СУЛЬФОЗАМЕЩЕННЫЕ ФТАЛОЦИАНИНЫ КАК ФОТОСЕНСИБИЛИЗАТОРЫ ДЛЯ ФОТОДИНАМИЧЕСКОЙ ТЕРАПИИ Российский патент 2002 года по МПК C07D487/22 C07F3/02 A61K31/409 A61P35/00 

Настоящее изобретение относится к фармацевтической химии, а более конкретно к препаратам для фотодинамической терапии (ФДТ) злокачественных опухолей и других патологических новообразований.

Метод ФДТ основан на использовании веществ - фотосенсибилизаторов, которые при введении в организм локализуются преимущественно в опухоли, а при световом, в частности лазерном возбуждении, продуцируют цитотоксические вещества, прежде всего синглетный кислород. В настоящее время в клинической практике применяются фотосенсибилизаторы на основе сложных смесей производных гематопорфирина, например Fotofrin-II (E. Sternberg, D. Dolphin, С. Bruckner. Tetrahedron, 54, 4151 (1998)).

Недостаток фотосенсибилизаторов на основе производных гематопорфирина заключается в том, что их коэффициент экстинкции в наиболее длинноволновой полосе (620-640 нм) относительно невысок, в то время как поглощение несенcибилизированных тканей в этой области весьма значительно. Это приводит к значительным потерям излучения вне опухолевых тканей, обусловливает малую глубину проникновения излучения в ткани, что затрудняет лечение опухолей больших размеров и приводит к необходимости использовать большие дозы вводимого в организм препарата и терапевтического излучения. В целом все это приводит к невысокой эффективности ФДТ.

Эти недостатки частично устраняются при использовании для ФДТ фотосенсибилизатора - сульфированного фталоцианина алюминия ("Фотосенса"), поглощающего в спектральном диапазоне 660-680 нм. Коэффициент экстинкции "Фотосенса" в максимуме полосы поглощения превышает 10⁵ л•моль^-1•см^-1, поглощение несенсибилизированных тканей организма в этом диапазоне падает, поэтому при его использовании повышается глубина фотодинамического воздействия на ткани, что позволяет повысить лечебную эффективность ФДТ (В.В. Соколов, E. Ф. Странадко, Н.Н. Жаркова, Р.И. Якубовская, E.В. Филоненко, Т.А. Астраханкина. Вопросы онкологии, 41,

134 (1995)). Однако "Фотосенс" обладает все же определенными недостатками, основным из которых является весьма высокая величина используемой дозы (0.5-0.8 мг на кг веса тела), следствием чего является наличие у него побочной кожной токсичности.

Задача изобретения - изыскание фотосенсибилизаторов, которые бы были более эффективны в процессе ФДТ, чем "Фотосенс". Для решения этой задачи предложено применять в качестве фотосенсибилизаторов для ФТД фталоцианины следующей формулы:

где M=HH [Pc^sH₂]; Mg [Pc^sMg]
Известно использование близкого по структуре соединения - тетранатриевой соли безметального тетра-4-сульфофталоцианина - в качестве кислотного красителя (Cl, CC-Blue 249)
Использование же в качестве фотосенсибилизаторов некоторых сульфированных металлических комплексов фталоцианина, например алюминиевого комплекса, не позволяет утверждать, что и другие металлические комплексы, а также безметальный фталоцианин могут быть использованы для тех же целей. Известно, например, что комплексы парамагнитных металлов (меди, ванадия и т.п.) из-за их фотофизических свойств (короткоживущее триплетное состояние) не генерируют синглетный кислород и не могут быть использованы в качестве фотосенсибилизаторов. (Н. Аli, J. E. van Lier, Chem. Rev. 1999, v. 99, N 9, pp. 2379-2450).

Что касается безметального соединения, то в водных растворах оно находится в полностью агрегированном состоянии и соответственно поглощает в совершенно другой области спектра (см. стр. 3 описания), не обладает флуоресценцией и не генерирует синглетный кислород. В той же степени это относится и к магниевому комплексу. Более того, в литературе имеются сведения о том, что сульфированный безметальный фталоцианин не обладает фотосенсибилизирующими свойствами и не может быть использован в качестве препарата для ФДТ (N. Brasseur, Н. Ali, R. Langlois, J.R.Wagner, J. Rousseau and J.E. van Lier, Photochem. Photobiology, 1987, v. 45, N 5, pp. 581-586). Однако, как было показано нами, в биологических средах из-за взаимодействия с элементами клеточных структур имеет место дезагрегация этих двух соединений (что не является очевидным) и как следствие проявление фотосенсибилизирующих свойств.

1. Синтез фотосенсибилизаторов
Сульфокислоты безметального фталоцианина получены сульфированием незамещенного РсН₂ эквимолекулярными или близкими к эквимолекулярным количествам хлорсульфоновой кислоты в высококипящих инертных растворителях (трихлорбензол, о-дихлорбензол и т. п.) при 190-210^oС. Выход целевых продуктов составляет 92-65%, Сульфокислоты фталоцианина магния получают металлированием Рс^sН₂.

Нижеприведенные примеры иллюстрируют предлагаемое изобретение.

Пример 1. Динатриевая соль дисульфокислоты безметального фталоцианина. К суспензии 6,15 г (0,012 моль) безметального фталоцианина в 45 мл трихлорбензола добавляют при перемешивании 2,79 г (1,6 мл, 0,024 моль) хлорсульфоновой кислоты, смесь нагревают до 200^oС, выдерживают при этой температуре 2 ч, охлаждают до 100^oС, осадок отфильтровывают горячим, промывают последовательно толуолом, ацетоном, 5%-ной соляной кислотой сушат в вакууме, получают 8,5 г технической сульфокислоты безметального фталоцианина. Технический комплекс растворяют в водном 0,5%-ном растворе NaOH, отфильтровывают от нерастворимых примесей, после чего подкисляют разбавленной соляной кислотой. Выпавший осадок отфильтровывают, промывают 5%-ным водным раствором NaCl до нейтральной реакции, после чего промывают 80%-ным водным этанолом до отсутствия ионов хлора в промывных водах, а затем абсолютным горячим спиртом, сушат, получают 8,04 г (93%) динатриевой соли дисульфокислоты безметального фталоцианина. После дополнительной очистки комплекса переосаждением из воды этанолом получают 7,5 г (87%) динатриевой соли дисульфокислоты безметального фталоцианина.

Найдено, %: N 14,99; S 9,53
С₃₂Н₁₆Nа₂Н₈0₆S₂
Вычислено, %: N 15,59; S 8,92.

Согласно данным хроматографического анализа продуктов гидролиза, полученный комплекс содержит 2 сульфогруппы λ_макс, нм (lgε) в диметилсульфоксиде: 696 (5,06), 663 (5,04), 645, 602. λ_макс, нм (lgε) в буфере рН 6,86: 610 шир. (4,45).

Пример 2. Динатриевая соль дисульфокислоты фталоцианина магния получена металлированием сульфозамещенного РсН₂ ацетатом магния в диметилсульфоксиде или диметилформамиде.

К раствору 0.35 г (0,49 ммол) натриевой соли дисульфокислоты безметального фталоцианина в 15 мл диметилсульфоксида добавляют раствор 0,11 г (0,51 ммоль) ацетата магния тетрагидрата в 5 мл диметилсульфоксида. Смесь перемешивают при 50-55^oС 1,5 ч, фильтруют. К раствору добавляют хлороформ, выпавший осадок отфильтровывают, промывают последовательно хлороформом, ацетоном, изопропанолом, этанолом, сушат, получают 0,35 г (96%) динатриевой соли дисульфокислоты фталоцианина магния. После дополнительной очистки переосаждением из воды изопропанолом получают 0,25 г (69%) динатриевой соли дисульфокислоты фталоцианина магния.

Найдено, %: S 8,50
C₃₂H₁₄N₈О₆MgNa₂S₂
Вычислено, %: S 8,65. λ_макс, нм (lgε) в диметилформамиде: 674 (5,25), в 4%-ном водном диметилформамиде: 677 (5,15).

Масс-спектральный анализ (метод МАЛДИ) образцов, а также масс-спектральный анализ фракций, полученных из исходных образцов разделением с помощью колоночной жидкостной хроматографии, показывает, что образцы представляют собой смесь моно-, ди- и три- сульфированных производных. В смеси доминирует дисульфированное производное (70-80%).

С использованием этого метода были также получены три- и тетрасульфозамещенные Pc^sH₂ и Pc^SMg.

2. Изучение Pc^SH₂ и Pc^SMg в условиях in vitro
2.1. Анализ фармакодинамики накопления и выделения из клеток Pc^SH₂ и Pc^SMg
Исследования проводили на клетках аденокарценомы легкого человека А549. Клетки культивировали на среде Игла-МЕМ с добавлением 100 мкг/мл гентацимицина, 2 мМ L глутамина и 10% инактивированной нагреванием эмбриональной телячьей сыворотки при 37^oС в увлажненной атмосфере, содержащей 5% С0₂. Клетки выращивали на покровных стеклах в 24-луночных плоскодонных планшетах (плотность посева 5•10⁴ кл/см³. Через 24 ч, после образования рыхлого слоя в среду вводили исследуемый препарат.

Стоковый раствор Рс^SH₂ и Pc^SMg (1 мМ) готовили в диметилсульфоксиде. В культуральной среде концентрация диметилсульфоксида во всех экспериментах не превышала 1%. При исследовании кинетики накопления клетки инкубировали с Рс^SH₂ и Pc^SMg в конечной концентрации 10 мкг/мл в течение 10, 30 мин, 1, 3 или 6 ч, затем отбирали среду, дважды отмывали клетки теплым физраствором и после этого проводили микроспектральные измерения. При исследовании кинетики выведения препарата из клеток клетки инкубировали с Рс^SH₂ и Pc^SMg в конечных концентрациях 10 мкг/мл в течение 1 ч, затем отбирали среду, клетки дважды промывали теплым физраствором и после этого помещали в свежую культуральную среду еще на 30 мин, 1, 6 или 24 ч, еще раз отмывали теплым физраствором и затем проводили микроспектральные измерения. При исследовании концентрационной зависимости накопления клетки инкубировали с 0,4, 0,8, 2, 10 или 50 мкг/мл Рс^SH₂ и Pc^SMg в течение 30 мин, затем отбирали среду, клетки дважды отмывали теплым физраствором и после этого проводили микроспектральные измерения.

Для анализа накопления, распределения и взаимодействия Рс^SH₂ и Pc^SMg в клетках использован метод конфокальной микроспектроскопии и реконструкции двух- и трехмерных спектральных изображений (КОМИРСИ).

Спектральный анализ показал, что Рс^SH₂ и Pc^SMg в клетках связаны преимущественно с мембранными структурами и в меньшей степени с белками. Полученные данные свидетельствует, что кинетика проникновения в клетки Рс^SH₂ и Pc^SMg сравнительно быстрая: начинает выходить на плато через 1 ч и достигает плато через 3 ч инкубации. При этом средняя внутриклеточная концентрация фотоактивной формы превышает концентрацию препарата во внешней среде для Рс^SH₂ в 8-9 раз, а для Pc^SMg в 1,5 раза. При равных концентрациях "Фотосенса" и Рс^SH₂ и Pc^SMg в культуральной среде внутриклеточные концентрации Pc^SMg в 3-4 раза, а Рс^SH₂ в 40-50 раз превышают внутриклеточную концентрацию "Фотосенса", что, очевидно, является одной из главных причин очень высокой фотодинамической активности Рс^SH₂ и Pc^SMg.

При удалении препарата из внешней среды внутриклеточная концентрация в течение 1 ч падает: в случае Рс^SH₂ в 1,7-2 раза, для Pc^SMg - в 1,3-1,5 раза, а в случае "Фотосенса" - 2-2,5 раза. Однако внутриклеточная концентрация "Фотосенса" после этого остается неизменной в течение 24 ч, внутриклеточная концентрация Рс^SH₂ продолжает медленно снижаться и через 24 ч составляет всего 5-10% от исходного уровня.

2.2. Изучение цитотоксичности и фотоактивности Рс^SH₂ и Pc^SMg
Изучение цитотоксичности и фотоактивности Рс^SH₂ и Pc^SMg в условиях in vitro проводили на культуре клеток эпидермоидной карциномы гортаноглотки человека (Нер-2). Тестируемые соединения растворяли в дистиллированной воде с добавлением 10%-ной эмбриональной телячьей сыворотки, последующее титрование до рабочих концентраций проводили с шагом 2 в среде Игла. Для оценки фототоактивности клетки перед облучением инкубировали с серийными разведениями тестируемых соединений в течение 2 ч в стандартных условиях (при 37^oС в увлажненной атмосфере, содержащей 5% двуокиси углерода). В качестве источника оптического излучения применяли галогеновую лампу мощностью 500 Вт, фильтр КС-13 (λ≥640 нм). Световая доза 10 Дж/см² Выживаемость клеток оценивали визуально при помощи световой микроскопии и колориметрическим методом с использованием МТТ-теста. Определяли уровни ингибирования роста клеток и ИК₅₀ (концентрацию цитотоксического агента, при которой наблюдается ингибирование роста клеток на 50%).

Результаты экспериментов показали, что Рс^SH₂ и Pc^SMg характеризуются отсутствием биологически значимых уровней темновой цитотоксической активности и проявляют высокую фотодинамическую активность, уровень которой значительно превышает уровень фотодинамической активности препарата "Фотосенс". Так, ИК₅₀ для Рс^SH₂ составляет 0,9•10^-7 М, для Pc^SMg - 1,8•10^-7 М, тогда как ИК₅₀ "Фотосенса" равна 2,5•10^-6 М.

3. Изучение Рс^SH₂ и Pc^SMg в условиях in vivo
3.1. Фотодинамическая терапия
Рс^SH₂ вводили внутривенно в дозе 0,5 мг/кг, a Pc^SMg - в дозе 0,5 мг/кг и 2 мг/кг мышам BDF₁ с опухолью Р-388, привитой подкожно в область икроножной мышцы правой лапы. Через 24 ч после введения фотосенсибилизаторов опухоли облучали красным светом (фильтры Кс-10 и СЗС-26, λ≥630 нм), используя излучатель АТО-1 (НПО "Полюс") на основе галогеновой лампы с оптоволоконным жгутом. Диаметр светового пятна составлял 1.5 см, плотность мощности - 360 мВт/см², световая доза - 324 Дж/см².

Противоопухолевый эффект оценивали по торможению роста опухоли (ТРО) относительно соответствующих величин у животных, не подвергавшихся каким-либо воздействиям. Биологически значимыми считали ТРО≥50% (Экспериментальная оценка противоопухолевых препаратов в СССР и США. 1980., М., Медицина. - С. 71-106).

В результате проведенных экспериментов показано, что ФДТ с Рс^SH₂ и Pc^SMg подавляет рост Р-388 (таблица 1), причем Рс^SH₂ при применении более низкой дозы фотосенсибилизатора, чем "Фотосенс".

3.2. Изучение накопления в тканях животных
Селективность накопления Рс^SH₂ и Pc^SMg изучали на мышах с опухолью Эрлиха. Содержание фотосенсибилизатора в тканях оценивали флюоресцентным методом на лазерной диагностической установке на основе He-Ne лазера (длина волны генерации - 633 нм) контактным способом ex vivo (N.N. Zharkova, D.N. Kozlov, Yu. N. Polivanov et al. "Laser-excited fluorescence spectrometric system for tissue diagnostics" Proc. SPIE, vol. 2328, pp. 196-201 (1994).

Краситель вводили внутривенно в дозе 1 мг/кг. В качестве контроля сравнения вводили "Фотосенс" в дозе 2 мг/кг (доза препарата, при которой константа селективности (Кс) - отношение интенсивности флюоресценции в опухоли к таковой в окружающей ткани (коже) - "Фотосенса" в опухоли Эрлиха максимальна) (Kazachkina N.I., Zharkova N.N., Fomina G.I., et al. Pharmacokinetical study of Al- and Zn-sulphonated phthalocyanines. Proc. SPIE, vol.2924. pp. 233-249, 1996).

Экзогенную флюоресценцию регистрировали через 24 и 48 ч после введения красителя. Было показано, что Рс^SH₂ и Pc^SMg в организме животных обладают флюоресцентными свойствами, в тканях мышей имеют максимум флюоресценции при 683-693 нм и избирательно накапливаются в опухоли Эрлиха с показателями селективности не ниже, чем Кс "Фотосенса" (таблица 2).

3.1. Исследование распределения и взаимодействий Рс^SH₂ в различных структурах опухолевых тканей
Криогенные срезы тканей готовили следующим образом. Опухоль Эрлиха перевивали мышам подкожно. На 14 день роста опухоли животным вводили однократно внутривенно Рс^SH₂ в дозе 5 мг/кг веса. Через 24 ч животных забивали и иссекали опухоль с окружающими тканями.

Серийные криостатные срезы нарезали толщиной 10 мкм. Срезы высушивали на воздухе в темноте и хранили при -20^oС. Один из серийных срезов фиксировали в 10%-ном формалине и окрашивали гематоксилином/эозином. Этот срез использовали для предварительной идентификации тканевых структур и их картирования. Полученные карты окрашенных срезов применяли для ориентации на неокрашенных срезах при спектральных измерениях. Измерения спектральных изображений методом КОМИРСИ проводили на неокрашенных срезах. Затем эти срезы фиксировали в 10%ном формалине и окрашивали гематоксилином/эозином Области, исследованные методом КОМИРСИ, подвергались детальному гистохимическому анализу с целью идентификации тканевых структур, присутствующих в спектральных изображениях.

Средние относительные концентрации Рс^SH₂ и "Фотосенса" в различных тканевых структурах представлены в таблице 3. Анализ этих данных показывает, что относительное распределение Рс^SH₂ в тканевых структурах существенным образом отличается от распределения "Фотосенса" и характеризуется сравнительно однородным распределением в опухоли и окружающих ее тканях: опухолевые клетки, соединительная ткань и кожа накапливают его в сходных концентрациях. Основное отличие относительного распределения "Фотосенса" в тканевых структурах от распределения Рс^SH₂ - это предпочтительное (в 5-7 раз) накопление в структурах, окружающих опухолевые клетки, а не в самих клетках.

Если условно разделить суммарный противоопухолевый эффект ФДТ in vivo на два компонента: А - уничтожение опухолевых клеток путем прямого воздействия на сами опухолевые клетки за счет фракции фотосенсибилизатора, локализованного внутри опухолевых клеток, В - подавление роста опухоли и ее уничтожение путем разрушения окружающих и питающих опухоль тканевых структур за счет фракции фотосенсибилизатора, локализованного в окружающих тканевых структурах, можно утверждать, что фотодинамическое действие "Фотосенса" будет в значительной степени определяться эффектом В. А в случае Рс^SH₂ относительная роль эффекта А должна быть значительно выше, чем у "Фотосенса".

Таким образом, синтезированные сульфозамещенные безметальный (Рс^SH₂) и магниевый (Рс^SМg) фталоцианины являются достаточно эффективными фотосенсибилизаторами в процессе ФДТ, а эффективность сульфозамещенного безметального (Рс^SH₂) значительно превышает эффективность известного "Фотосенса".

Изобретение относится к области медицины и касается применения сульфозамещенного безметального фталоцианина и его магниевого комплекса общей формулы (I) как фотосенсибилизатора для фотодинамической терапии (ФДП). Указанные фталоцианины являются более эффективными фотосенсибилизаторами в процессе ФДТ. 3 табл.

где M=HH [Pc^sH₂]; Mg[Pc^sMg].

Применение сульфозамещенных фталоцианинов общей формулы

где M= HH [Pc^sH₂] ; Mg[Pc^sMg] ,
в качестве фотосенсибилизаторов для фотодинамической терапии.