Способ получения лекарственного препарата на основе натрия дезоксирибонуклеата Российский патент 2021 года по МПК A61K9/08 A61K31/7088 

Изобретение относится к области химико-фармацевтической промышленности и касается способа получения лекарственного средства иммуномодулирующего действия.

Нуклеиновые кислоты - высокомолекулярные биополимеры, состоящие из нуклеотидов, соединенных фосфодиэфирной связью. В настоящее время все больше внимания уделяется созданию лекарственных средств на их основе. Это связано в частности с механизмом действия ДНК, который основан на ее способности накапливаться в костном мозге, селезенке, лимфоузлах и эпителии тонкого кишечника, а также с выявлением важной роли нуклеиновых кислот в регуляции и повышении устойчивости организма к неблагоприятным воздействиям и коррекции иммунодефицитных состояний.

В настоящее время препараты нуклеиновых кислот иммуномодулирующего действия достаточно широко применяются в практической медицине, причем как в виде официальных лекарств, так и в виде БАД к пище. В частности известны препараты - нуклеинат натрия (РНК, полученная из дрожжей), деринат (натриевая соль нативной ДНК, выделенная из молок осетровых рыб), плацентекс-интегро (ДНК из молок форели), БАД к пище «Биостим» (ДНК из молок осетровых рыб) и др. (http://www.dissercat.com/content/immunomodulirayushchaya-aktivnost-nizkomolekulyarnoi-dezoksiribonukleinovoi-kisloty-dnk-iz-m). При выделении из природного сырья в препараты попадают балластные сопутствующие вещества и примеси, что влияет на степень их пирогенности и стабильности. Кроме того сами нуклеиновые кислоты недостаточно устойчивы к воздействию различных физических факторов. Таким образом, исследования в данной области направлены в первую очередь на разработки новых способов получения стабильных и высокоочищенных препаратов.

Известен способ получения стерильного раствора, включающий перевод ДНК в жидкую фазу, обработку раствора ДНК ультразвуком, фильтрацию, стандартизацию по хлористому натрию и стерильную микрофильтрацию, при чем перевод ДНК в жидкую фазу осуществляют путем гомогенизации молок рыб в цитратно-солевом растворе, разделения гомогената, обработки осадка детергентом и концентрированным солевым раствором при 55-60°С, охлаждения реакционной массы, предварительной ультразвуковой обработки, а также осуществляют повторную обработку ультразвуком в условиях, обеспечивающих получение ДНК с мол. м. 2,5×105 - 6,0×105 дальтон и концентрирование (RU 2055837). Раствор содержит высокое количество балластных веществ.

Известен способ производства иммунотропного апирогенного толерантного препарата на основе натриевой соли низкомолекулярной дезоксирибонуклеиновой кислоты, заключающийся в том, что обезжиренные молоки осетровых рыб, лососевых рыб, тимуса теленка, крови цыплят гомогенизируют в цитратно-солевом растворе, гомогенат центрифугируют в отстойной центрифуге при 2500 об/мин, надосадочную жидкость удаляют, субстрат повторно гомогенизируют, далее очищенный гомогенат инкубируют в присутствии 3% детергента, в процессе непрерывного перемешивания при повышенной температуре, в реакционную массу добавляют концентрированный раствор натрия хлорида, реакционную массу охлаждают до температуры ниже комнатной (15°С), обрабатывают ультразвуком, в ваннах с пьезокерамическими излучателями при амплитуде колебаний 4-10 мкм; далее сорбентом, отделяют жидкую фазу, сорбент элюируют пермеатом, элюат, объединенный с жидкой фазой, микрофильтруют, концентрируют, спиртом выделяют осадок натрия дезоксирибонуклеата, центрифугируют, отделяют от жидкой фазы, высушивают в течение 4 ч в асептических условиях при 40°С (RU 2236853 С1, опубл. 2004-09-27).

В качестве ближайшего аналога может быть указан способ получения стерильной фармацевтической субстанции натриевой соли дезоксирибонуклеиновой кислоты из животного сырья, который заключается в том, что животные ткани измельчают, удаляют балластные вещества в виде жира, белка и соединительной ткани путем последовательного отделения в отстойной центрифуге сначала легких фракций с плотностью до 0,8 г/см3 при 2000 об/мин, далее средних фракций с плотностью до 1,0 г/см3 при 3000 об/мин и затем целевой фракции с плотностью более 1,1 г/см3 при 4000 об/мин, целевую фракцию подвергают лизису, обрабатывают раствором хлористого натрия, затем подвергают ультразвуковой обработке, раствор фильтруют под вакуумом, концентрируют мембранной фильтрацией с селективностью мембран от 5000 до 100000 Да, концентрат обрабатывают этиловым спиртом в соотношении 1:1-1:2 по объему для образования осадка натриевой соли дезоксирибонуклеиновой кислоты, высушивают осадок и подвергают его электронно-лучевой стерилизации или стерилизации гамма-излучением. Из субстанции готовят раствор для внутримышечного введения, характеризующийся тем, что отвешивают в асептических условиях расчетного количества порошка для приготовления 1% раствора, растворения в 0,9% стерильном растворе натрия хлорида с последующим стерильным разливом в ампулы по 1 мл (RU 2673802, опубл. 13.02.18). Согласно данному техническому решению получают субстанцию высокого качества согласно таблице 1. Однако недостаточно получить субстанцию, необходимо сохранить все ее свойства уже при получении готовой формы. Используемый для этого способ, раскрытый в описании патента не обеспечивает такую возможность.

Задачей настоящего изобретения является разработка способа получения стабильных жидких форм натриевой соли дезоксирибонуклеиновой кислоты.

Задача решается новым способом производства лекарственного средства, в форме стерильного водного раствора натриевой соли дезоксирибонуклеиновой кислоты, согласно которому готовят предварительно раствор вспомогательного вещества с концентрацией до 0,1 г/л, затем в полученном растворе растворяют навеску действующего вещества с целью создания требуемой концентрации. Данный раствор термолабилен и с целью его стабилизации в раствор добавляют вспомогательное вещество до концентрации 12,0 г/л. Это позволяет нагреть раствор до температуры 35°С без нарушения первичной и вторичной структуры основного вещества. Далее нагретый раствор подвергают микро и стерилизующей фильтрации и следом расфасовывают в необходимую тару, обеспечивающую удобство применения и хранения лекарственного средства.

Технический результат: с помощью предложенного способа можно сократить время растворения действующего вещества, предупредить его деструкцию в растворителе с низкой ионной силой, провести необходимые процедуры фильтрации и стерилизации раствора и создать условия для поддержания стабильности свойств при длительном хранении лекарственного средства.

1. В качестве активной фармацевтической субстанции используется натриевая соль дезоксирибонуклеиновой кислоты, полученная из животного сырья, включающего кровь, тимус, печень, мозг, селезенку, семенники сельскохозяйственных животных или птиц, молоки или печень промысловых рыб.

2. В качестве вспомогательного вещества, служащего стабилизатором ионной среды и консерватором биологических молекул, используются фармацевтически приемлемые водорастворимые соли натрия. Примером таких солей могут быть такие как сульфат, гидрокарбонат, хлорид, фосфат, сукцинат, цитрат, глюконат и др. Предпочтительно согласно изобретению используют цитрат натрия, хлорид натрия или их смесь.

3. В качестве растворителя используется вода высокой степени очистки типа вода для инъекций.

При приготовлении лекарственного средства используется следующий порядок:

a. Растворение вспомогательного вещества до концентрации в интервале 0,01-0,1 г/л с целью создания изотонического раствора.

b. Растворение основного вещества до концентрации в интервале 0,1-25,0 г/л.

c. Доведение концентрации вспомогательного вещества до 5,0-12,0 г/л.

d. Нагрев раствора до 30-35°С.

e. Осветляющая и стерилизующая фильтрация раствора с использованием фильтров с диаметром пор от 1,0 до 0,2 мкм.

Используемая активная фармацевтическая субстанция натриевая соль дезоксирибонукленовой кислоты:

- обладает высокими терапевтическими свойствами, представляет собой иммуномодулятор, репарант, регенерант,

- технологична - не имеет вредных примесей и содержит до 99% основного вещества, обладает хорошей растворимостью в воде,

- безопасна - нетоксична, стерильна и апирогенна.

Вспомогательные вещества и растворитель безопасны для применения, широко распространены, и технологии их известны.

Возможность осуществления изобретения может быть продемонстрирована ниже представленными примерами.

Пример 1. В 10 литрах воды для инъекций растворяют 100 мг натрия лимоннокислого до концентрации 0,01 г/л, далее в раствор добавляют навеску натрия дезоксирибонуклеата в количестве 1 гр. Раствор перемешиваем в течении 10 минут до полного растворения. Далее в раствор добавляют 50 г хлористого натрия, раствор перемешивают, нагревают до температуры 25°С и фильтруют через фильтр 0,65 мкм и 0,2 мкм. Стерильный раствор разливают в стеклянные стерилизованные флаконы объемом 20 мл, 50 мл, 100 мл и герметично укупоривают. Полученное средство используют в качестве орошения пораженных частей кожи - ожоги, обморожения как ранозаживляющее средство.

Пример 2. В 10 литрах воды для инъекций растворяют 1,0 г натрия хлорида до концентрации 0,1 г/л, далее в раствор добавляют навеску натрия дезоксирибонуклеата в количестве 25,0 г. Раствор перемешиваем в течении 5 минут до полного растворения. Далее в раствор добавляют 10 г хлористого натрия, раствор перемешивают, нагревают до температуры 28°С и фильтруют через фильтр 0,65 мкм и 0,2 мкм. Стерильный раствор разливают в стеклянные стерилизованные флаконы объемом 10 мл, 20 мл и герметично укупоривают.

Полученное средство используют как капли в нос или спрей в носоглотку как средство против простуды - иммуномодулятор.

Пример 3. В 10 литрах воды для инъекций растворяют 10,0 г натрия хлорида до концентрации 1,0 г/л, далее в раствор добавляют навеску натрия дезоксирибонуклеата в количестве 150,0 г. Раствор перемешивают в течении 10 минут до полного растворения. Далее в раствор добавляют 100,0 г хлористого натрия, раствор перемешивают, нагревают до температуры 33°С и фильтруют через фильтры 0,8 мкм, 0,65 мкм и 0,2 мкм. Стерильный раствор разливают в стеклянные стерилизованные флаконы объемом 2 мл, 5 мл и герметично укупоривают.

Полученное средство используют как внутривенное или внутримышечное введение при заболевании органов ЖКТ, сердца, мочеполовой системы как репарант, иммуномодулятор.

Пример 4. В 10 литрах воды для инъекций растворяют 10,0 г натрия хлорида до концентрации 1,0 г/л, далее в раствор добавляют навеску натрия дезоксирибонуклеата в количестве 250,0 гр. Раствор перемешивают в течении 20 минут до полного растворения. Далее в раствор добавляют 50,0 г хлористого натрия, раствор перемешивают, нагревают до температуры 35°С и фильтруют через фильтры 0,8 мкм, 0,65 мкм и 0,2 мкм. Стерильный раствор расфасовывают в полимерные капсулы объемом 0,1 мл, 0,2 мл, 0,5 мл.

Полученное средство используют как кишечнорастворимые капсулы при заболеваниях отделов тонкого и толстого кишечника, мочеполовой системы как репарант, регенерант, иммуномодулятор.

Для изучения пирогенности полученные растворы вводили внутривенно из расчета 2,5 мг активного вещества на кг массы тела животного.

Было установлено, что растворы натрия дезоксирибонуклеата, полученные по предложенной методике, не вызывают пирогенных реакций в течение всего срока годности. Максимальное повышение температуры тела каждого кролика не превышало 0,2°С, и сумма максимальных колебаний температуры у трех кроликов (т.е. условный лихорадочный индекс) составляла 0,5°С, что соответствует требованиям, предъявляемым к инъекционным препаратам Государственной и Европейской Фармакопей по пирогенности. Используемый для сравнения препарат по прототипу хотя и является апирогенным некоторое время после приготовления, уже к концу срока годности вызывает повышение температуры и условный лихорадочный индекс составляет 2,0°С.

Денатурация ДНК сопровождается усилением оптического поглощения в УФ-области пуриновых и пиримидиновых оснований. Это явление называют гиперхромным эффектом. Раствор нативной ДНК имеет при 260 нм оптическую плотность на 40% ниже оптической плотности смеси нуклеотидов. Также о разложении нуклеиновых препаратов свидетельствует увеличение вязкости их растворов в процессе хранения.

Анализы всех полученных препаратов в процессе хранения показали: сохранение подлинности; бесцветность; прозрачность; стерильность; нетоксичность; апирогенность; сохранение степени нативности; гиперхромный эффект 46-48%; содержание РНК менее 0,1%; содержание белка -до 0,1%. В то время как раствор, приготовленный из субстанции с сходными характеристиками по прототипу проявлял снижение гиперхромного эффекта до 40%, повышалось содержание примесей и данные по стерильности и апирогенности были снижены.

Изобретение относится к области химико-фармацевтической промышленности, а именно к способу получения препарата натриевой соли дезоксирибонуклеиновой кислоты в форме стерильного водного раствора, отличающемуся тем, что предварительно готовят раствор вспомогательного вещества, представляющего собой натрия хлорид или натрия цитрат, с концентрацией до 0,01-0,1 г/л, затем в полученном растворе растворяют навеску натриевой соли дезоксирибонуклеиновой кислоты до получения концентрации 0,1-25,0 г/л, добавляют натрия хлорид до концентрации вспомогательных веществ 5,0-12,0 г/л, нагревают полученный раствор до температуры 30-35°С с последующей стерилизующей фильтрацией и фасовкой. Изобретение обеспечивает получение лекарственной формы, которая является стерильной, апирогенной и сохраняет нативность действующего вещества. 1 з.п. ф-лы, 4 пр.

1. Способ получения препарата натриевой соли дезоксирибонуклеиновой кислоты в форме стерильного водного раствора, отличающийся тем, что предварительно готовят раствор вспомогательного вещества, представляющего собой натрия хлорид или натрия цитрат, с концентрацией до 0,01-0,1 г/л, затем в полученном растворе растворяют навеску натриевой соли дезоксирибонуклеиновой кислоты до получения концентрации 0,1-25,0 г/л, добавляют натрия хлорид до концентрации вспомогательных веществ 5,0-12,0 г/л, нагревают полученный раствор до температуры 30-35°С с последующей стерилизующей фильтрацией и фасовкой.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что стерилизующую фильтрацию проводят с использованием фильтров с диаметром пор от 1,0 до 0,2 мкм.