СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОВЕРХНОСТНОГО АНТИГЕНА ВИРУСА ГЕПАТИТА В ИЗ РЕКОМБИНАНТНЫХ КЛЕТОК ДРОЖЖЕЙ HANSENULA POLYMORPHA И ВАКЦИНА ДЛЯ ИММУНИЗАЦИИ ПРОТИВ ГЕПАТИТА В Российский патент 2003 года по МПК A61K39/29 C07K14/02 

Настоящее изобретение относится к области медицины, а именно к способам получения поверхностного антигена вируса гепатита В из рекомбинантных клеток дрожжей.

Гепатит В до настоящего времени является одним из наиболее опасных и распространенных заболеваний, которое сложно предупредить из-за того, что организм человека длительное время может быть скрытым носителем вируса гепатита В. Заражение гепатитом В часто развивается в цирроз печени и печеночно-клеточный рак, что может привести к смерти.

На борьбу с этим заболеванием были направлены работы ученых-вирусологов всего мира. В результате кропотливого многолетнего труда были созданы вакцины, позволяющие бороться с гепатитом В, и способы получения этих вакцин.

Первое поколение вакцин против гепатита В получили отделением и очисткой поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg) из плазмы крови больных гепатитом В (V.R.Hilleman и др. Develop. Bio Stendart, 54, 3-12, 1983). Способы получения вакцины из плазмы крови требуют больших затрат и очень трудоемки. Кровь не является идеальным источником сырья для получения вакцин, т. к. может содержать патогены других заболеваний, что может привести к заражению во время прививок.

Следующее поколение вакцин против гепатита В получено на основе рекомбинантных продуцентов (в основном бактерий и дрожжевых грибов). Наиболее известна в нашей стране вакцина Энджерикс-В (Регистр лекарственных средств России, Энциклопедия лекарств, изд.6, Москва "РЛС-200", 1999, стр. 1037), 1 доза суспензии которой содержит очищенный основной поверхностный антиген вируса гепатита В, полученный с помощью технологии рекомбинантных ДНК и адсорбированный на гидроксиде алюминия. Vilenguela и др. разработали способ получения HBsAg в дрожжах (Nature, 293,347-350,1982). Полученный из дрожжей рекомбинантный HBsAg (rHBsAg) состоит преимущественно из S белка (Р25), имеющего 226 аминокислот и при очистке образующего частицы поверхностного антигена, идентичные частицам HBsAg, отделенным от плазмы крови.

Недостатками получения рекомбинантного HBsAg из дрожжей Saccharomyces cerevisiae является низкая продуктивность продуцентов данного вида и сопряженная с этим сложность и трудоемкость методов очистки.

В настоящее время среди способов получения вакцин наибольшую известность получили способы, описанные в патентах Кореи 065305 и США 4742158.

В патенте США 4742158 (С 07 К 3/20, 3/28, А 61 К 39/29, НКИ 530-371) описан способ получения антигена гепатита В, включающий подготовку дрожжевого экстракта при наличии различных ингибиторов протеазы, очистку из него поверхностного антигена серией стадий колоночно-хроматографического отделения с использованием аффинной колонны, в которой полимер альбумина человеческой сыворотки прикреплен к гелевой матрице, а также гидрофобной колонны с элюированием ПАВ. Способ, описанный в патенте Кореи, включает индуцированную сдвигом рН преципитацию и колоночные хроматографии на ангидриде кремния и анионном обмене. Недостатками способов являются: низкий выход целевого продукта, низкая степень очистки целевого продукта, возможность повреждения нативной структуры HBs-антигена при значительных сдвигах рН в процессе выделения.

Наиболее близким из известных способов является способ (п. 2122430, Россия, МКИ 6 А 61 К 39/29, С 12 Р 21/00, 21/02,з. 08.12.95 -прототип), включающий инкубирование рекомбинантных клеток дрожжей в буфере, содержащем хаотропный агент, добавление ПАВ к гомогенату клеток, центрифугирование гомогената клеток, гидрофобную хроматографию, гель-фильтрацию фракции, содержащей поверхностный антиген, с последующим получением фракции, содержащей целевой продукт.

Недостатком способа является то, что для первой очистки используется метод адсорбции/десорбции на кремнийсодержащем носителе, что приводит к контаминации полупродукта денатурированными фрагментами HBs-антигена и посторонними примесями, а в гидрофобной хроматографии используют токсичный этиленгликоль.

Целью настоящего изобретения является создание способа получения поверхностного антигена вируса гепатита В (HBs-антигена). Поставленная цель достигается тем, что в способе получения HBs-антигена из рекомбинантных клеток дрожжей, включающем культивирование рекомбинантных клеток дрожжей, разрушение клеток в буфере, содержащем хаотропный агент, солюбилизацию целевого антигена добавлением ПАВ, центрифугирование гомогената клеток, гидрофобную хроматографию, гель-фильтрацию фракции, содержащей поверхностный антиген, с последующим получением фракции, содержащей целевой продукт, перед операцией гель-фильтрации проводят гидрофобную хроматографию и ультрацентрифугирование в градиенте плотности калия бромида, стадию гидрофобной хроматографии проводят в буфере, содержащем 8-14% этанола, отмывку проводят тем же буфером при температуре 30^oС, элюцию проводят тем же буфером при температуре 40-42^oС, гель-фильтрацию проводят на кополимерном носителе, а в качестве исходного материала используют рекомбинантные клетки дрожжей Hansenula polymorpha.

Способ осуществляется следующим образом.

Пример 1.

Стадия 1. Культивирование дрожжевой клетки.

Рекомбинантные клетки HP (штамм DL-U/pH-HBs), которые способны экспрессировать HBs-антиген, культивируют при температуре 30^oС в 7,5 литрах среды YEPD (1% дрожжевой экстрат, 2% дрожжевой пептон, 1,6% глюкоза), обогащенной метанолом (до 1.5%).

Стадия 2. Разрушение дрожжевой клетки.

20 г полученной в стадии 1 дрожжевой клеточной массы смешивают с 250 мл буфера для разрушения (0,1 М натрия фосфат, рН 7,4; 4 М мочевина; 0,2 М хлорид натрия; 20 мМ этилендиаминтетрауксусная кислота). Смесь охлаждают до температуры +2^oС на ледяной бане и подают при постоянном перемешивании со скоростью 10-15 мл/мин в гомогенизатор APV Gaulin. Камеру гомогенизатора постоянно охлаждают подачей водно-метанольной смеси с температурой -10^oС.

Стадия 3. Экстракция и солюбилизация HBs антигена.

Клеточный гомогенат, полученный в стадии 2, промывают дистиллированной водой с помощью двукратного центрифугирования. К полученному промытому осадку добавляют 0,2% (вес/объем) дезоксихолата натрия; смесь перемешивают на льду в течение 1 часа. Затем смесь центрифугируют 45 минут при 10000 g и температуре 4^oС для удаления клеточных остатков. Суммарный объем полученного супернатанта составляет около 1000 мл.

Стадия 4. Гидрофобная колоночная хроматография.

Супернатант, содержащий солюбилизированный антиген со стадии 3, наносят на хроматографическую колонку сечением 50 мм, заполненную 1500 мл геля фенил-агарозы, предварительно уравновешенную буфером для гидрофобной хроматографии (0,1 М карбонат натрия, рН 9,2+мочевина 6 М). Колонку промывают 4500 мл буфера для гидрофобной хроматографии с добавлением 8-14% этанола с температурой 20-25^oС. Далее отмывку продолжают тем же буфером, подогретым до температуры 30^oС. Контроль за полнотой промывки ведется по показаниям оптической плотности и определениям гидрофобных компонентов (белка) по методу Брэдфорд. Отмывку прекращают, когда:
1) температура раствора в 50-мл фракции элюата составляет более 28^oС или
2) оптическая плотность при длине волны 280 нм составляет менее 0,075 или
3) мнимая концентрация белка при определении по методу Брэдфорда при использовании человеческого альбумина в качестве калибратора составляет менее 50 мкг/мл.

Далее связавшийся на колонке материал элюируют буфером для гидрофобной хроматографии, предварительно подогретым до температуры 40-42^oС. Весь объем элюата (около 350 мл) собирают и охлаждают на ледяной бане; образовавшийся при этом осадок отделяют центрифугированием и отбрасывают.

Стадия 5. Ультрацентрифугирование в градиенте плотности.

Градиент плотности калия бромида формируют путем внесения раствора в диапазоне плотности от 1,025 до 1,200 в зональный ротор Ti-45 ультрацентрифуги Beckman Optima LC70K. Препарат элюата с гидрофобной колонки, полученный на стадии 4, переводят методом ультрафильтрации в 0,1М фосфатный буфер с рН 8,0, содержащий 0,2 М натрия хлорида, и концентрируют до концентрации по белку не более 2500 мкг/мл. Концентрированный элюат наносят на градиент в зональном роторе и центрифугируют 20 часов при 30000 об/мин при температуре 4^oС. По окончании центрифугирования фракции, собранные в зональном роторе, анализируют на содержание HBs-антигена методом ИФА (HBs-АГ ИФА Рекомбибест, ЗАО Вектор-Бест, п. Кольцово, Новосибирская область, Россия). Количество HBs-антигена в данном препарате по данным метода ИФА составляет около 2500 мкг.

Пример 2 (сравнительный пример).

Повторяют те же процессы, что и в примере 1, но в другой модификации стадии 4. Вместо гидрофобной колоночной хроматографии препарат лизата со стадии 3 переводят методом ультрафильтрации в 0,1 М фосфатный буфер с рН 8,0, содержащий 0,2 М натрия хлорида, и концентрируют до концентрации по белку не менее 2500 мкг/мл. Количество HBs-антигена вакцины гепатита В в данном препарате по данным метода ИФА составляет около 2100 мкг.

Как показывает данный пример, включение этапа гидрофобной хроматографии позволяет увеличить выход антигена вакцины гепатита В из рекомбинантных клеток дрожжей Hansenula polymorpha.

Пример 3.

Стадия 1. Культивирование дрожжевой клетки.

Рекомбинантные клетки Hansenula polymorpha (штамм DL-U/pH-HBs), которые способны экспрессировать HBs-антиген, культивируют при температуре 30^oС в 6,0 литрах среды YEPD (1% дрожжевой экстрат, 2% дрожжевой пептон, 1,6% глюкоза), обогащенной метанолом (до 1,5%).

Стадия 2. Разрушение дрожжевой клетки.

50 г полученной в стадии 1 дрожжевой массы ресуспендируют в дистиллированной воде, делят на 5 равных объемов и смешивают с 50 мл буфера для разрушения (0,1М натрия фосфат, рН 7,4 + 4 М мочевина + 0,2 М хлорид натрия + 20 мМ этилендиаминтетрауксусная кислота). Смесь охлаждают до температуры 2^oС на ледяной бане и подают при постоянном перемешивании со скоростью 10-15 мл/мин в гомогенизатор APV Gaulin. Камеру гомогенизатора постоянно охлаждают подачей водно-метаноловой смеси с температурой -10^oС.

Стадия 3. Экстракция и солюбилизация HBs-антигена.

Клеточный гомогенат, полученный в стадии 2, промывают дистиллированной водой с помощью двукратного центрифугирования. К полученному промытому осадку добавляют 0,1% (вес/объем) дезоксихолата натрия и 10% сульфата аммония; смесь перемешивают на льду в течение 1 часа. Добавление сульфата аммония приводит к осаждению ионов тиоцината. Затем смесь центрифугируют при температуре 4^oС для удаления осадков. Суммарный объем полученного супернатанта составляет около 700 мл.

Стадия 4. Гидрофобная колоночная хроматография.

Супернатант, содержащий солюбилизированный антиген со стадии 3, наносят на хроматографическую колонку сечением 50 мм, заполненную 1500 мл геля фенил-агарозы, предварительно уравновешенную буфером для гидрофобной хроматографии (0,2 М карбонат натрия, рН 9,2 + мочевина 6 М). Колонку промывают 4500 мл буфера для гидрофобной хроматографии с добавлением 8-14% этанола с температурой 30^oС. Контроль за полнотой промывки ведется по показаниям оптической плотности и определением гидрофобных компонентов (белка) по методу Брэдфорд. Отмывку прекращают, когда
1) температура раствора в отобранной фракции элюата составляет более 28^oС или
2) оптическая плотность при длине волны 280 нм составляет менее 0,07 или
3) мнимая концентрация белка при определении по методу Брэдфорд при использовании человеческого альбумина в качестве калибратора составляет менее 50 мкг/мл.

Связанный с колонкой материал элюируют буфером для гидрофобной хроматографии, предварительно подогретым до температуры 40-42^oС. Весь объем элюата (около 350 мл) собирают и охлаждают на ледяной бане; образовавшийся при этом осадок отделяют центрифугированием и отбрасывают.

Стадия 5. Ультрацентрифугирование в градиенте плотности.

Градиент плотности калия бромида формируют путем внесения раствора в диапазоне плотности от 1,025 до 1,200 в зональный ротор Ti-45 ультрацентрифуги Beckman Optima LC70K. Препарат элюата с гидрофобной колонки, полученный на стадии 4, переводят методом ультрафильтрации в 0,1 М фосфатный буфер с рН 8,0, содержащий 0,2 М натрия хлорида, и концентрируют до концентрации по белку не более 2500 мкг/мл.

Концентрированный элюат наносят на градиент в зональном роторе и центрифугируют 20 часов при 30000 об/мин при температуре 4^oС. По окончании центрифугирования фракции, собранные в зональном роторе, анализируют на содержание HBs-антигена методом ИФА (HBs-АГ ИФА ИмБио, Нижний Новгород, Россия). Фракции, содержащие менее 100 мкг/мл иммунореактивного антигена, объединяют и переводят методом ультрафильтрации в 0,1 М фосфатный буфер, рН 8,0, содержащий 0,2 М натрия хлорида. Средний объем полученного препарата составляет 400 мл.

Стадия 6. Гель-фильтрация на колонке с кополимерным носителем Toyopearl HW65F.

5 литров предварительно промытого кополимерного носителя для гель-фильтрации Toyopearl HW65F вносят в колонку сечением 100 мм и уравновешивают ее фосфатным буфером (рН 8,5), содержащим 0,3 М хлорида натрия. Препарат, полученный на стадии 5, вносят в колонку и элюируют его тем же буфером с контролем фракций объемом 50 мл на содержание и электрофоретическую чистоту HBs-антигена. Содержание HBs-антигена определяют методом ИФА (HBs-АГ ИФА ИмБио, Нижний Новгород, Россия). Фракции, содержащие HBs-антиген в концентрации не менее 100 мкг/мл и чистоту белка не менее 95%, объединяют, фильтруют через стерилизующий фильтр и хранят при температуре 4^oС.

Пример 4 (сравнительный пример).

Повторяют те же процессы, что и в примере 3, но в другой модификации стадии. Вместо кополимерного носителя Toyopearl HW65F используют колонку с 5 л агарозного носителя Sephacryl CL-4B сечением 100 мм, уравновешенную фосфатным буфером (рН 8,5), содержащим 0,3 М хлорида натрия. Препарат, полученный на стадии 5, вносят в колонку и элюируют его тем же буфером с контролем фракций объемом 50 мл. на содержание и электрофоретическую чистоту HBs-антигена. Содержание HBs-антигена определяют методом ИФА (HBs-АГ ИФА ИмБио, Нижний Новгород, Россия). Фракции, содержащие HBs-антиген в концентрации не менее 100 мкг/мл и чистоту белка не менее 95%, объединяют, фильтруют через стерилизующий фильтр и хранят при температуре 4^oС (см. табл. 1).

Как показывает данный пример, кополимерный носитель для гель-фильтрации Toyopearl является предпочтительным для стадии тонкой очистки препарата rHBs-антигена из рекомбинантных клеток Hansenula polymorpha штамма DL-U/pH-HBs
Пример 5.

Стадия 1. Формулирование вакцины.

850 микролитров (200 микрограммов) препарата HBs-антигена, полученного согласно способу, описанному в примере 3, развели в 9500 мкл 0,1 М фосфатно-солевого буфера (ФБС) с рН 7,2, содержащего 0,15 М натрия хлорид, и интенсивно перемешали на вихревом смесителе в течение 5 минут. Суспензию адъюванта Alhydrogel 3% (Brenntag Nordic, Дания) интенсивно перемешали на вихревом смесителе в течение 5 минут. К полученной смеси при постоянном перемешивании добавили по каплям 500 микролитров суспензии адъюванта Alhydrogel 3% (Brenntag Nordic, Дания), предварительно интенсивно перемешанную на вихревом смесителе в течение 5 минут. Затем смесь инкубировали в течение 4 часов при перемешивании при 100 об/мин. По окончании инкубации к смеси добавили мертиолат до конечной концентрации 50 мкг/мл. Формулированную вакцину хранили при температуре 4-8^oС до использования (не более 6 месяцев).

Стадия 2. Приготовление разбавлений вакцины и препарата сравнения.

Препаратом сравнения служила вакцина Engerix В (Glaxo Smith Kline), взрослая дозировка, 20 мкг/мл суспензии. Для получения разбавляющей жидкости к 10 мл ФБС добавили 500 микролитров суспензии адъюванта Alhydrogel 3% (Brenntag Nordic, Дания). Препарат сравнения и препарат, приготовленный на стадии 1, разбавили разбавляющей жидкостью в 10, 50, 250 и 1250 раз. Полученные разбавленные вакцинные препараты и разбавляющую жидкость (отрицательный контроль) температуре 4-8^oС до использования (не более 2 недель).

Стадия 3. Иммунизация мышей.

Контроль проводили на 9 группах мышей линии Balb/c (самок возрастом 10-12 недель), по 10 животных в группе. Каждой группе иммунизацию проводили одним из 4 разведений испытуемого препарата или препарата сравнения, а также отрицательным контролем. Животным однократно вводили внутрибрюшинно по 1,0 мл разбавленных вакцинных препаратов. На 28-е сутки после иммунизации животных обескровили. Полученные сыворотки (отдельно от каждого животного) хранили при температуре -20^oС до контроля (не более 5 суток).

Стадия 4. Оценка иммунного ответа у мышей.

Уровень специфического антиHBs ответа у мышей определили с помощью иммуноферментной тест-системы производства ЗАО Вектор-Бест (Россия) согласно инструкции изготовителя. Учитывали два показателя:
4.1) качественный результат (положительная или отрицательная сыворотка согласно инструкциям изготовителя); в каждой группе рассчитывали процент сероконверсии (процент животных, давших положительную реакцию);
4.2) количественный результат оптическая плотность (ОП) в лунке, соответствующей данной сыворотке); в каждой группе рассчитывали среднюю ОП и стандартное отклонение. Результаты приведены в таблице 2.

Из данных таблицы следует, что иммуногенность препарата HBs-антигена практически идентична иммуногенности препарата сравнения и по проценту сероконверсии во всех разведениях, и по относительной интенсивности иммунного ответа.

Пример 6.

Вакцина для иммунизации против гепатита В содержит:
поверхностный антиген препарата НВs - 20±2 мкг/мл,
адъювант - 1,5±0,1 мкг/мл.

Из приведенных выше материалов видно, что предлагаемый способ имеет ряд преимуществ:
- отсутствует использование токсичного компонента-этиленгликоля, а используется этанол, являющийся менее токсичным;
- применение ультрацентрифугирования уменьшает риск появления нежелательных примесей в препаратах,
- уменьшается трудоемкость в целом стадии очистки препарата.

Изобретение относится к области медицины, а именно к способу получения поверхностного антигена вируса гепатита В из рекомбинантных клеток дрожжей Hansenula polymorpha, и может быть использовано в биотехнологии для приготовления вакцины против гепатита В. Сущностью способа является культивирование рекомбинантных клеток дрожжей, разрушение клеток в буфере, содержащем хаотропный агент, добавление ПАВ к гомогенату клеток, центрифугирование гомогената клеток, гидрофобная хроматография и ультрацентрифугирование в градиенте плотности калия бромида, гель-фильтрация фракции, содержащей поверхностный антиген, причем гидрофобную хроматографию проводят в буфере, содержащем 8-14% этанола, отмывку проводят тем же буфером с температурой 30^oС, элюцию проводят тем же буфером с температурой 40-42^oС, а гель-фильтрацию проводят на кополимерном носителе. Препарат поверхностного антигена rHBs, полученного из рекомбинантных клеток дрожжей Hansenula polymorpha, применяют для приготовления вакцины для иммунизации против гепатита В. Техническим результатом является усовершенствование способа получения поверхностного антигена вируса гепатита В. 2 с.п. ф-лы, 2 табл.

1. Способ получения поверхностного антигена вируса гепатита В из рекомбинантных клеток дрожжей, включающий культивирование рекомбинантных клеток дрожжей, разрушение клеток в буфере, содержащем хаотропный агент, добавление ПАВ к гомогенату клеток, центрифугирование гомогената клеток, гидрофобную хроматографию, гель-фильтрацию фракции, содержащей поверхностный антиген, с последующим получением фракции, содержащей целевой продукт, отличающийся тем, что в качестве исходного сырья используют рекомбинантные клетки Hansemula polymorpha (штамм DL-U/pH-HBs), перед операцией гель-фильтрации проводят гидрофобную хроматографию и ультрацентрифугирование в градиенте плотности калия бромида, при этом во время гидрофобной хроматографии осуществляют промывание буфером, содержащим 8-14% этанола, дополнительную отмывку проводят тем же буфером с температурой 40-42^oС, а гель-фильтрацию проводят на кополимерном носителе Toyopearl HN65F. 2. Вакцина для иммунизации против гепатита В, включающая поверхностный антиген вируса гепатита В, продуцированный рекомбинантой клеткой дрожжей и адъювант, отличающаяся тем, что в качестве антигена вируса гепатита В используют поверхностный антиген, полученный по п. 1, в эффективном количестве.