Способ получения дигиталис-антител Советский патент 1989 года по МПК A61K39/395 

.1

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунохимии и касается способа получения дигиталис-антител.

Целью изобретения является повышение специфичности антител и сте- 5 пени очистки от эндотоксинов.

Пример 1. Получение овечьей антидигоксиновой сыворотки.

Иммуноген.

Дигоксин-глутарип-о-оксисукцини- 10 МИД в водном растворе вводится во взаимодействие с протеином, особенно с бычьим глобулином или эдестином (протеином из семян конопли). После отделения избытка производного диго- 5 ксина несколько молекул дигоксина на молекулу протеина с концевой дигитоксозой через глутарильную цепь связьшаются с протеином.

: Иммунизация,

0,5 мг дигоксин-иммуногена в полном аднованте Фрейнда вводятся внутрикожно здоровым овцам весом не менее 45 кг Сначала через кахдые

2 недели и затем через каждые 4 недели иммуноген в таком же носителе снова вводится внутримьш1ечно и подкожно для повышения иммуноответа. Спустя 2-4 мес достигается титр в сыворотке животных 1 мг дигоксин- специфического иммуноглобулина/ип,

Отбор сьшоротки, аналитика, образование пула.

4i СП

ел

со со со

см

У здоровых животных, которые достигли при отборе пробы указанного титра, минимально в течение года «гженедельно можно отбирать кровь из шейной вены. В выборочных пробах отбора постоянно контролируется титр с помощью радиоиммунного .теста или с помощью ферментоиммунного теста. Константы связывания также определяются в выборочных пробах путем оценки связьгоания радиоактивно марки 1 ованного дигоксина путем определен- йых разбавлений антисывороточных Проб. В соответствии с литературой получаются величины 5х10 -5х10 л/моль Дпя того чтобы поддерживать по воз- 1 ожности незначительными колебания

составе используемой для выделения МБ-фрагментов антисыворотки, собираются количества 20-50 л из отдельных отборов нескольких овец.

2с Приготовление иммуносорбента.

Содержащее амино-группы стекло.

Дпя удаления мелких частиц и при- 25 ют этанолом, водой, этанолом, затем

месей 940 г пористого стекла с поверхностью 10 м /г обрабатывают в водной суспензии ультразвуком, затем нагревают в течение 3 ч в среде 65%-ной азотной кислоты при 80-90°С. 1|осле вымьшания кислоты стекло высу- ф1вают при 150 С. Очищенное стекло Медленно с обратным холодильником перемешивается в 2,7 г безводного даметилсульфоксида с 300 мл 3-(три- Этоксисш1ил)пропиламина в течение 20 ч при 85°С. Избыточный силилаьшн вымывается изопропанолом и аминиро- Нанное стекло снова высушивается .(60 С, небольшой вакуум). Выход Примерно 1,8 г аминопропильного стекла (750 г).

Окисление дигитоксина.

6 г дигитоксина в 450 мл смеси ; танола с водой (2:1) подвергают изаимодействию со стехиометрически равным количеством перистата натрия . (1,7 г) в течение 20 ч при комнатной температуре. Нерастворимый осадок отфильтровывают и удаляют. Надоса- дочную жидкость упаривают досуха на ротационном испарителе. Остаток про- ьйгаается 2x100 мл воды, затем высу- пивается в вакууме над хлоридом каль- 1|ия. Бькод 4-5 г ксина.

Адсорбент дигитоксин-стекло.

4,5 г окисленного дигитоксина растворяют в 2,25 л смеси этанола

высушивают в слабом . Выход 1,8 г иммуносорбента.

Подготовка иммуносорбента для непосредственного употребления.

30 Сорбент суспендируют в буфере А (50 ммоль фосфата с рН-7,0/0,15 М хлористого натрия/0,1% азида натрия), подают в стеклянную колонку с фриттой и последовательно промывают

2g раствором 0,5 М хлористого на трия и 0,05%-ного твина-20, бидистиллированной водой и 1 М пропионовой кислотой, наконец, уравновешивается буфером А. Использованный иммуносор40 бент регенерируют путем промывки 1 М пропионовой кислотой, после чего хра-. нят в буфере А при 4 Со Сорбент можно использовать многократно. Непосредственно перед употреблением

45 свежий сорбент предварительно промывают

Зо Получение овечьего антидигок- син-ФАБ-фрагментов.

Используемые растворы .стерилизуют

5Q в автоклавах или путем мембранной фильтрации. Используемая для приготовления растворов вода пирогеносво- бодна за счет дистилляции Емкости,

приборы, а также другие вспомогатель- окисленного дигито- gg ные материалы (например материалы

для хроматографии) становятся пиро- генно-свободными за счет нагревания или же путем обработки 0,3 М гидроокиси натрия.

с водой (2:1), смешивают с 750 г аминопропильного стекла и медленно перемешивают в течение 20 ч при ком- натной температуре. Стекло отфильт- ровьшают. Дигитоксин определяют путем измерения экстинкции в УФ-облас- ти (260 нм) и по полученным данным вычисляют количество фиксированного 0 дигитоксина (заданное значение: 3 мг дигитоксина на мл объема стекла). 4 г боргидрата натрия растворяют в

1л бидистиллированной воды, разбавляют 2 л этанола и подают на модифи5 шфованное дигитоксином стекло. При многократных встряхиванршх в течение

2ч при комнатной температуре устанавливают рН 7,0-7,4 путем добавления 2 мМ соляной кислоты. При этом

0 сначала фиксированному на стекле через лабильные связи типа шиффового основания дигитоксину сообщается прочная степень фиксации. Полученный иммуносорбент тщательно промывавысушивают в слабом . Выход 1,8 г иммуносорбента.

Подготовка иммуносорбента для непосредственного употребления.

30 Сорбент суспендируют в буфере А (50 ммоль фосфата с рН-7,0/0,15 М хлористого натрия/0,1% азида натрия подают в стеклянную колонку с фриттой и последовательно промывают

2g раствором 0,5 М хлористого на трия и 0,05%-ного твина-20, бидистиллированной водой и 1 М пропионовой кислотой, наконец, уравновешивается буфером А. Использованный иммуносор40 бент регенерируют путем промывки 1 М пропионовой кислотой, после чего хр нят в буфере А при 4 Со Сорбент можно использовать многократно. Непосредственно перед употреблением

45 свежий сорбент предварительно промывают

Зо Получение овечьего антидигок- син-ФАБ-фрагментов.

Используемые растворы .стерилизуют

5Q в автоклавах или путем мембранной фильтрации. Используемая для приготовления растворов вода пирогеносво- бодна за счет дистилляции Емкости,

800 мл концентрируют путем ультрафильтрации до объема 150 мл, затем диализуют по отношению к буферу (15 Мм фосфата, рН 7,5/0,15 М хлористого натрия).

Хроматографию повторяют для второ части ФАБ-лиофилизата на той же колонке. Обе хроматографированные части снова объединяют для дальнейшего использования. Промежуточное хранение первой части осуществляют при -20°С.

Пропускание через ионообменник ().

400 мл целлюлозы марки DE-52 (пре варительно обработанной 0,5 н НС1 и 0,5 н. NaOH для стерилизации и освобождения от пирогена) подают в колонку и уравновешивают 10 ммоль фосфатного буфера с рН-7,1. ФАВ-про- теин с предь ущей. стадии путем ультрафильтраций доводят до концентрации 50 мг/мл и затем пропускают через колонку. ФАБ-протеин вытекает почти незамедлительно, следы посторонних протеинов, (например альбумина, ФС- фрагменты и т,д.) удерживаются. ФАБ- протеин в стоке собирают, в случае необходимости концентрируют путем ультрафильтрации до 15-20 мг протеина/мл, на электроде значение рН доводят до 7,0-7,1 и стерильно фильт |руют через мембранный фильтр с вели- чиной 0,2 ммк. Конечньй выход 5-6 г овечьего анти.цитоксинового ФАБ. Отфильтрованный стерильно целевой продукт заливают в стеклянные емкости при отсутствии микроорганизмов и хранят при .

Дигиталис-антитела, получаемые в примере 1, содержат 84,8 мг белков в ампуле и имеют связывающую емг кость, равную 0,013 мг дигоксина/мг ФАБ-фрагментов. Кроме того, содержание эндотоксина (белковой примеси, которая может вызвать лихорадку и аллергические эффекты) в ампуле составляет 0,22 единицы. Дигиталис- аититела, получаемые известным способом, имеют следующие качества: содержание белков 43,8 мг; связьшающая емкость 0,011 мг дигоксина/мгФАБ- фрагментов; содержание эндотоксина в ампуле 12,8о

Сравнение данных по связьшакнцей емкости, являющейся мерой специфичности дигиталис-антител, свидетельствует о том, что получаемые предла

5

0

5

0

5

0

5

0

5

гаемым способом антитела имеют специфичность, которая ка 18,2% превьшает специфичность антител, получаемых известным способом.

Кроме того, получаемые предлагаемым способом антитела также имеют более высокую степень чистоты, о чем свидетельствует сравнение данных по содержанию эндотоксина (см.таблицу).

Пример 2. Повторяют пример 1, с той лишь разницей, что в разделе 2 используют силикагель с поверхностью 20 . При этом очистку исходного силикагеля осуществляют путем трехкратного суспендиро- вания в 2 л слабо подкисленной азотной кислотой воды с последующим декантированием мелких компонентов на каждой- стадии. Получаемые дигиталис- антитела имеют то же качество, что и антитела примера 1.

Пример 3 о Повторяют пример 1, с той лишь разницей, что в разделе 2 используют гель окиси алюминия с поверхностью 1 м /г. При этом очистку исходного скликагеля осуществляют путем трехкратного суспендирования в 2 л слабо подкисленной азотной кислотой воды с последующим декантированием мелких компонентов на каждой стадии. Кроме того, иммуносорбент используют в разделе 3 в количестве 5,0 л. Получаемые дигиталис-антитела имеют те же качества, что и антитела примера 1.

Пример 4 о Повторяют пример 1 с той лишь разницей, что стадию элюации ФАБ-фрагментов осуществляют: а) 3 ммоль водной фосфорной кислоты или б) 5 ммоль водной уксусной кислоты, или в) 2 ммоль водной серной кислоты.

Получаемые при этом дигиталис- антитела имеют те же качества, что и антитела примера 1.

Пример 5. Повторяют пример 1, однако в качестве растворителя для адсорбции, и расщепления папаином пр1да:еняют лишь буферный раствор ацетата натрия и уксусной кислоты (0,5 М, рН 6,0). Расщепление папаином проводят тем, что раствор 240 мг папаина в 2 л этого буфера подают прямо на колонку, при этом жидкость пропускают приблизительно за 30 мин и непосредственно после этого пропускание прекращают и раствор еще 5 ч загружают колонку. Непо5

Предварительная очистка овечьей антидигоксиновой сьгооротки,,

30 л антисывсротки перемешивают в течение 1 ч при комнатной температуре вместе с 300 г аэрозоля для удаления липопротеинов, После отделения аэрозоля путем центрифугирования из охлажденной до А°С надосадочной жидкости путем добавки твердого сульфата аммония до концентрации 1,8 М осаждают гамма-глобулины. Путем центрифугирования собирают осадок, растворяют в растворе 0,15 М хлорида натрия (0,1% азида) и диали зуют по отношению к буферу (15 мМ фосфата, рН 7,1/50 мМ хлористого натрия/О,002% гибитана) при . Диализат подают на 16,2 л колонки с диэтиламиноцелл олозой (ДЕ-52) и элюируют буфером того же состава, что и буфер для диализа. Выходящий из колонки вместе с этим буфером протеин представляет собой спужащую дпя вьщеления ФАБ-фрагментов иммуно- глобулиновую фракцию из овечьей антидигоксиновой сьшоротки. Выход протеина составляет 500-700 г. Содержание дигоксин-спе151 фических антител примерно 80-90% исходного титра в сыворотке.

Специфическая адсорбция.

250 г иммуноглобулиновой фракции в 10 л раствора с содержанием диго- ксин-сиецифического иммуноглобулина равным 15 г, подают в буфер 50 мне- лей фосфата/0,15 М :-шористого натрия/0,002% гибитака (рН 7,0, буфер Б Этот раствор при комнатной температуре в течение примерно 2 ч прокачивают через колонку, заполненную 2,4 л указанного иммунсорбента,. Специфические иммуноглобулиновые фрагменты . свлзьшагатся на 90% с а,цсорбентом. Адсорбент промывают буфером Б, к которому добавляют еще 0,35 М хлористого натрия и р, твина--205 затем уравновешивают буфером В (85 ммоль фосфата, рН 7,0/0,15 моль хлористого натрия/ 2 мМ этилендиамин тетрауксусной кислоты/10 мМ цисте- ина/0,01% гибитан /, который пригоден для последующего расщепления папайном.

Ферментативная фрагментация.

Нагруженный специфическим к диго- ксину иммуноглобулином адсорбент сразу переводят в стеклянные емкости и смешивают с 240 мг папаина.

растворенного в 2 л буфера С. При i, медленном перемешивании с помощью ; лопастной металлической мешалки инкубируют в течение 255 мин при 37°С Путем измерения проб надосадочной жидкости суспензии-адсорбента в УФ- фотометре (280 нм) в различные моменты во время инкубации можно просле Q дить за кинетикой выделения протеина ФС и таким образом образования ФАБ- фрагментов, По окончании инкубй.1щи адсорбент снова загружают в колонку и промывают буфером Б. Для насьш1ения

15 свободными Н-группами из процесса расщепления папаином в присутствии цистеина адсорбент промьшают буфе ром (75 мМ фосфата, рН 7,5/0,15 М хлористого натрия/0,01% гибитана),

20 к которому добавляют 10 мМ иодацета- мида. Иодацетамидный буфер оставляют на 2 ч при комнатной температуре в контакте с адсорбентом. Затем с помощью раствора 0,15 моль хлористого

25 натрия/0,01% гибитана вымывают избыточный иодацетамид и с помощью 30 мМ раствора хлористого натрия подготавливают адсорбент для осуществления элюацни.

30 Элюация (при комнатной температуре) .

Для. элюирования специфических ФАБ-фрагментов через колонку пропускают 3 мМ водной соляной кислоты, ФАБ-протеин в стоке из колонны обнаруживают путем измерения УФ-адсорбции (280 нм) и собирают,. 5-7 л раствогэа, содержащего примерно 11 г протеина, концентрируют путем ультрафильтрации

Q до объема 200-250 мл, затем тотчас лиофилизируют„

Гель-проникающая хроматография ().

Колонку длиной 1 М заполняют 7,5л

g сефакрила S-200 и уравновешивают буфером (5 мМ фосфата, ,0/0,5 М хлористого натрия/0,002% гибитана), Примерно-5 г ФАБ-лисфш1изата растворяют в 110 М уравновешивающего буфе35

50

55

ра и подают на колонку. Путем регистрации УФ абсорбции в элюате устанавливают ФАБ-пик с молекулярным весом 50000 и его собирают. Выход примерно 3,75 г гель-хроматографически однородного протеина. Остальные иммуноглобулиновые фракции, высокомолекулярные ФАБ-агрегаты и фракции с меньшим молекулярным весом отделены. ФАБ-раствор объемом примерно 70015

20

средственно после этого промывают

4л свободного от папаина буферного раствора и ФЛБ-фрагменты вымывают

5ммоль водной уксусной кислоты согласно примеру 4. Результаты соответствуют результатам примера 1.

Пример 6. Реакцию примера 1 повторяют с той лишь разницей, что хлористьй натрий, добавляемьй к бу- д ферному раствору С, заменяют 0,2 моль карбоната алюминия. Кроме того, гель- ферментативную хроматографию на се- факриле S-200 заменяют хроматографией на сефадексе 1 25 М (Phaunacia Fine Chemicale)o В этом случае ре- зультаты также соответствуют результатам примера 1, доказывая, что не адсорбционное средство, а тип расщепления антител оказьюает соответствующий эффекте При этом нет также (различий, если расщепление проводят не в отдельном сосуде, а непосредственно в колонке.

Пример 7, Повторяют пример 5, 25 причем используют натрийфосфатньй буфер (0,5 М, рН-7,5) в качестве растворителя для адсорбции и расщепления папаина и в качестве адсорбирующего средства применяют сштика- гель с удельной поверхностью 1,0 м /г,

Расщепление папаина осуществляют тем, что раствор 240 г папаина в 2 л этого буфера наносят прямо на колонку, причем жидкость течет примерно 30 мин и после этого прерывают ее течение и раствор еще следунлцие 5 ч оставляют на колонке. Затем промьта- ют с помощью 4 л не содержащего папаина буфера и ФАБ-фрагменты вымьша- т с помощью 5 ммоль водной уксусной ислоты согласно .примеру 46, Резульаты соответствуют примеру 1,

Пример 8 о Реакцию примера 1 овторяют с тем отклонением, что ель-ферментационную хроматографию существляют на геле оксида алнминия удельной поверхностью 20 . растворе фосфатного буфера устанавливают ,0, Также при этом поучают результаты, соответствующие римеру 1,

Предлагаемый способ позволяет овысить на 18-20% спегщфичность

30

35

40

45

50

5

0

д

5

антител и значительно повысить сте- пенк удаления эндотоксина 5 Формула изобретения

Способ получения дигиталис-антител, включающий иммунизацию млекопитающих дигоксинбелковым антигеном, вьщеление гамма-глобулина, расщепление папаином, вьщеление ФАБ-фрагмен- тов на иммуносорбенте с использованием промьтки и элюации, гель-фильтрации и ионнообменной хроматографии, отличающийся тем, что, с целью повьппения специфичности антител и степени очистки от эндотоксинов, что антитела адсорбируют на иммуносорбенте, состоящем из пористого стекла, или силикагеле, или окиси с объемом пор 1-20 , в котором через этоксилилпропиламин связан дигитоксинальдегид, антитела расщепляют на адсорбенте, промьтку осуществляют буферным раствором с рН 6,0-7,5 и антитела элюируют водг-.. ной кислотой.

Изобретение относится к области иммунохимии и относится к способу получения дигиталис-антител. Целью изобретения является повьшение специфичности антител и степени очистки от эндотоксинов. Способ осуществляется получением специфической антисьшоротки, вьщелением гамма-глобулина, им ryнocopбIщй на иммуносор- бенте, представляющем пористое стекло, или силикагель или окись алюминия с объемом пор 1-20 , в котором через этоксилилпропиламин связан дигитоксинальдегид, и расщеплением папаина на иммуносорбенте. При этом дигиталис-антитела элюируют с иммо- сорбента водной кислотой после предварительного промывания раствором с рН 6,0-7,5. Полученные антитела дополнительно очищают гель-хромато- графией на сефакрипе-200 и ионообменной хроматографией на ДЕАЕ-целлю- лозе ДЕ-32. Специфичность полученных антител повышается на 18-20%. О)