СПОСОБ ОЧИСТКИ ТРОМБИНОПОДОБНОЙ ПРОТЕАЗЫ ИЗ ЗМЕИНОГО ЯДА Российский патент 2002 года по МПК C12N9/48 C12N9/74 A61K35/58 

Изобретение относится к способу очистки тромбиноподобных протеаз из змеиного яда.

Примерами таких протеаз являются батроксобин, кротолаза и особенно анкрод. Последний является антикоагулянтом, который выделяется из яда змеи Agkistrodon rhodostoma (Мерк-индекс 1989, 664). В настоящее время уже описано большое число методов по их выделению из змеиного яда (патент Великобритании GB-PS 1094301, патент Великобритании GB-PS 1177506, патент Великобритании GB-PS 1293793, патент США US-PS 3743722, патент США US-PS 3879369, немецкие заявки на патент DE-OS 2428955, DE-OS 2734427). Эти методы в значительной степени основываются на хроматографических стадиях и дают анкрод с различными выходами и различной степенью чистоты.

До сих пор не удавалось получить анкрод высокой степени чистоты. Во всех случаях была выделена смесь энзимов с анкродом в качестве основного компонента, который в зависимости от технологии получения был загрязнен в большей или меньшей степени посторонними протеинами.

Был найден способ получения тромбиноподобной протеазы из змеиного яда с высокой степенью чистоты.

Объектом изобретения является способ очистки тромбиноподобной протеазы из змеиного яда, отличие которого состоит в том, что а) протеазу в виде сырого продукта подвергают предварительной очистке с помощью афинной хроматографии или хроматографии на основных ионообменниках, б) полученную таким образом фракцию с тромбиноподобными энзимами подвергают хроматографии на слабых катионообменниках или разделяют с помощью адсорбции на стекле в основной области, в) основной компонент со стадии б) подвергают гель-хроматографии или очищают с помощью хроматографии на стекле в кислой области, причем по меньшей мере одна из стадий б) или в) включает разделение с помощью хроматографии на стекле.

Предпочтительно на стадии б) проводить очистку с помощью адсорбции на стекле и на стадии в) - посредством гель-хроматографии.

Предпочтительно также очистку хроматографией на стадиях б) и в) проводить на стекле.

Для предварительной очистки с помощью афинной хроматографии особенно пригодны агматин-, аргинин- или гепаринсефароза.

В качестве основного ионообменника для очистки особенно пригодны диэтиламиноэтилцеллюлоза и диэтиламиноэтилсефароза.

В качестве буфера для ионообменной хроматографии следует назвать трифосфатный и натрийфосфатный буфер.

Хроматография на основных ионообменниках проводится при значении рН 5-9, предпочтительно при 6-8,5.

В ходе предварительной очистки из сырого энзима удаляется приблизительно 70-80% посторонних протеинов и других составных частей.

Если стадия б) очистки проводится с использованием катионообменников, то применяются следующие слабокислые сорбенты: карбоксиметилсефароза, значение рН 5-9, и амберлит CG 50 с рН 5-9.

Хроматография на стекле означает, что анкрод и используемые тромбиноподобные энзимы, такие как сильно основные протеины, адсорбируются на стеклянной матрице при значениях рН 7,5-9,0, предпочтительно при 8-8,5. Около 60% кислых посторонних протеинов вымываются с колонки с равновесным буфером (предпочтительно трис-фосфатный, соответственно, натрийфосфатный буфер). Анкрод элюируют со стекла фракционированно с более чем 90% степенью чистоты, при этом ионную силу буферного раствора повышают с помощью добавления поваренной соли до 0,3-1,0 М.

На стадии б) очистки энзим обогащается приблизительно до 90%.

Для гель-хроматографии на стадии очистки используют СЕФАКРИЛ S -100HR, СУПЕРДЕКС, СЕФАДЕКС, УЛЬТРОГЕЛЬ и СУПЕРОЗУ.

Если на стадии очистки в) выбирают хроматографию на стекле, то посторонние протеины адсорбируются из раствора анкрода на поверхности стекла в области кислых значений рН 4-6, в то время как анкрод может быть элюирован с колонки непосредственно в равновесном буфере с чистотой выше 95%. Необходимая ионная сила буфера может регулироваться добавлением солей, таких как поваренная соль.

Способ согласно изобретению особенно подходит для получения чистого анкрода, который имеет чистоту выше 95%.

Пример 1
а) Предварительная очистка
3 г высушенного яда Малайской горной гадюки растворяют в 50 мл трис-(гидроксиметил)-аминометан (ТРИС)-фосфатного буфера с рН 8,5, нерастворимую клеточную составную часть яда центрифугируют и прозрачный желтый раствор наносят на хроматографическую колонку, которая имеет диаметр 1,6 см и заполнена до высоты 30 см слоем содержащей диэтиламиноэтиловые группы сефарозы - ФФ (фирма Pharmacia). Тромбиноподобные энзимы яда, также как и протеины кислого характера, связываются (адсорбируются) на матрице. Хроматографию проводят при скорости протока 150-200 мл/час. Посредством промывания колонки при комнатной температуре 300 мл равновесного буфера (10 мМ ТРИС-фосфатного буфера с рН 8,5) до значения оптической плотности элюата ниже 0,5 при 280 нм и последующего промывания 400 мл 35 мМ ТРИС-фосфатного буфера с рН 6,0 до оптической плотности элюата <0,4 при 280 нм элюируют приблизительно 70-80% посторонних протеинов (рассчитано на оптическую плотность исходного раствора при 280 нм). Основную фракцию с анкродом элюируют с 85% выходом в 150 мл 150 мМ ТРИС-фосфатного буфера с рН 6,0.

б) Основная очистка
Элюат, который содержит анкрод, концентрируют до 200 мл с помощью ультрафильтрации на мембране с разделительной границей 10000 Дальтон и к нему добавляют 100 мМ ТРИС-фосфатного буфера с рН 8,0. Этот раствор наносят на колонку, которая имеет диаметр 1,6 см и заполнена до высоты 15 см пористым стеклом BIORAN (фирма Schott, диаметр пор 25-35 нм, размер зерен 30-60 мкм). Промыванием колонки при комнатой температуре 300 мл 100 мМ ТРИС-фосфатного буфера с рН 8 и скоростью протока 250 мл/час с колонки элюируют около 60% посторонних протеинов (рассчитано на оптическую плотность нанесенного раствора при 280 нм).

Для элюирования используют 0,5 М раствора хлорида натрия, к которому добавляют 100 мМ ТРИС-фосфата до значения рН 8. Элюат автоматически снимают с колонки в виде фракций, каждая объемом приблизительно 10 мл. Тромбиноподобные энзимы элюируют в пике с последующей конечной областью. Для того, чтобы получить основной компонент (соответственно анкрод), которая содержит самое большее 5% тромбиноподобного побочного компонента, исследуют отдельные фракции при переходе от главного пика к конечной области на их удельную активность на фибриногеназу, а также на их состав с помощью обратнофазной высокопроизводительной жидкостной хроматографии. Подвергают очистке только фракции, которые обладают удельной активностью выше 1700 ед., определенной оптической активностью при 280 нм, и фракции, которые показывают по высокопроизводительной жидкостной хроматографии меньше, чем 10% побочных компонентов (около 80 мл). Основной компонент получают с чистотой 96% и выходом 72% с ВIORAN-колонки.

в) Тонкая очистка
Элюат с основным компонентом анкродом концентрируют до 2 мл на УМ 10 - мембране (фирма Amicon) и полученный концентрат наносят на колонку, которая имеет диаметр 1,6 см и заполнена до высоты 85 см слоем сефакрила S-100 HR. Колонку промывают буферным раствором, состоящим из 100 мМ хлорида натрия и 100 мМ фосфата натрия, который имеет значение рН 6,9. С помощью такого рода гель-хроматографии отделяют остаточную протеазу, а также ТРИС от анкрода. Выход на этой стадии составляет около 90%.

Пример 2
а) Предварительная очистка
2,1 г высушенного яда Малайской горной гадюки растворяют в 50 мл 35 мМ ТРИС-фосфатного буфера с рН 8,5, нерастворимую клеточную составную часть яда центрифугируют и прозрачный желтый раствор наносят на хроматографическую колонку, которая имеет диаметр 1,6 см и заполнена до высоты 30 см слоем содержащей диэтиламиноэтиловые группы сефарозы - ФФ (фирма Pharmacia) и промыта вышеуказанным буфером. Посредством промывания колонки при комнатной температуре 600 мл равновесного буфера до значения оптической плотности элюата ниже <0,2 при 280 нм элюируют приблизительно 70% посторонних протеинов (рассчитано на оптическую плотность исходного раствора при 280 нм). Основную фракцию элюируют с 90-100% выходом в 200-250 мл 150 мМ ТРИС-фосфатного буфера с рН 6,0.

б) Основная очистка
Элюат концентрируют до 20 мл, как в примере 1, и к нему добавляют 50 мМ Na-фосфатного буфера, который имеет значение рН 8,5. Этот раствор наносят на колонку с пористым стеклом BIORAN (диаметр 1,6 см, высота 15 см, диаметр пор 25-35 нм, размер зерен 30-60 мкм). Посредством промывания колонки при комнатной 300 мл 50 мМ Na-фосфатного буфера с рН 8,5 и скорости протока 250 мл в час с колонки элюируют около 60% посторонних протеинов (рассчитано на оптическую плотность нанесенного раствора при 280 нм).

Для элюирования тромбиноподобного энзима используют 1М раствор хлорида натрия, к которому добавляют 50 мМ Na-фосфата до значения рН 8,0. С помощью 150 мл буфера элюируют около 80% нанесенных единиц энзима.

в) Тонкая очистка
Элюат концентрируют до 20 мл, как описано выше, и к нему добавляют 50 мМ Na-фосфатного буфера, который имеет значение рН 5,0. Это раствор наносят на колонку, которая имеет диаметр 1,6 см и заполнена до высоты 15 см слоем пористого стекла BIORAN с диаметром пор 90-100 нм и величиной зерен 30-60 мкм. При рН 5,0 адсорбируются на BIORAN-стекле побочные компоненты, в то время как основной компонент анкрод элюируют с колонки с помощью равновесного буфера с чистотой почти 100% и приблизительно с 80-90% выходом (рассчитано на нанесенные единицы).

Пример 3
а), б) Предварительная и основная очистка
2,1 г высушенного яда Малайской горной гадюки предварительно фракционируют на содержащей диэтиламиноэтиловые группы сефарозе аналогично примеру 2, элюат концентрируют до 20 мл аналогично примеру 1, и к нему добавляют 40 мМ ТРИС-фосфатного буфера с рН 6,2. Этот раствор наносят на хроматографическую колонку, которая имеет диаметр 1,6 см и заполнена до высоты 20 см слоем карбоксиметилсефарозы ФФ (фирма Pharmacia), промывают вышеуказанным буфером. С помощью промывки колонки при комнатной температуре 300 мл равновесного буфера и скорости протока 250 мл/час с колонки элюируют 60% посторонних протеинов (рассчитано на оптическую плотность нанесенного раствора при 280 нм).

Для элюирования тромбиноподобного энзима используют аналогично примеру 2 1М раствор хлорида натрия, к которому добавляют 50 мМ Na-фосфата до значения рН 8,0. С помощью 150 мл буфера элюируют около 80% нанесенных единиц тромбиноподобного энзима.

в) Тонкая очистка
Тонкую (окончательную) очистку анкрода проводят аналогично примеру 2 на пористом стекле (диаметр пор приблизительно 100 нм; размер зерен 30-60 мкм) с помощью 50 мМ фосфатного буфера с рН 5,0. Анкрод элюируют с чистотой более 95% и с выходом около 85% (рассчитано на нанесенные единицы).

Пример 4
а) Предварительная очистка
2 г высушенного яда южноамериканской гадюки Bothrops atrox растворяют в 50 мл трис-(гидроксиметил)-аминометан (ТРИС)-фосфатного буфера с рН 8,5, нерастворимую клеточную составную часть яда фильтруют на фильтре с величиной пор 0,2 мкм. Получаемый прозрачный желтый раствор удельной активности 60 ед. , определенной оптической плотностью при 280 нм наносят на хроматографическую колонку, которая имеет диаметр 1,6 см и заполнена до высоты 30 см слоем содержащей диэтиламиноэтиловые группы сефарозы ФФ (фирма Pharmacia). Тромбиноподобные энзимы яда, также как и протеины с изоэлектрическими значениями в кислой области, связываются (адсорбируются) на матрице. Хроматографию проводят при скорости протока 200 мл/час. Посредством промывания колонки при комнатной температуре примерно 300 мл равновесного буфера (10 мМ ТРИС-фосфатного буфера с рН 8,5) до значения оптической плотности элюата ниже 0,5 при 280 нм и последующего промывания примерно 300 мл 35 мМ ТРИС-фосфатного буфера с рН 6,0 до оптической плотности элюата <0,4 при 280 нм элюируют приблизительно 70% посторонних протеинов (рассчитано на оптическую плотность исходного раствора при 280 нм). Основную фракцию с батроксобином удельной активности 230 ед., определенной оптической плотностью при 280 нм элюируют с 70% выходом в 180 мл 150 мМ ТРИС-фосфатного буфера с рН 6,0.

б) Основная очистка
Элюат, который содержит батроксобин, концентрируют до 18 мл с помощью ультрафильтрации на мембране с разделительным пределом 10000 Дальтон и к нему добавляют 100 мМ ТРИС-фосфатного буфера с рН 8,0. Этот раствор наносят на колонку, которая имеет диаметр 1,6 см и заполнена до высоты 15 см пористым стеклом BIORAN (фирма Шотт, диаметр пор 30±5 нм, размер зерен 30-60 мкм). Промыванием колонки при комнатой температуре 115 мл 100 мМ ТРИС-фосфатного буфера с рН 8 и скорости протока 200 мл/час с колонки элюируют около 50% посторонних протеинов (рассчитано на оптическую плотность нанесенного раствора при 280 нм).

Для элюирования батроксобина используют 750 нм раствора хлорида натрия, к которому добавляют 100 мМ ТРИС-фосфата до значения рН 8. Элюат автоматически снимают с колонки в виде фракций, каждая объемом приблизительно 6 мл.

Получают 2 пика, каждый объемом 38 мл, причем первый пик содержит в основном чистый батроксобин удельной активности 1877 ед., определенной оптической активностью при 280 нм. Следовательно, данным обратнофазной высокопроизводительной жидкостной хроматографии посторонние протеины имеются лишь в незначительных количествах. Получают батроксобин чистотой 92,2% с выходом 60,4%.

в) Тонкая очистка
I. С помощью гель-хроматографии.

Элюат, включающий основной компонент батроксобин (пик 1), концентрируют до 2 мл ультрафильтрацией на мембране YM 10 (фирмы Амикон) и получаемый концентрат подают на колонку, имеющую диаметр 1,6 см и заполненную до высоты 85 см слоем Сефакрил S-100 НR. Колонку предварительно уравновешивают с помощью буфера 100 мМ хлористого натрия и 100 мМ фосфата натрия, имеющего рН 6,9. В результате данной гель-хроматографии от батроксобина отделяют остальные низкомолекулярные протеазы и ТРИС. Выход батроксобина составляет более 95% (в расчете на активность фибриногеназы в исходной массе). Согласно данным электрофореза на додецилсульфате натрия и обратнофазной высокопроизводительной жидкостной хроматографии получают единый продукт удельной активности 1805 ед., определенной оптической плотностью при 280 нм. Согласно данным обратнофазной высокопроизводительной жидкостной хроматографии продукт имеет чистоту более 98%. Он свободен от оксидазы L-аминокислот, фактора поперечной сшивки, геморагинического фактора (определенного как гемолитическая активность) и протеаз с активностью CPN-азы. Примесь представляет собой различные гликозилированные изоэнзимы батроксобина.

II. С помощью пористого стекла
Так как второй пик "основного" разделения с помощью пористого стекла BIORAN имеет еще активность фибриногеназы, данный элюат удельной активности лишь 421 ед., определенной оптической плотностью при 280 нм концентрируют до 8,5 мл с помощью ультрафильтрации на мембране с разделительным пределом 10000 Дальтон и к получаемому концентрату добавляют 100 нМ ТРИС-фосфатного буфера с рН 5,0. Получаемый раствор подают на колонну, имеющую диаметр 1,6 см и заполненную до высоты 15 см слоем пористого стекла BIORAN (фирма Шотт; диаметр пор 100±5 нм, размер зерен 30-60 мкм). Данную колонну предварительно уравновешивают 100 нМ ТРИС-фосфатного буфера с рН 5,0. Батроксобин непосредственно элюируют равновесным буфером из "кислой" колонки, имеющей слой пористого стекла, тогда как основные посторонние протеины снимают с колонки только путем промывки 750 мМ хлористого натрия и 100 мМ ТРИС-фосфатного буфера с рН 8,0. Батроксобин удельной активности примерно 2000 ед., определенной оптической плотностью при 280 нм получают с выходом 89% (в расчете на поданные единицы фибриногеназы). Как удельная активность, так и изоэлектрическое фукусирование свидетельствуют о наличии высокочистого, единого продукта.

Согласно примеру 1 в результате тонкой очистки анкрод получают с чистотой более 97%. В качестве примеси анкрод включает только изоэнзимы.

Предложен способ очистки тромбиноподобных протеаз из змеиного яда. Протеазу в виде сырого продукта подвергают предварительной очистке с помощью афинной хроматографии или хроматографии на основных ионообменниках. Полученную фракцию с тромбиноподобными протеазами подвергают хроматографии на слабых катионообменниках или разделяют с помощью адсорбции на стекле в основной области. Основной компонент подвергают гель-хроматографии или очищают с помощью хроматографии на стекле в кислой области, причем по меньшей мере одна из стадий включает разделение с помощью хроматографии на стекле. Способ позволяет получить тромбиноподобные протеазы с высокой степенью чистоты. 2 з.п. ф-лы.

1. Способ очистки тромбиноподобной протеазы из змеиного яда, отличающийся тем, что а) протеазу в виде сырого продукта подвергают предварительной очистке с помощью афинной хроматографии или хроматографии на основных ионообменниках, б) полученную таким образом фракцию с тромбиноподобными энзимами подвергают хроматографии на слабых катионообменниках или разделяют с помощью адсорбции на стекле в основной области и в) основной компонент со стадии б) подвергают гель-хроматографии или очищают с помощью хроматографии на стекле в кислой области, причем по меньшей мере одна из стадий б) или в) включает разделение с помощью хроматографии на стекле. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что стадию б) проводят с помощью адсорбции на стекле, а стадию в) посредством гель-хроматографии. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что хроматографию на стадиях б) и в) проводят на стекле.