [1]. Известен способ получения противовирусного препарата на основе ДНК, в котором на стадии ультразвуковой обработки при деградации высокополимерной ДНК вводят добавки перекиси, гидроперекиси, хлоратов, перманганатов, хроматов, диазоаминосодержащих [2]. Недостатком этого метода является происходящая деградация и денатурация ДНК, приводящая к снижению биологической активности и фармакологической нестабильности конечного продукта.

Известен способ получения гибрида РНК-ДНК, обладающего иммунотропной противовирусной активностью [3]. Однако этот гибрид обладает слабыми вышеуказанными свойствами вследствие того, что действие РНК-ДНК взаимосвязано.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению является способ получения средства, обладающего противовирусным действием, создание комплекса натриевой соли ДНК с металлами [4]. Однако описание способа получения противовирусного комплекса не раскрывает сущности процесса.

Целью настоящего изобретения является способ получения иммунотропного противовирусного фармацевтического препарата, обладающего высоким терапевтическим эффектом как к РНК-, так и к ДНК-содержащим вирусам.

Эта цель достигается тем, что из животного сырья получают биологически-активную субстанцию натриевой соли нативной дезоксирибонуклеиновой кислоты (Na-ДНК), в виде аморфного порошка белого цвета, с содержанием основного вещества 90-105%.

Молекулярная масса получаемой ДНК-Na составляет 270-500 кД, гиперхромный эффект - не ниже 37%, содержание белка - менее 1%. Далее, расчетное количество ДНК-Na для приготовления 1,5% раствора иммунотропного препарата отвешивается и растворяется в водном растворе определенной концентрации соли одного из переходных металлов из ряда: цинк, марганец, железо, кобальт, сурьма, процесс растворения проводят при нормальной температуре и выдерживают в течение 6 ч. Проводят процесс стерилизации полученного препарата через мембраны с размером пор 0,22 мкм и стерильный розлив в терапевтических дозах. В таблице 1 представлены количественные соотношения ДНК-Na к соли металла и цитотоксичность получаемых препаратов.

Полученный по указанному способы препарат, как видно из результатов таблицы 1, не обладает цитотоксичностью. Иммунотропность препарата зависит от гиперхромного эффекта, который во всех представленных примерах не ниже 10%.

Ниже изобретение поясняется на конкретных примерах его выполнения.

Пример 1
1 кг обезжиренных молок осетровых рыб измельчают на мясорубке, гомогенизируют в 2-х литрах цитратно-солевого раствора (0,15 М NaCl и 0,015 М Na-цитрата) и помещают в реактор с подогретым цитратно-солевым раствором (3 л), добавляют 10 л 6%-ного раствора додецилсульфата натрия в 45%- ном этиловом спирте. Реакционную смесь выдерживают при 60^oС в течение 1,5 часа, при непрерывном перемешивании. Далее в реакционную массу добавляют равный объем 5 М раствора NaCl и продолжают процесс при той же температуре еще 1,5 часа. Затем реакционную массу охлаждают до комнатной температуры и проводят ультразвуковую обработку, с интенсивностью 2 Вт/см² при частоте 8 кГц в течение 80 мин. "Озвученную" массу смешивают с кизельгуром в соотношении 5 : 1 (объем : масса) и отделяют жидкую фазу на нуч-фильтре. Жидкую фазу, после микрофильтрации концентрируют баромембранным методом (мембрана с размером пор 0,45 мкм). Из концентрата выделяют осадок ДНК-Na 96% этиловым спиртом. Осадок тщательно омывается 70% этанолом и высушивается при 60^oC.

Пример 2. 1 кг обезжиренных молок лососевых рыб измельчают, гомогенизируют. Далее, как в примере 1.

Пример 3. 1 кг тимуса теленка измельчают и гомогенизируют в 2 л цитратно-солевого раствора. До стадии барофильтрации процесс осуществляют аналогично примеру 1. Далее жидкую фазу концентрируют на мембране размером пор 0,8 мкм и продолжают процесс так же, как и в примере 1.

Пример 4. 1 л крови цыплят гомогенизируют в 2 л цитратно-солевого раствора. Процесс проводят аналогично примеру 1, но время воздействия ультразвуковой обработки составляет 10 мин, при интенсивности 2 Вт/см² и частоте 35 кГц, соотношение кизельгура и реакционной массы составляет 1:25. Далее процесс осуществляют как в примере 1.

Пример 5. 1 кг Селезенки свиньи измельчают и гомогенизируют в 2 л цитратно-солевого раствора. До стадии барофильтрации процесс осуществляют аналогично примеру 1. Далее жидкую фазу концентрируют на мембране с размером пор 0,8 мкм. ДНК-Na осаждают этиловым спиртом в соотношении с концентратом 1:2. Выделенный осадок сушат при 50-60^oC.

Пример 6. Процесс ведут до стадии обработки ультразвуком, как в примере 1. Далее реакционную массу смешивают с кизельгуром (5:1) и отфильтровывают на нуч-фильтре. Из фильтра, без предварительного концентрирования, выделяют ДНК-Na двойным переосаждением этиловым спиртом, с последующим высушиванием осадка порошка при 40^oC.

Контролируемый размер фрагментов и сохранность вторичной структуры макромолекулы ДНК-Na и высокая степень очистки гарантируют высокую биологическую активность и фармакологическую стабильность препарата.

Для определения противовирусной активности получаемых иммунотропных препаратов ДНК-Na, содержащих в составе металл в соответствии с таблицей 1, использовали перевиваемую человеческую линию клеток МТ-4, чувствительную к РНК- и ДНК-содержащим вирусам.

Клетки выращивали в среде RPM 1 1640 в концентрации (0,5 -0,7)•10⁶ клеток в 1 мл 20% фетальной сыворотки. Перед внесением препарата в суспензию клеток их инфицировали концентратом культуральной жидкости клеток-продуцентов ВИЧ - 1 Н9/ШВ/. Множественность инфекции 0,01 ЦТД₅₀ на клетку. Культуры клеток инкубировали при 37^oC, в атмосфере с 5% CO₂ и 98% влажности, в течение 4 - 7 суток, после чего проводили смену питательной среды. На 4-7 день эксперимента определяли цитопатическое действие вируса в культуре клеток. Отмечено увеличение жизнеспособности клеток, предварительно зараженных вирусом и обработанных препаратами в концентрации 600 - 1500 мкг/мл до 70,7 - 85,2%, соответственно (контроль неинфицированных клеток 89,6%, контроль вирусоинфицированных клеток 29,3%, на 4-е сутки после инфицирования).

Результаты оценки противовирусного действия к ВИЧ - 1 получаемых иммунотропных препаратов представлены в таблице 2.

Изучение препаратов, представленных в таблице 2, в отношении цитомегалии человека проводили in vitro на модели человеческих диплоидных клеток М-19 инфицированных цитомегаловирусом. При использовании препаратов различной концентрации, через 48 часов после заражения, титры вируса снижались на 1-2 lg, что подтверждает наличие противовирусного действия препаратов по предлагаемому изобретению.

Противовирусную активность препаратов относительно простого вируса герпеса человека изучали на модели герпетического энцефалита мышей, вызванного этим вирусом. Изучение защитного эффекта от смертельной герпетической инфекции проводили в сравнении с защитным действием индуктора интерферона - редостином, применяемого в настоящее время в качестве противогерпетического препарата. Препараты по предлагаемому изобретению вводили внутрибрюшинно одноразово в дозе 100 мкг/кг за 24 часа до заражения. Животных заражали интерацеребрально в дозе 3 lg LD₅₀. В каждую группу взято 30 мышей. Результаты учитывали по выживаемости (в процентах) животных к 15-му дню и по степени защиты (в процентах), которая определялась по отношению к выжившим животным в контрольной группе. К 15-му дню в контрольной группе погибло 96% мышей, в то время как 70% мышей выжило в группах, получивших препарат. В таблице 3 представлены результаты защитного эффекта препаратов.

Учитывая, что при очень жестких условиях эксперимента - внутримозговое заражение, высокая инфицирующая доза вируса (однократное периферическое введение препарата) обнаруживается защитный эффект от смертельной герпетической инфекции, можно отметить, что препараты дают умеренно выраженный противогерпетический эффект.

Иммунотропные свойства препаратов по предлагаемому изобретению определяли морфометрическим методом. Суть метода состоит в том, что мышам создается иммунодефицитное состояние путем однократного введения гидрокортизона ацетата в дозе 0,2 мг/мышь, внутрибрюшинно. Через 48 часов после введения, в течении 3-х дней проводят одноразовые внутрибрюшинные инъекции препаратов ДНК-Na/Me, в сверхмалых дозах. Экспериментальное исследование иммунологической активности препаратов выполнено на 154 белых мышах и 97 мышах-гибридах CBA обоего пола массой 18-24 г. Дозировка препаратов вводилась по литературным данным [5]. В качестве контроля использовали физиологический раствор. Животных забивали через 18, 36, 60 и 84 час. Проявление иммунотропных свойств характеризуется уменьшением относительной массы тимуса и, как правило, увеличением относительной массы селезенки.

Результаты опыта показывают, что вне зависимости от дозы препарата снижается относительная масса тимуса на 26%. Достоверных различий относительно массы селезенки не обнаружено.

Влияние препарата в малых дозах на тимус можно считать наиболее характерным показателем усиления функциональной активности иммунной системы мышей. Результаты эксперимента для одного из указанных металлокомплексов представлены в таблице 4.

Как следует из таблицы, препарат ДНК-Na-Fe обладает выраженным иммунотропным действием, проявляющимся в его способности снижать относительную массу тимуса у мышей в малых дозах (1•10^-5, 1•10^-7, 1•10^-9 г/мл) при этом доззависимости не обнаружено. Эффект препарата отмечается через 18 часов (20,7%), максимум приходится на 36 часов (28,6%), полная нормализация происходит через 80 часов. Подобные иммунотропные свойства проявляют комплексы ДНК-Na-Sb, ДНК-Na-Co, ДНК-Na-Zn, ДНК-Na-Mn.

По предлагаемому способу получения иммунотропных противовирусных препаратов необходимо выполнение этапов процесса в указанном порядке. Это гарантирует длительный срок годности иммунотропных и противовирусных свойств препаратов, получаемых по предлагаемому способу.

Литература
1. ФРГ (DЕ) заявка N 053724951, кл. А 61 К 31/70, С 07 H 21/04, 1989 г.

2. Патент РФ N 2108797, кл. 6 А 61 К 35/60, С 07 H 21/04, 1998 г.

3. Патент РФ N 2108796, кл. 6 А 61 К 35/60, С 07 H 21/04, 1998 г.

4. Патент РФ N 1833547, кл. А 61 К 37/10, 1991 г.

5. Хавинсон В.Х., Жуков В.В. Пептиды тимуса и механизмы иммуномодуляции. Успехи современной биологии, т.112, вып.4, с. 554-570.

Изобретение относится к медицине, точнее к химико-фармацевтической промышленности. Способ заключается в том, что обезжиренные молоки осетровых рыб, или лососевых рыб, или тимус теленка, или кровь цыплят, или селезенку свиньи гомогенизируют, инкубируют в присутствии детергента, раствора хлорида натрия, обрабатывают ультразвуком, сорбентом и детергентом, фильтруют, концентрируют, выделяют осадок ДНК-Na, высушивают, и порошок растворяют в водном растворе переходного металла для получения 1,5% раствора, гиперхромный эффект которого не должен быть ниже 10%. Технический результат - препарат обеспечивает противовирусную активность к РНК- и ДНК-содержащим вирусам. 3 з.п.ф-лы, 4 табл.

1. Способ получения иммунотропного противовирусного препарата на основе натриевой соли нативной дезоксирибонуклеиновой кислоты ДНК-Na, заключающийся в том, что обезжиренные молоки осетровых рыб, или лососевых рыб, или тимус теленка, или кровь цыплят, или селезенку свиньи гомогенизируют в цитратно-солевом растворе, гомогенат инкубируют в присутствии детергента, затем в процессе непрерывного перемешивания при подогреве в реакционную массу добавляют концентрированный раствор хлорида натрия, реакционную массу охлаждают, обрабатывают ультразвуком, сорбентом и детергентом, фильтруют, концентрируют, из концентрата этиловым спиртом выделяют аморфный белый осадок ДНК-Na, имеющий мол. м. 270 - 500 кД, гиперхромный эффект не ниже 37%, содержание белка менее 1%, осадок ДНК-Na высушивают и порошок растворяют в водном растворе переходного металла для получения 1,5% раствора, гиперхромный эффект которого не должен быть ниже 10%, стерилизуют и стерильно разливают в терапевтических дозах. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что для получения иммунотропного противовирусного препарата используют растворимые в воде соли переходных металлов: Zn, Co, Mn, Fe, Sb. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что в препарате соотношение ДНК-Na к металлу находится в пределах 50-500:1-2. 4. Способ по п.1, отличающийся тем, что иммунотропный препарат проявляет противовирусную активность к РНК- и ДНК-содержащим вирусам.