ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫРАЩИВАНИЯ КУЛЬТУРЫ ТКАНИ РАУВОЛЬФИИ ЗМЕИНОЙ - ПРОДУЦЕНТА АЛКАЛОИДОВ Российский патент 1997 года по МПК A01H4/00 C12N5/00 C12N5/02 

Изобретение относится к биотехнологии растительных клеток и касается питательной среды для выращивания культуры ткани с целью получения лекарственных препаратов.

Известна питательная среда [1] для выращивания культуры ткани раувольфии продуцента алкалоидов, имеющая следующий состав, в мг/л: KNO₃-1500-2000; NH₄NO₃-1300-1800; MgSO₄7H₂O-300-400; CaCl₂-320-450; KH₂PO₄-120-200; NaEDTA-90-100; FeSO₄7H₂O-25-35; H₃BO₃-5,5-8,0; KJ-0,5-0,9; MnSO₄5H₂O-20,0-25,0;
ZnSO₄4H₂O-10,0-17,0; Na₂MoO₄2H₂O-0,2-0,3; CuSO₄5H₂O-0,01-0,03; CoCl₂6H₂O-0,01-0,03; инозит - 60-80; тиамин-1,0-1,5; сахароза-50000; агар-агар-65000.

Среда не обеспечивает достаточно высокого выхода биомассы и содержания в ней алкалоидов.

Наиболее близкой к заявленной среде является питательная среда [2] для выращивания культуры ткани раувольфии продуцента алкалоидов, имеющая следующий состав, в мг/л: Ca(NO₃)₂4H₂O-800-1050; MgSO₄7H₂O-1100-1300; KNO₃-200-400; NH₄NO₃-2400-2500; (NH₄)₂SO₄-200-500; NH₄Cl-100-150; (NH₄)₂ HPO₄-250-300; NH₄H₂PO₄ -150-200; FeSO₄7H₂O-27-34; NaEDTA-37-100; H₃BO₃ 9,3-12,4; MnSO₄5H₂O-22-23; ZnSO₄4H₂O 1,7-8,6; Na₂MoO₄2H₂O 0,2-0,3; CuSO₄5H₂O-0,015-0,025; CoCl₂6H₂O 0,075-0,125; KJ 0,83-0,90; инозит 100-80; тиамин 1-1,5; агар-агар 65000; сахароза 90-100000. Соотношение и количество ионов, обеспечивающих рост культуры на этой среде составляет, в мг/л: K⁺⁺-78-156; Ca⁺⁺-130-170; PO₄ ^----300-382; Mg⁺⁺-110-130; SO₄ ^---570-870; NO₃ ^--2270-2681; NH⁺-686-833.

Среда не обеспечивает достаточно высокого выхода биомассы и содержания в ней алкалоидов.

Задача изобретения состоит в увеличении выхода биомассы, содержания в ней алкалоидов и ускорения их биосинтеза.

Задача достигается тем, что культивирование ткани производится на среде следующего состава (мг/л): KH₂PO₄-300-500; K₂HPO₄3H₂O-300-500; (NH₄)₂SO₄-800-1000; NH₄NO₃ 2500-3800; MgSO₄7H₂O 1000-1500; Ca(NO₃)₂4H₂O - 1000-2000; NH₄Cl 100-200; FeSO₄4H₂O 60-80; NaEDTA - 100-200; H₃BO₃ 10-12; KJ 700-1000; CoCl₂6H₂O - 800-1000; NaMoO₄2H₂O 0,2-0,3; MnSO₄5H₂O - 0,22-0,23; CuSO₄5H₂O 0,015-0,025; ZnSO₄4H₂O - 1,7-8,6; тиамин 1-1,5; агар-агар 65000; сахароза 120000-130000.

Отличительным признаком предложенной среды является новое содержание ионов, а именно: K⁺ -160-250; Ca⁺⁺-180-200; PO₄ ^----370-480; Mg⁺⁺ -110-130; SO₄ ^---1000-1250; NO₃ ^--2870-3450; NH₄ ⁺ 1150-1320 и повышенное содержание сахарозы в среде 120000-130000.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Готовят питательную среду следующего состава (мг/л): Ca(NO₃)₂4H₂O 900; MgSO₄7H₂O 1100; NH₄NO₃-3000; (NH₄)₂SO₄- 800; KH₂PO₄- 350; K₂HPO₄3H₂O -240; FeSO₄7H₂O 80; NaEDTA 100; H₃ BO₃- 10,5; MnSO₄5H₂O 16; ZnSO₄4H₂O 10; Na₂MoO₄2H₂O 0,25; CuSO₄5H₂O 0,02; CoCl₂6H₂ O 0,125; KJ 0,83; тиамин 1,0; агар-агар 65000; сахароза 120000. Соотношение ионов и их количество, обеспечивающие рост культуры на этой среде, составляет, в мг/л: K⁺ 160; Ca⁺⁺-180; PO₄ ^----370; Mg⁺⁺-110; SO₄ ^---1000; NO₃ ^--2870; NH₄ ⁺- 1150. Высаживают биомассу в возрасте 28-32 суток в культуральные емкости на 250 мл, содержащие 125 мл питательной среды. Биомассу высушивают на 60-е сутки. Выход воздушно-сухой биомассы на среде-прототипе составил, в г/л: 40,0±2,1, а на новой среде - 47,0±2.0; выход алкалоидов группы индолина в на среде-прототипе 1,8±0,12, на новой среде 2,0±0,11. Выход алкалоидов группы индолина в мг на л среды составил: на среде-прототипе-720; на новой среде-1220.

Пример 2. Готовят питательную среду следующего состава (мг/л): Ca(NO₃)₂4H₂O 1200; MgSO₄7H₂O 1200; NH₄NO₃- 3400;(NH₄)₂SO₄- 900; KH₂PO₄- 375; K₂HPO₄3H₂O 280; FeSO₄7H₂O 80; NaEDTA 100; H₃BO₃ 10,5; MnSO₄5H₂O 16; ZnSO₄4H₂O 10; Na₂MoO₄2H₂O 0,25; CuSO₄5H₂O 0,02; CoCl₂6H₂O 0,125; KJ 0,83; тиамин 1,0; агар-агар 65000; сахароза 125000. Соотношение ионов и их количество, обеспечивающее рост культуры на этой среде, составляет, в мг/л: K⁺-200; Ca⁺⁺-210; PO₄ ^--- 430; Mg⁺⁺-120; SO₄ ^---1120; NO₃ ^- 3150; NH₄ ⁺-1280. Высаживают биомассу в возрасте 28-32 суток в культуральные емкости на 250 мл, содержащие 125 мл питательной среды. Биомассу высушивают на 60 сутки. Выход воздушно-сухой биомассы на среде-прототипе составил в мг/л 40,0±2,1, на новой среде - 55,1±2,0. Содержание алкалоидов группы индолина при выращивании на среде-прототипе составило в 1,8±0,12, а на новой среде 3,2±0,18. Выход алкалоидов группы индолина в мг/л среды составил на среде-прототипе 720, а на новой среде 1532.

Пример 3. Готовят питательную среду следующего состава, в мг/л: Ca(NO₃)₂4H₂O 1500; MgSO₄7H₂O 1300; NH₄NO₃-3800; (NH₄)₂SO₄ 1000; KH₂PO₄
400; K₂HPO₄3H₂O -320; FeSO₄7H₂O 80; NaEDTA 100; H₃BO₃ 10,5; MnSO₄5H₂O 16; ZnSO₄4H₂ O 10; Na₂MoO₄2H₂O 0,25; CuSO₄5H₂O 0,02; CoCl₂6H₂O 0,125; KJ 0,83; тиамин 1,0; агар-агар 65000; сахароза 130000. Состав ионов и их количество, обеспечивающее рост культуры на этой среде, составляет, в мг/л: K⁺-250; Ca⁺⁺-240; PO₄ ^----480; Mg⁺⁺-130; SO₄ ^---1250; NO₃ ^--3450; NH₄ ⁺-1320. Биомассу высаживают в возрасте 28-32 суток в культуральные емкости на 250 мл, содержащие 125 мл питательной среды. Биомассу высушивают на 60 сутки. Выход воздушно-сухой биомассы в г/л среды на среде-прототипе составил 40,0±2,1, а на новой среде 55,1±2,0. Выход алкалоидов группы индолина в на среде-прототипе составил 1,8±0,12, а на новой среде 55,1±2,0. Выход алкалоидов группы индолина в мг/л на среде прототипе составил 720, а на новой среде -1320.

Пример 4. Готовят питательную среду следующего состава, в мг/л: Ca(NO₃)₂4H₂O 1200; MgSO₄7H₂O 1300; NH₄NO₃- 3400; (NH₄₂SO₄- 1000; KH₂PO₄- 370; K₂HPO₄3H₂O 320; FeSO₄7H₂O 80; NaEDTA 100; H₃BO₃- 10,5; MnSO₄5H₂O 16; ZnSO₄4H₂O 10; Na₂MoO₄2H₂O 0,25; CuSO₄5H₂O 0,02; CoCl₂6H₂O 0,125; KJ 0,83; тиамин 1,0; агар-агар 65000; сахароза 125000. Соотношение ионов и их количество, обеспечивающее рост культуры на этой среде, составляет, в мг/л: K⁺-200; Ca⁺⁺-200; PO₄ ^----430; Mg⁺⁺-130; SO₄ ^---11220; NO₃ ^- -1280. Высаживают биомассу в возрасте 28-32 суток в культуральные емкости на 250 мл, содержащие 125 мл среды. Снимают динамику роста и накопление алкалоидов группы индолина на новой среде в сравнении со средой прототипом. Данные приведены в таблице N 1. Как видно из данных таблицы, оптимальный выход алкалоидов группы индолина и прирост биомассы на новой среде отмечался на 60-65 сутки роста, а на среде прототипе не ранее 70 суток.

Таким образом, новая среда позволяет увеличить выход биомассы на 20% содержание в ней алкалоидов группы индолина на 59% по отношению к сухой биомассе и на 85% из расчета в мг/л среды. Период роста на новой среде сокращается на 10 суток по сравнению со средой-прототипом.

Источники информации
1. Murachige T. Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. plant, 1962 Vol.15, N 3, P.473-475.

2. Авторское свидетельство СССР N 1167895, М. кл C 12 N 5/02. 1985.

Использование: биотехнология, в частности при культивировании растительной ткани культуры раувольфии змеиной - продуцента алкалоидов. Питательная среда содержит микро- и макроэлементы, витамины и другие добавки при указанном соотношении компонентов. 1 табл.

Питательная среда для выращивания культуры ткани раувольфии змеиной - продуцента алкалоидов, содержащая Ca(NO₃)₂ • 4H₂O, MgSO₄ • 7H₂O, NH₄NO₃,
(NH₄)₂SO₄, FeSO₄ • 7H₂O, Na ЭДТА, H₃BO₃, MnSO₄ • 5H₂O, ZnSO₄ • 4H₂O, Na₂MoO₄ • 2H₂O, CuSO₄ • 5H₂O, CoCl₂ • 6H₂O, KJ, тиамин, агар-агар, сахарозу и воду, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит KH₂PO₄ и K₂HPO₄ • 3H₂O при следующем соотношении компонентов, мг/л:
Ca(NO₃)₂ • 4H₂O 900 1500
MgSO₄ • 7H₂O 1100 1300
NH₄NO₃ 3000 3800
(NH₄)₂SO₄ 800 1000
FeSO₄ • 7H₂O 80
Na ЭДТА 100
H₃BO₃ 10,5
MnSO₄ • 5H₂O 16,5
ZnSO₄ • 4H₂O 10,0
Na₂MoO₄ • 2H₂O 0,25
CuSO₄ • 5H₂O 0,02
CoCl₂ • 6H₂O 0,125
KJ 0,83
KH₂PO₄ 370 400
K₂HPO₄ • 3H₂O 240 320
Тиамин 1,0
Агар-агар 6500
Сахароза 120000 130000
Вода Остальноел