СОСТАВ ДЛЯ СТАБИЛИЗАЦИИ ЛИПИДОВ Российский патент 2002 года по МПК C11B5/00 

Предложен состав для защиты от окисления и окислительной деструкции природных биологически активных липидов, в том числе липидов с омега-3 кислотами, пищевых масел, пищевых добавок (нутрицевтиков), технических жиров, эфиров полиненасыщенных жирных кислот, липидсодержащих лекарственных препаратов и лечебно-косметических средств. Области применения изобретения - пищевая, косметическая и химико-фармацевтическая промышленность.

С целью предотвращения процессов окисления природных масел и жиров, липидов, полученных методами биотехнологии, синтетических полиненасыщенных жирных кислот, а также с целью стабилизации и увеличения сроков хранения косметических и лекарственных препаратов, включающих указанные легкоокисляемые соединения, широко используют антиоксиданты (ингибиторы свободно-радикального окисления). В качестве антиоксидантов, как правило, применяются соединения фенольной природы, способные эффективно взаимодействовать со свободными радикалами, ведущими окисление. Введение антиоксиданта в состав препарата позволяет значительно затормозить процесс окисления и придает ему ряд положительных качеств, обусловленных биологическим действием ингибитора. Антиоксиданты выступают в роли неспецифического корректора многих патологий, протекающих на фоне интенсификации свободно-радикального окисления липидов (ПОЛ) биологических мембран. В связи с этим ингибиторы ПОЛ нашли применение в медицине и широко используются в комплексе другими лекарственными препаратами /1, 5, 7/. При этом наибольший спрос имеют антиоксиданты природного происхождения как потенциально безопасные соединения, не оказывающие негативного воздействия на организм даже при длительном применения /1, 5, 6, 7/. Во всем мире ведется скрининг (поиск и отбор) наиболее эффективных биоантиоксидантов. Вместе с тем развивается новое направление - создание синергических композиций, включающих биоантиоксиданты и вещества, самостоятельно не ингибирующие или слабо ингибирующие процесс окисления, но способные значительно усиливать действие основного протектора. Использование синергических смесей позволяет более эффективно тормозить окисление, используя при этом меньшие количества антиоксидантов.

В связи с этим поиск высокоэффективных синергических смесей актуален и имеет немаловажное значение для пищевой, косметической и фармацевтической промышленности.

При применении биоантиоксидантов немаловажным является подбор доз, поскольку показано, что их антиоксидантное действие описывается экстремальной зависимостью. Свыше определенных концентраций эффект убывает и даже возможна инверсия ингибирующего действия на прооксидантный. Вещества синергисты, не изменяя характера концентрационных зависимостей, позволяют уменьшить количество ингибитора и, работая в области оптимальных концентраций, достигать больших эффектов ингибирования по сравнению с действием индивидуального антиоксиданта в наиболее эффективных концентрациях.

Известен состав, предлагаемый для стабилизации липидов, включающий смесь антиоксиданта и вещества-синергиста, мас.%:
α-Токоферол (или α-токоферола ацетат) - 2,4-80,0
Бензафлавин - 2,3-76,9
Лецитин - 8,3-93,8
Состав добавляется в концентрации 0,4-5,2% от массы липидов /10/.

Представленная смесь содержит природные антиоксиданты α-токоферол (витамин Е), бензафлавина (аналога витамина В₂) и лецитин (яичный фосфатидилхолин), выполняющий роль синергиста ингибиторов окисления. Однако практическое применение указанной синергической смеси затруднено в силу многокомпонентности ее состава, отсутствия промышленного производства бензафлавина и лецитина, дороговизной препаратов, получаемых в экспериментальном производстве.

По этой причине поиск был нацелен на изыскание высокоэффективных синергических композиций, обладающих более высокой антиокислительной активностью в сравнении с прототипом, но более простых по составу и доступных для практического применения.

В этом отношении привлекают внимание вещества метаболического типа действия, в основе механизма действия которых лежит активное влияние на биохимические процессы организма. К таковым, в частности, относятся природный антиоксидант α-токоферол /1, 14/ и пантогам.

α-Токоферол (6-гидрокси-2,5,7,8-тетраметил-2-фитил хроман) является наиболее изученным природным антиоксидантом. Свойства токоферола как антиоксиданта проявляются в целом ряде сложных эффектов на всех уровнях организации от мембранных образований до организма в целом. При недостатке витамина Е наблюдаются многообразные патологические изменения большого числа органов и тканей животных и человека. Среди важнейших симптомов Е-витаминной недостаточности отмечаются нарушения репродуктивной функции, мышечная дистрофия, некрозы печени, повреждения эпителия почечных канальцев и т.д. /1, 7/.

α-Токоферол широко применяется в составе ряда лекарственных средств, витаминных комплексов, пищевых добавок в качестве важного средства антиоксидантной защиты липидов биологических мембран.

Другое соединение пантогам - кальциевая соль Д-гомопантотеновой кислоты или кальциевая соль Д-/+/-α,γ-диокси-β,β-диметилбутирил-γ-аминомасляной кислоты - препарат, проявляющий выраженную психофармакологическую активность, использующийся в психоневрологии /9, 13, 16/. Своеобразие спектра действия пантогама связано со структурными особенностями соединения, определяемыми заменой фрагмента β-аланина в молекуле пантотеновой кислоты (витамина B₅) на γ-аминомасляную кислоту - медиатора центрального типа действия /9/. Биологически значимым фрагментом структуры пантогама является остаток пантотеновой кислоты, которая входит в состав кофермента А (КоА, кофермент ацетилирования), играющего фундаментальную роль в липидном и белковом обмене /4, 14, 17/. Пантотеновая кислота (vitB₅) частично синтезируется кишечной микрофлорой, а также являясь важным алиментарным фактором, поступает в организм с пищевыми продуктами. Искусственно вызванный дефицит пантотеновой кислоты сопровождается головокружением, слабостью, тошнотой, снижением уровня половых гормонов, поражением слизистых оболочек и кожного покрова. Со стороны крови наблюдается нормоцитарная анемия, нарушение синтеза гема. При ее недостатке тормозится образование антител, с чем может быть связано повышение чувствительности к инфекциям. В медицине препараты пантотеновой кислоты применяются при алиментарных авитаминозах как самостоятельно, так и в составе витаминных комплексов. Пантогам используется при лечении черепно-мозговых травм. Высокая эффективность препаратов проявляется при лечении трофических язв, плохо заживающих ран, при диабетических поражениях нервной системы. Имеются сведения об использовании препаратов пантотеновой кислоты при артериальной гипертензии, ишемическом поражении миокарда.

Использование двух биологически активных соединений - α-токоферола и пантогама, учитывая однонаправленность действия составляющих, приведет к углублению и расширению спектра фармакологической активности смеси.

Отличительной особенностью предложенного состава является включение вместо бензафлавина и лецитина пантогама при следующих соотношениях компонентов в составе смеси, мас.%:
α-Токоферол (или α-токоферола ацетат) - 30-73
Пантогам - 27-70
добавляемых в концентрации 0,71-1,7% от массы липидов.

Эффективность стабилизаторов оценивалась несколькими независимыми методами:
- изучалась кинетика поглощения кислорода при инициированном окислении липидных субстратов различного происхождения в присутствии предлагаемого состава и прототипа;
- тестировалась кинетика накопления первичных продуктов окисления - гидропероксидов методом йодометрического титрования (ПЧ) в процессе "ускоренного старения" при аутоокислении липидов в тонком слое при повышенных температурах (40±0,2^oС).

Исследование кинетики поглощения кислорода проводилось манометрическим методом в установках типа Варбурга при инициированном окислении липидов в присутствии инициатора азобисизобутиронитрила (АИБН) в концентрации 3 мМ при температуре 60±0,5^oС. Контролем служили образцы липидов без добавок антиоксидантов.

В качестве субстратов окисления использовали как природные липиды (жир сиговых рыб Обского бассейна), так и метиловые эфиры олеиновой кислоты (метилолеат). Опытная серия рыбных липидов была наработана на Салехардском рыбоконсервном заводе по методу /18/. В составе липидов присутствуют значительные количества полиненасыщенных жирных кислот (до 37%), в том числе эйкозапентаеновая и эйкозагексаеновая высшие жирные кислоты (пента- и гексаены) (12% и 2%) соответственно /20/.

Эффективность индивидуальных компонентов и их комбинаций с синергистом окисления исследовалась в широком диапазоне концентраций и соотношений компонентов:
α-Токоферол (или α-токоферола ацетат) - От 0,25 до 8,50 мМ
Пантогам - От 0,2 до 8,0 мМ
что составляло от массы липидов (0,043-1,6%), (0,015-1,5%) для указанных выше компонентов соответственно.

В присутствии определенной добавки индивидуальных ингибиторов окисления (α-токоферола или α-токоферилацетата) или пантогама, их смесей записывалась кинетика окисления с использованием вышеописанных методов. На основании полученных данных строились кинетические кривые поглощения кислорода (мм³ О₂) либо накопления пероксидов (г I₂/100 г липида). Из кинетических кривых определялись периоды индукции (τ), за которые принимали:
- время (в мин), за которое процесс инициированного окисления липидов достигал максимальной скорости (τ_инд);
- время (в часах) накопления пероксидов, количественно соответствующих значению ПЧ 0,1% I₂.

Ингибирующее действие индивидуальных компонентов и их смесей оценивали по абсолютному значению разницы между периодами индукции окисления субстратов с индивидуальным токоферолом (или токоферола ацетатом) (τ_ТФ), смесью стабилизирующих добавок (τ_инг.) и без них (τ_o) по формуле: ε = Δτ = τ_инг.- τ_ТФ, либо выражали ее в относительных единицах Δτ/τ_ТФ, в %.

Эффективность стабилизации окисления определяли также по величине W₀₂/W_инг, количественно характеризующей степень уменьшения скорости поглощения кислорода в присутствии ингибитора окисления или его смеси с синергистом.

Сравнительный анализ экспериментально установленных значений ε, величины W₀₂/W_iинг для составов с различными соотношениями антиоксидантов и веществ-синергистов позволил выбрать среди них наиболее эффективные, превышающие по своему ингибирующему действию прототип.

Было установлено, что зависимость изменения периодов индукции для индивидуального α-токоферола и α-токоферола ацетата носит экстремальный характер. Диапазон эффективных концентраций расположен в области (0,25-8,0•10^-3) моль/л (0,043-1,5%), максимум соответствует концентрации 2,5•10^-3 моль/л (0,43% от массы липидов).

Индивидуальный пантогам ингибирующей активностью не обладает, однако в присутствии α-токоферола проявляет синергическое действие.

Изучение ингибирующего действия смесей пантогама с постоянными концентрациями α-токоферола показало, что зависимость периодов индукции от концентрации пантогама носит экстремальный характер с максимумом в области (2,5)•10^-3 моль/л (0,5%). Диапазон эффективных концентраций соответствовал (0,75-5,5)•10^-3 моль/л (0,06-1,1)%.

С целью отбора наиболее эффективных синергических смесей подробно изучались двукомпонентные составы, включающие α-токоферол или α-токоферола ацетат с пантогамом, при этом концентрации каждого из компонентов смеси выбирались из указанных выше диапазонов наибольшей эффективности каждого из составляющих.

Области изменения концентрации каждого из компонентов, составляющих в целом наиболее высокоэффективные смеси, представлены следующими значениями, в % от массы липидов:
α-Токоферол (или α-токоферола ацетат) - 0,21-1,20
Пантогам - 0,08-0,55
Суммарная концентрация компонентов высокоэффективных смесей составляет 0,7-1,7% от массы липидов, что отражено в формуле изобретения. Сущность изобретения иллюстрируется следующими примерами:
ПРИМЕР 1
Берут 10 г (точная навеска) эфиров ненасыщенных высших жирных кислот, например метилолеата или метиллинолеата, и добавляют 0,093 г (0,93%) смеси α-токоферола и пантогама. Стабилизирующая композиция содержит 0,043 г α-токоферола, 0,05 г пантогама, что составляет соответственно 0,43% и 0,50% от массы липидов. При этом соотношение компонентов стабилизирующей смеси следующее:
α-Токоферол (или α-токоферола ацетат) - 45
Пантогам - 55
ПРИМЕР 2
Берут 10 г (точная навеска) рыбных липидов. Добавляют 0,17 г (1,7%) смеси α-токоферола и пантогама. Стабилизирующая комбинация содержит 0,12 г α-токоферола, 0,05 г пантогама, что составляет соответственно 1,2% и 0,5% от массы липидов. При этом соотношение компонентов стабилизирующей смеси следующее:
α-Токоферол (или α-токоферола ацетат) - 73
Пантогам - 27
ПРИМЕР 3
Берут 10 г (точная навеска) эфиров ненасыщенных высших жирных кислот, например метилолеата или метиллинолеата, и добавляют 0,07 г (0,7%) смеси α-токоферола и пантогама. Стабилизирующая комбинация содержит 0,02 г α-токоферола, 0,05 г пантогама, что составляет соответственно 0,2% и 0,5% от массы липидов. При этом соотношение компонентов стабилизирующей смеси следующее:
α-Токоферол (или α-токоферола ацетат) - 30
Пантогам - 70
Эффективность ингибирующего действия смесей указанных выше веществ оценивали на основании данных кинетики поглощения кислорода, получаемых с использованием манометрического метода (ε), подробно изложенного в описании изобретения. Полученные результаты приведены в табл.1. Из данных табл. 1 видно, что все рекомендуемые сочетания ингибиторов окисления превосходят по величине эффективности прототип (ε = Δτ = τ_инг.- τ_ТФ, составляет 87 мин для смесей, содержащих α-токоферола ацетат, и 1200 мин для смесей, содержащих α-токоферол).

Высокоэффективными являлись композиции, приведенные в примерах 1, 2, 3. Максимальное антиоксидантное действие проявлял состав, описанный в примере 1. При ингибировании упомянутой смесью окисления метилолеата, рыбных липидов индукционные периоды составили 1200 мин и 300 мин соответственно. Следовательно, наиболее эффективной для метилолеата, а также рыбных липидов оказалась смесь, включающая:
α-Токоферол - 0,43%
Пантогам - 0,50%
от массы липидов.

Эффективность действия указанной выше смеси была сопоставлена в идентичных условиях окисления с периодами индукции опыта-контроля (неингибированных липидов) и антиоксидантным действием прототипа (табл. 1, 2). Как видно из табл. 1, 2, в совместном действии бинарной смеси токоферола с пантогамом проявляется синергизм. Количественно эффект синергизма оценивали по величине (Δτ), определяемой по разности периодов индукции для смесей и периода индукции, определенного для индивидуального токоферола, действующего в той же концентрации (Δτ = τ_Σ - τ_ТФ), либо определяли в процентах, исходя из формулы (Δτ/∑τ_ТФ)×100).
Было установлено, что эффективность синергизма при сочетанном использовании α-токоферола и пантогама в разных субстратах изменяется от 8,7% до 34%, тогда как для прототипа эффективность смесей изменялась в пределах (16-20)%. Для наиболее эффективной смеси α-токоферола с пантогамом величина синергизма составляла 34%, тогда как для прототипа синергизм в действии наиболее эффективной композиции проявлялся на уровне 20% (табл. 1).

При изучении кинетики накопления пероксидов было показано, что периоды индукции в опытах с наиболее эффективной композицией
α-Токоферол - 47
Пантогам - 53
добавляемых в количестве 0,43% и 0,50% от массы липидов соответственно, в 20 раз превышают контроль и в 7,4 раза индивидуальный α-токоферол (табл. 3).

Из сравнения ингибирующего действия исследуемых смесей видно, что их эффективность выше при ингибировании метилолеата нежели при окислении рыбных липидов. Данный факт связан, по-видимому, с тем, что рыбные липиды содержат природные ингибиторы (в том числе α-токоферол, синергист окисления - лецитин /11/), тогда как метилолеат не содержит ингибиторов окисления. Введение рекомендуемой смеси α-токоферола и пантогама воссоздает или усиливает (для рыбных липидов) антиоксидантную систему и обеспечивает эффективную защиту липидов от окисления. Более высокая ингибирующая способность указанной выше смеси по сравнению с прототипом была доказана несколькими независимыми методами (обсуждаемыми выше) (табл. 1, 2, 3).

Полученные нами впервые эффекты синергизма в смеси α-токоферола и пантогама могут быть объяснены исходя из представлений о механизме антиоксидантного действия используемых соединений. Оба компонента смеси воздействуют на сложный многостадийный процесс окисления по различным механизмам.

Так, в соответствии с литературными данными /3, 19/ α-токоферол проявляет чрезвычайно высокую активность в реакции с пероксидными радикалами (RO•2

Индивидуальный пантогам, как показали наши исследования, обладает способностью непосредственно взаимодействовать с гидропероксидами, разрушая их без образования свободных радикалов (табл. 3). Пантогам увеличивал период индукции накопления пероксидов в 7 раз и снижал скорость накопления первичных продуктов окисления в 17 раз. Смесь α-токоферола и пантогама оказалась в этом отношении еще более эффективной. При этом период индукции окисления субстрата, включающего (в % от массы субстрата):
α-Токоферол - 0,43%
Пантогам - 0,5%
возрастал в 20 раз (табл. 3), а скорость накопления пероксидов, напротив, уменьшалась в 37-38 раз.

Разрушение пероксидов под влиянием индивидуального пантогама и его смесей с α-токоферолом, не приводящее к образованию новых радикальных продуктов, в свою очередь, способствует снижению скорости расходования токоферола, что и является причиной выигрыша в периодах индукции, и обеспечению высокой эффективности смесей.

Вышеизложенное объясняет полученные авторами эффекты значительного усиления ингибирующего действия смеси указанных веществ по сравнению с прототипом. Сочетание в одной композиции вещества - синергиста и антиоксиданта, действующих на разные элементарные реакции сложного окислительного процесса, позволяет значительно увеличить ингибирующую способность антиоксиданта и эффективно тормозить окисление полиненасыщенных субстратов.

Источники информации
1. Авакумов В. М., Ковлер М.А., Кругликова - Львова Р.П. Лекарственные средства метаболической терапии на основе витаминов и ферментов (Обзор) // Вопросы мед. химии. - 1992. - т.38.- N4. - с.14-21.

2. Баранцевич Е.Р., Александрова Л.А., Григоренко Г.А., Мельникова Е.В., Скоромец А.А. Нейрометаболические препараты в терапии диабетических поражений нервной системы // В сб. материалов международного симпозиума "Метаболическая терапия в кардиологии, эндокринологии и неврологи". - 1998. - С-П. - 43 с.

3. Бурлакова Е.Б., Крашаков С.А., Храпова Н.Г. Роль токоферола в пероксидном окислении липидов биомембран // Биологические мембраны. - 1998. - т. 15. - 2. - с. 137-168.

4. Бышевский А.Ш., Терсенов О.А. Биохимия для врача. - Екатеринбург. - 1994. - с. 193.

5. Герчук М.П. Антиокислители в пищевой промышленности // Журн. Всесоюз. хим. об-ва им. Д.И. Менделеева. - 1960. - N4. - с. 395-402.

6. Дегтярев И.А., Заиков Г.Е. Ионол. Распределение в организме и биологическое действие //Хим. - фарм. журн. - 1985. - N10. - с. 1160-1168.

7. Дурнев А.Д., Середенин С.В. Антиоксиданты как средства защиты генетического аппарата //Хим. - фарм. журн. - 1990. - N2. - с. 92-100.

8. Кинетические особенности токоферолов как антиоксидантов/ Бурлакова Е. Б., Крашаков С.А., Храпова Н.Г. Черноголовка. - 1992. - 56 с.

9. Кругликова-Львова Р.П., Авакумов В.М. Лекарственные средства на основе витаминов. // Коферментные препараты. - 1995. - с. 9-12.

10. Кутузова И.В., Сторожок Н.М. Состав для стабилизации липидов. Патент 2077558, Россия, опубл. в БИ 11. - 1997 г.

11. Кутузова И.В. Теоретические и биофармацевтические аспекты создания стабильных липидных препаратов и их лекарственных форм. Автореф. дис. д.ф.н. - М. - 1996. - 39 с.

12. Ленинжер А. Основы биохимии. - М., - Мир. - 1985. - т.1. - 385 с.

13. Моисеенко А.Г., Копелевич В.М, Мейбак В.М. и др. Производные пантатеновой кислоты; разработка новых витаминных и фармакологических средств. - Минск. - 1989. - 216 с.

14. Новые ферментные препараты. - М. - ЦБНТИмедпром. - 1983. - 33 с.

15. Пузаков С.А. Химия. - М. - Медицина. - 1995. - 593 с.

16. Сливченко Е. С., Евсеева Е.Н., Маркичев Н.А. // Химико-фармацевтический журнал 1983 г. - 12. - с. 1513-1516.

17. Смирнов М.И. Витамины. - М. - 1974. - с. 375-383.

18. Сторожок Н.М., Кутузова И.В. Состав для стабилизации липидов. Патент 2077552, Россия, опубл. в БИ 11. - 1997 г.

19. Сторожок Н.М., Храпова Н.Г., Бурлакова Е.Б. Исследование межмолекулярных взаимодействий компонентов природных липидов в процессе окисления // Химическая кинетика. - 1995. - т. 14.- 11. - с. 29-46.

20. Ушкалова В.Н., Артамонова Н.А., Сторожок Н.М., Горяев М.И. Жирнокислотный состав общих и нейтральных липидов сиговых Обского бассейна.// Химия природ. соединен. - 1981. - 5. - с. 555-558.

Изобретение относится к пищевой, косметической и химико-фармацевтической промышленности. Состав для стабилизации липидов, включающий α-токоферол или α-токоферола ацетат, содержит в качестве синергиста биоантиоксиданта пантогам при определенном соотношении компонентов. Применение синергической композиции позволяет увеличить эффективность действия α-токоферола на 10-34% и достигать высоких эффектов ингибирования при меньших концентрациях антиоксиданта. 3 табл.

Состав для стабилизации липидов, включающий α-токоферол или α-токоферола ацетат, содержащий в качестве синергиста биоантиоксиданта пантогам при следующем соотношении компонентов, мас. %:
α-Токоферол или α-токоферола ацетат - 30,0-73,0
Пантогам - 27,0-70,0
добавляемый в концентрации 0,7-1,7% от массы липидов.