СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АЙМАЛИНА Российский патент 2001 года по МПК C12N5/04 A61K35/78 

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу получения фармакологически активного алкалоида аймалина из культуры ткани Rauwolfia serpentina Benth (Раувольфии змеиной).

Хроматографическим методом было установлено, что культура ткани Раувольфии змеиной является продуцентом целого ряда алкалоидов. Выделено свыше 50 алкалоидов, которые относятся к 4 группам: производным иохимбана, σ-иохимбана, индолина и изохинолина. Основное применение в медицине находят алкалоиды первых трех групп. К первой группе принадлежат:
Резерпин - применяется в терапии гипертонической болезни и психических расстройств.

Иохимбин - сильное местно-анестезирующее вещество, расширяет сосуды кожи и слизистых оболочек, антиметаболит серотонина. Широко применяется для лечения импотенции у мужчин.

Коринантин, иохимбин - обладают мощной адренолитической и симпатолитической активностью, вызывают стойкое снижение артериального давления.

Дезерпидин, ресцинамин - выраженная гипотензивная активность.

Ко второй группе относятся:
σ-иохимбин (аймалицин) - в составе таблеток "Раувазон" применяется для лечения болезни Бюргера, артериосклерозе, грудной жабе.

Серпентин и альстонин - сокращают мускулатуру матки.

Центральное место в ряду алкалоидов Раувольфии змеиной занимает аймалин, относящийся к третьей группе - индолиновым алкалоидам (Туркевич Н.М. Химия новых гипотенсивных средств. Киев. Медгиз УССР, 1961 [1]).

Характерной особенностью аймалина являются антиаритмические свойства. Он понижает возбудимость миокарда, удлиняет рефракторный период, тормозит атриовентрикулярную и внутрижелудочковую проводимость, несколько угнетает автоматизм синусного узла, подавляет импульсообразование в эктопических очагах автоматизма. Относится к антиаритмическим препаратам 1 группы. Аймалин способен купировать приступы мерцательной аритмии и пароксизмальной тахикардии. Эффективен также при нарушениях ритма, связанных с интоксикацией препаратами наперстянки (Машковский М.Д. Лекарственные средства. М.: Медицина, 1993, ч. 1, с.478 [2]).

Первоначальным источником получения алкалоида аймалина является кустарниковое тропическое растение семейства кутровых Раувольфия змеиная, произрастающая эндемично в Индии, Бирме и Африке (Муравьева Д.А. Фармакогнозия. - М.: Медицина, 1981 [3]. В связи с ограниченностью природных ресурсов со всей остротой встает проблема сырья. Выращивание этой культуры в теплицах и на плантациях сдерживается климатическими условиями и дороговизной получаемых продуктов из-за низкого содержания алкалоидов в культивируемых растениях. Таким образом, становится очевидной необходимость замены плантационного, а тем более дикорастущего сырья на гарантированно получаемую промышленным способом биомассу культивируемых клеток и тканей, содержащую необходимые алкалоиды в достаточном количестве.

Исходная культура ткани Раувольфии змеиной была получена в 1964 году Р. Г. Бутенко (Бутенко Р.Г. Культура изолированных тканей и физиология морфогенеза растений. М.: Наука, 1964, с.272 [4]). Однако эта культура характеризовалась низким содержанием индолиновых алкалоидов, в том числе аймалина.

В результате направленного мутагенеза и оптимизации состава питательной среды с учетом трофики корня растения был получен новый штамм К-27 (Каталог. Всесоюзная коллекция клеточных культур. Л.: Наука, 1991 [5]), превосходящий интактное растение по уровню накопления алкалоидов в 2 раза. Этот штамм рассматривается как основной источник промышленного получения индолиновых алкалоидов, в том числе и аймалина.

В таблице 1 приведено содержание алкалоидов в некоторых штаммах культуры ткани Раувольфии змеиной и интактном растении.

Штамм К-27 представляет собой плотную бесформенную массу светло-желтого цвета, состоящую из округло-овальных тонкостенных клеток. При цитологическом анализе обнаруживаются единичные элементы первичной дифференциации - примитивные проводящие пучки, трахеиды, секреторные образования. При длительном культивировании, а также при неблагоприятных условиях выращивания на ткани появляются некротические участки.

Физиологические и ростовые характеристики штамма представлены в таблице 2.

Культивирование штамма К-27 осуществляли на специальной питательной среде, состав которой разработан в лаборатории культур клеток и растений Ленинградского химико-фармацевтического института (Воллосович А.Г., Николаева Л.А., Пучинина Т.Н., Позднякова Н.Н. Питательная среда для выращивания культуры ткани Раувольфии змеиной - продуцента алкалоидов. А.с. N 679625, СССР, кл.С 12 К 9/00, заявл. 3.05.77, опубл. в БИ 15.08.79, N 30 [6]).

В питательную среду для выращивания культуры ткани Раувольфии змеиной входят:
А. Макросоли, г/л
Нитрат калия - 0/4
Нитрат аммония - 2,5
Сульфат магния - 1,3
Сульфат аммония однозамещ. - 0,3
Б.Микросоли, мг/л
Борная кислота - 12,0
Сульфат марганца - 22,0
Сульфат цинка - 8,6
Молибдат натрия - 0,25
Сульфат меди - 0,026
Хлорид кобальта - 28,0
Сульфат железа - 28,0
Трилон Б - 38,0
Калий йодистый - 0,83
В. Другие компоненты
Сахароза - 100 г/л
Тиамин бромид - 5 мг/л
Агар-агар - 7,6 г/л
Стерилизацию объектов осуществляли при температуре 110^oC и избыточном давлении 0,5 атм в течение 30 мин.

В качестве посевного материала использовались кусочки 30-суточного каллуса культуры ткани Раувольфии змеиной массой 1-2 г.

Выращивание каллуса проводили в темноте при температуре 26^oC в банках на 250 мл 60-90 суток.

Известно, что для увеличения выхода биомассы и индолиновых алкалоидов использовались различные химические добавки, в том числе фитогормоны. Добавление в среду для выращивания культуры ткани таких фитогормонов, как ауксины, гиббереллины и цитокинины, с целью повышения ее продуктивности не дает желаемого эффекта. Эти фитогормоны практически не влияют на прирост биомассы, но резко ингибируют накопление индолиновых алкалоидов (Березнеговская Л.Н. Метаболизм вторичных азотистых соединений в изолированной культуре ткани растений. Томск, Изд. Томского ун-та, 1978 [7]; Бутенко Р.Г. Культура изолированных тканей и физиология морфогенеза растений. М.: Наука, 1964, с. 272 [4]; Воллосович А.Г. Культура изолированных тканей и клеток растений. М. : Наука, 1970, с. 234-235 [8]; Vollosovich F. Highlights Mod. Biochemie: Proc. l4. th. int. Congr. Biochem. Prague., 10-15 July 1988. Vol. 2, Utrecht-tokyo 1989 [9]). В то же время показано (Чечеткин И.Р., Неуструева С. Н. , Сиянова Н.С., Винтер В.Г. Стимуляция образования алкалоидов в культуре ткани Раувольфии змеиной под действием экстремальных факторов. Всероссийское совещание. Лесохимия и органический синтез. Тезисы докладов. Сыктывкар, 1998 [10] ), что при внесении в питательную среду 113,5 мкМ (3•10^-2 г/л) абсцизовой кислоты, обладающей свойствами дефолианта и ингибитора роста многих культур (Мельников Н. Н. Пестициды. М.:Химия, 1987, с.114 [11]) приводит к увеличению синтеза аймалина на 80% по сравнению с контролем. Однако недостатком абсцизовой кислоты является ее дороговизна, поскольку она получается фотохимическим окислением Витамина А (Муромцева Г.С. и др. Гормоны растений гиббериллины. М.: Наука, 1973, 270 с. [12]; Муромцева Г.С. и др. Регуляторы роста растений. М.: Колос, 1979, 246 с. [13]).

Заслуживают внимания данные, приведенные в источнике [14] (Жегалова И.В. , Сиянова Н.С., Неуструева С.Н., Винтер В.Г. Стимуляция рибонуклеазой Bacillus Intermedius роста и накопления индолиновых алкалоидов в каллусной культуре Rauwolfia serpentina Benth. Растительные ресурсы, вып.2, 1995). Стимуляция и накопление в ней индолиновых алкалоидов (аймалина) достигалось за счет добавления в питательную среду рибонуклеазы Bacillus Intermedius (биназы) в количестве 1•10^-4 г/л. Фермент не является регулятором роста, однако биологический эффект связан не с каталитической активностью, а с ассоциативными свойствами фермента с мембранными структурами нуклеотидной природы. Эффект стимуляции прироста биомассы составляет 61%, а накопление алкалоидов 82-121%. Однако при длительном пассировании прирост биомассы падал с 22-го пассажа до 16%, а к 27-му пассажу - ниже контрольного, а эффект стимуляции образования алкалоидов составлял 103 и 69% соответственно. Однако необходимо отметить, что дороговизна выделения и очистки фермента увеличивают стоимость получаемого продукта.

Задачей предлагаемого изобретения является разработка способа получения алкалоида аймалина при культивировании ткани Rauwolfia serpentina Benth. с целью увеличения продуктивности и сужения спектра в сторону интересующих нас алкалоидов, т.е. аймалина, удешевления получаемого продукта и расширения ассортимента способов получения аймалина.

Поставленная цель достигается тем, что в питательную среду для выращивания ткани Раувольфии змеиной добавляют Мелафен в концентрации 1•10^-3-1•10^-6 г/л. Мелафен представляет собой меламиновую соль бис(оксиметил)фосфиновой кислоты формулы

Мелафен получается в одну стадию взаимодействием меламина с бис(оксиметил)фосфиновой кислотой в водной или водно-спиртовых средах при нагревании до 50-100^oC.

Синтез препарата осуществлен в Институте органической и физической химии им. А. Е. Арбузова Казанского Научного центра (КНЦ) и он совместно с Институтом биохимии и биофизики КНЦ предложен в качестве высокоэффективного синтетического регулятора роста и развития растений, действующего в чрезвычайно низких концентрациях (1•10^-7 - 1•10^-8%), сравнимого или превосходящего по эффекту природные фитогормоны. Препарат малотоксичен - LD₅₀ 2000 мг/кг на мышах. Мелафен, как и цитокинины, вероятнее всего участвует в запуске и регуляции физиолого-генетических программ и, действуя через ряд посредников, приводит к реализации биосинтетического потенциала растительной клетки в построении белковых молекул.

Для лучшего понимания изобретения приводятся конкретные примеры влияния Мелафена на продуктивность культуры ткани Раувольфии змеиной, складывающегося из уровня накопления алкалоидов и прироста биомассы, а также качественного состава синтезируемых алкалоидов.

Ниже приведена общая схема качественной и количественной оценки содержания алкалоидов культуры ткани Раувольфии змеиной для стандартизации условий проведения анализа биомассы, позволяющая оценить образец одновременно по нескольким критериям (фиг.1).

Пример 1. На первом этапе работ была подобрана оптимальная стимулирующая концентрация Мелафена. Состав питательной среды, условия ее стерилизации, а также посадки и культивирования ткани как в контроле, так и в опытных вариантах были одинаковыми, за исключением того, что в опытных вариантах в питательную среду добавляли Мелафен из расчета концентрации последнего 1•10^-2- 1•10^-9 г/л.

Состав питательной среды [6]:
А. Макросоли, г/л
Нитрат калия - 0,4
Нитрат аммония - 2,5
Сульфат магния - 1,3
Сульфат аммония однозамещ. - 0,3
Б.Микросоли, мг/л
Борная кислота - 12,0
Сульфат марганца - 22,0
Сульфат цинка - 8,6
Молибдат натрия - 0,25
Сульфат меди - 0,026
Хлорид кобальта - 0,1
Сульфат железа - 28,0
Трилон Б - 38,0
Калий йодистый - 0,83
В. Другие компоненты
Сахароза - 100 г/л
Тиамин бромид - 5 мг/л
Агар-агар - 7,0 г/л
Мелафен добавляли в питательную среду непосредственно перед автоклавированием. Стерилизацию осуществляли при температуре 110^oC и избыточном давлении 0,5 атм в течение 30 мин.

В качестве посевного материала использовались кусочки 30-суточного каллуса Раувольфии змеиной штамм К-27 массой 1-2 г. Выращивание каллуса как контрольного, так и опытного вариантов проводили при температуре 26^oC в банках на 250 мл в темноте. Для получения статистически достоверных результатов каждый вариант опыта пассировался в баночках в количестве 240 штук.

Анализ динамики накопления индолиновых алкалоидов в культуре ткани Раувольфии змеиной под действием различных концентраций Мелафена показывает эффективность препарата в пределах концентраций 1•10^-3 - 1•10^-6 г/л. При этом можно отметить наличие 2-х пиков биосинтетической активности, приходящиеся на 55-е (концентрация Мелафена 1•10^-3 г/л) и 80-е сутки (концентрация Мелафена 1•10^-4 г/л) культивирования. Полученные результаты приведены в таблице 3 и на фиг. 2а и 2б.

Из представленных данных видно, что в опытных вариантах наблюдается явный дозозависимый эффект накопления алкалоидов от концентрации Мелафена в питательной среде.

Таким образом было выявлено, что оптимальными концентрациями Мелафена, приводящими к увеличению выхода алкалоидов, являются 1•10^-3 - 1•10^-4 г/л. В дальнейших исследованиях использовались эти две концентрации Мелафена. Последующее пассирование на среде с оптимальными дозами Мелафена показало, что культура ткани Раувольфии змеиной отвечает резким увеличением биосинтеза алкалоидов, что особенно хорошо видно на концентрации 1•10^-4 г/л на 80-е сутки, где биосинтез алкалоидов увеличивается почти в 2 раза (фиг.3).

Как показало изучение динамики накопления белка в биомассе (фиг.8) в контрольном варианте, максимальное количество белка накапливается в ранние периоды роста - на 17-е сутки, после чего наступает резкое падение его уровня
Для опытных вариантов характерно увеличение биосинтеза белка, причем для концентрации Мелафена в питательной среде 1•10^-3 г/л даже к 60 суткам культивирования содержание белка остается на высоком уровне, хотя, как видно из фиг. 8, как в контрольных, так и в опытных вариантах, начиная с 35 суток, в культуре ткани Раувольфии змеиной возрастает и активность протеолитических ферментов (Комов В.П., Самохин Ю.А., Стрелкова М.А. Механизмыы протеолиза в каллусной культуре клеток Rauwolfia serpentina Benth. - Культура изолированных клеток и биотехнология. 1986, с.35 [15]), приводящих к увеличению содержания свободных аминокислот (Ловкова М.Я. Биогенез алкалоидов группы никотина. -Изв. АН СССР. Сер. Биол., 1974, N 6, с. 821-834 [16]), являющихся строительным материалом для дальнейшего биосинтеза алкалоидов.

Качественный анализ спектра синтезируемых алкалоидов, проведенный методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) на 55-е и 80-е сутки культивирования, показал значительное увеличение индолиновых алкалоидов и резерпина, а также активный биосинтез алкалоидов группы иохимбина (фиг.4а, б). Кроме того, наряду с увеличением синтеза алкалоидов индолиновой группы, происходит сужение общего спектра синтезируемых алкалоидов (фиг. 5). Для сравнения приведен спектр синтезируемых алкалоидов в отсутствии Мелафена (фиг.6).

Исследование ростовых характеристик ткани показало (фиг. 7а, б), что нарастание сырой биомассы при концентрации Мелафена 1•10^-3 и 1•10^-4 г/л до 55 суток идет более интенсивно, чем в контроле, затем для концентрации 1•10^-3 г/л сравнивается с контролем, а для концентрации 1•10^-4 г/л - продолжает увеличиваться, достигая к 75 суткам максимального значения.

Однако при анализе выхода сухой биомассы было установлено, что стимуляция проявляется лишь на ранних сроках культивирования (35-50 суток), затем начинается спад и для концентрации 1•10^-4 г/л на 75-е сутки не отличается от контроля.

С целью усиления накопления алкалоидов, в том числе аймалина, в культуре ткани Раувольфии змеиной в присутствии Мелафена нами был использован S-аденозилметионин в концентрации 7 - 15 мг/л. Оптимальной концентрацией S-аденозилметионина оказалась 10 мг/л. Для лучшего понимания влияния S-аденозилметионина на биосинтез аймалина как в присутствии Мелафена, так и в его отсутствии приводится пример проведения опытов.

Пример 2. Условия подготовки и проведения пассирования те же, что и в примере 1. Рабочая концентрация Мелафена 1•10^-4 г/л. Дополнительно в питательную среду вводился S-аденозилметионин (SAM) в концентрации 10 мг/л.

Результаты сравнительного определения содержания суммы индолиновых алкалоидов приведены в таблице 4.

Как видно из таблицы 4, раздельное введение в питательную среду как Мелафена, так и S-аденозилметионина усиливает синтез алкалоидов и вызывает прирост биомассы как по сырому, так и по сухому весу. Совместное же их добавление приводит к увеличению выхода индолиновых алкалоидов более чем в 2 раза по сравнению с контролем. При этом увеличивается и прирост биомассы, хотя и не так интенсивно, как при применении только S-аденозилметионина.

Качественный анализ спектра синтезируемых алкалоидов также показывает увеличение содержания алкалоидов группы индолина (фиг.9).

До настоящего времени влияние Мелафена изучалось только на фотосинтезирующих объектах (хлорелла, высшие растения), для которых было показано значительное усиление в основном фотозависимых реакций. На примере культуры ткани Раувольфии змеиной нами установлено, что препарат проявляет высокую биологическую активность и на растительной культуре ткани, культивируемой в темноте. В связи с этим интересно было проследить за изменением биосинтетической активности Мелафена в культуре ткани под действием света.

Пример 3. Влияние света на культуру ткани Раувольфии змеиной и биосинтетическую активность Мелафена.

Исходные условия те же, что и в примере 1. Рабочая концентрация Мелафена 1•10^-4 г/л. Контрольная культура выращивалась в темноте и на свету в отсутствии Мелафена, опытная - также в темноте и на свету в присутствии Мелафена.

Выращивание культуры ткани Раувольфии змеиной на свету на среде, не содержащей Мелафен, резко ингибировало рост ткани (фиг. 10) - до 40 суток ткань практически не растет, при этом оводняется, приобретает коричневый цвет, а сильно потемневшие участки ткани некротизируют. Начиная с 40-х суток, происходит увеличение прироста биомассы, не достигая, однако, значений, характерных для культивирования этой ткани в темноте. Кроме того, приблизительно 1/3 посевного материала гибнет, так и не перейдя к активному росту.

Для опытных вариантов с Мелафеном наблюдается на ранних сроках культивирования более активное нарастание биомассы. Ткань остается светло-соломенного цвета с белым налетом молодых клеток, некрозы не наблюдаются. При более длительном культивировании прирост биомассы в этих вариантах также остается на высоком уровне, хотя и ниже, чем в контроле (темнота).

Анализ динамики накопления суммы индолиновых алкалоидов показал, что во всех вариантах опыта до 35 суток культивирования идет резкое уменьшение содержания алкалоидов в ткани (фиг. 11).

Первый пик биосинтеза алкалоидов приходится на 40-45 сутки. В этот период наиболее активные биосинтетические процессы отмечены для ткани, культивируемой в темноте на питательной среде, содержащей Мелафен. Однако максимальное накопление алкалоидов, характерное для второго пика биосинтеза, обнаружено в тканях опытных вариантов, выращиваемых на свету на питательной среде, содержащей Мелафен. В этом варианте содержание алкалоидов было увеличено по сравнению с контролем почти в 2 раза.

Для вариантов, выращиваемых на свету без добавления в питательную среду Мелафена, не наблюдается четкого второго пика биосинтеза, характерного для всех других вариантов, а начиная с 50-х суток, синтез алкалоидов практически прекращается.

Таким образом, полученные экспериментальные данные показывают, что Мелафен в концентрациях 1•10^-3- 1•10^-6 г/л оказывает стимулирующее действие на продуктивность культуры ткани Раувольфии змеиной, в особенности на биосинтез индолиновых алкалоидов, при этом наиболее оптимальными концентрациями Мелафена являются 1•10^-3 - 1•10^-4 г/л. Под действием Мелафена происходит сужение спектра синтезируемых алкалоидов. Совместное применение Мелафена и S-аденозилметионина приводит к резкому увеличению биосинтеза аймалина. Интересной особенностью Мелафена является то, что он позволяет вести процесс культивирования ткани Раувольфии змеиной на свету.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к новому способу получения аймалина при культивировании ткани Раувольфии змеиной с целью повышения продуктивности, сужения спектра продуктов биосинтеза, удешевления производства и расширения способов получения аймалина. Культивирование ткани Раувольфии змеиной ведут в питательной среде в присутствии меламиновой соли бис(оксиметил)фосфиновой кислоты (Мелафена) в концентрациях 1 • 10^-3 - 1 • 10^-6 г/л. Присутствие меламиновой соли бис(оксиметил)фосфиновой кислоты (Мелафена) в питательной среде позволяет вести процесс как в темноте, так и на свету. Показано, что культивирование ткани Раувольфии змеиной в питательной среде в присутствии S-аденозилметионина в концентрациях 7 - 15 мг/л приводит также к увеличению выхода аймалина. Совместное присутствие в питательной среде меламиновой соли бис(оксиметил)фосфиновой кислоты (Мелафена) и S-аденозилметионина приводит к увеличению выхода целевого продукта более чем в 2 раза. Использование предлагаемого способа повышает продуктивность, сужает спектр продуктов биосинтеза с одновременным удешевлением производства. 2 з.п. ф-лы, 4 табл., 12 ил.

1. Способ получения аймалина, предусматривающий культивирование культуры ткани Раувольфии змеиной в питательной среде с последующим выделением целевого продукта, отличающийся тем, что процесс культивирования ведут в присутствии меламиновой соли бис(оксиметил)фосфиновой кислоты (Мелафина) и/или в присутствии S-аденозилметионина. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что меламиновую соль бис(оксиметил)фосфиновой кислоты (Мелафен) используют в концентрации 1 • 10^-3 - 1 • 10^-6 г/л. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что S-аденозилметионин используют в концентрации 7 - 15 мг/л.