СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ ПРЕДРАСПОЛОЖЕННОСТИ К ДЛИТЕЛЬНОЙ ФИЗИЧЕСКОЙ РАБОТЕ Российский патент 2002 года по МПК G01N33/48 C12Q1/68 

Изобретение относится к спортивной медицине и молекулярной биологии и предназначено для выявления предрасположенности людей различного пола и возраста к выполнению длительных физических нагрузок и определению возможности выбора занятий различными видами спорта или профессий, связанных с высокой физической активностью.

Поиски специфических генов, ответственных за развитие двигательной функции человека и отдельных физических качеств (выносливость, сила), проводятся с использованием методов ДНК-диагностики, что в дальнейшем может внести существенные изменения в систему отбора и подготовки спортсменов. Прямая ДНК-диагностика заключается в обнаружении полиморфизма или мутаций в известном гене. Ее преимуществом является высокая точность, что позволяет идентифицировать ген, полиморфизм которого связан с двигательной функцией человека.

В работах, выполненных в последние годы исследуются гены, кодирующие ключевые ферменты энергетического метаболизма, такие как креатинкиназа, аденилаткиназа, фосфоглюкомутаза непосредственно в рабочем органе - скелетных мышцах [1, 2]. Проводится поиск полиморфизма у генов, локализованных в митохондриальной ДНК и, прежде всего, НАДН дегидрогеназы [3]. Кроме того, осуществлено выявление полиморфизма длины рестрикционных фрагментов у генов, локализованных в ядерной ДНК и определяющих структуру ферментов, связанных с регуляцией метаболизма на уровне гормонов и нейропептидов [4]. Пока еще ни по одному из этих направлений не удалось получить убедительных доказательств существования специфических генов, кодирующих регуляцию двигательной функции человека.

Целью изобретения является выявление генетической предрасположенности человека к длительной физической работе на основе анализа полиморфизма гена ангиотензин-превращающего фермента (АПФ) при выполнении длительных физических тренировок на развитие выносливости. Цель достигается путем применения для определения физической работоспособности человека нового молекулярно-биологического подхода, основанного на анализе продукта специфического гена, который определяет молекулярную структуру АПФ последовательностью нуклеотидов ДНК. Новый объект для оценки физической работоспособности ген, кодирующий АПФ, позволяет перейти от эмпирических методов определения развития двигательной функции человека к выявлению его генетической предрасположенности выполнять длительную физическую работу.

Изучение структуры гена АПФ показало, что этот ген обладает полиморфизмом и может существовать у человека в нескольких формах в зависимости от наличия (insertion) или отсутствия (deletion) фрагмента длиной 287 пар нуклеотидов (4). Если в структуре гена АПФ присутствует этот фрагмент, то носителя такого генотипа АПФ относят к ИИ-гомозиготному типу, и у него понижена активность фермента АПФ, который регулирует содержание гормона ангиотензина II, и метаболические процессы в сердечной и скелетной мышцах в период повышенной физической активности осуществляются без структурных изменений (отсутствует гипертрофия).

Другой вариант полиморфизма гена АПФ, когда в структуре гена отсутствует фрагмент, содержащий 287 пар нуклеотидов, то такого носителя генотипа АПФ относят к ДД-гомозиготному типу, и в этом случае активность фермента АПФ повышена, что приводит к увеличению содержания гормона ангиотензин И и структурным изменениям (гипертрофии) в сердечной и скелетной мышцах (5). Таким образом, представители первого варианта полиморфизма гена АПФ относится к носителям И-аллеля, тогда как представители второго варианта - к носителям Д-аллеля. Кроме того, существует промежуточный гетерозиготный вариант генотипа ИД.

Способ диагностики наличия или отсутствия у человека предрасположенности к выполнению длительной физической работы включает определение инсерционно-делеционного полиморфизма в гене, кодирующем АПФ, с последующим распределением по гомозиготным генотипам. Для получения геномной ДНК из эпителиальных клеток использовали смыв из ротовой полости обследуемых. ДНК выделяли их этих клеток методом щелочной экстракции. Данный метод выделения ДНК является общепринятым, широко используется многими исследователями и подробно изложен в известных руководствах (6). Полиморфный участок гена АПФ амплифицировали с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Специфические праймеры (затравки) - ДНК-олигонуклеотиды - синтезировали твердофазным фосфиттриэфирным методом в β-цианоэтильной модификации с использованием автоматического синтезатора "Geneassembler" фирмы "Ptiarmacia" (6). После завершения синтеза олигонуклеотид снимали с твердофазного носителя путем аммонолиза в течение 20 ч при температуре 50^oС в водяной бане. Выход и чистоту синтезированных олигонуклеотидов оценивали по характеристике спектра поглощения ультрафиолетового света при рН 7,0 на двулучевом спектрофотометре фирмы "Hitachi". ПЦР проводилина автоматическом термоцикле фирмы "Techne" при трех температурных режимах, соответствующих трем этапам амплификации - денатурации ДНК, отжигу и ее синтезу. Продукты реакции разделяли с помощью электрофореза в 8%-ном полиакриламидном геле.

Использование способа выявления предрасположенности человека к длительной физической работе на основе анализа полиморфизма гена АПФ предполагает в соответствии с генотипом распределение на три группы: носители генотипа ИИ, генотипа ИД и генотипа ДД. Как видно из данных табл. 1, распределение по генотипам и частоте И-аллеля гена АПФ у спортсменов в целом не отличается от такового у людей, не занимающихся систематическим спортом.

Использование предлагаемого способа осуществляют в процессе выполнения тренировочной программы, направленной на развитие выносливости, и тестирование проводят дважды до начала и после окончания тренировочного периода.

Пример. Исследования проводили на 44 квалифицированных спортсменах (КМC, МС) 18-20 лет, специализирующихся в циклических видах спорта. Исследование было проведено в условиях эксперимента, направленного на развитие выносливости при двухразовых ежедневных занятиях. Проведено 60 ч учебно-тренировочных занятий с продолжительностью эксперимента 28 дней.

Для характеристики эффективности предлагаемого способа в начале и в конце эксперимента проводят оценку уровня работоспособности спортсменов с использованием гантелей различного веса: 7 кг для мужчин и 4 кг для женщин. Спортсмены выполняют сгибание рук с гантелями под метроном. Фиксируют время выполнения упражнения обследуемыми до отказа в секундах до начала и по окончании упражнения и по разнице времени судят о физической работоспособности человека в соответствии с принадлежностью к тому или иному генотипу гена АПФ (табл. 2 и 3).

Как видно из результатов, представленных в табл. 2 и 3, длительные физические тренировки спортсменов на развитие выносливости способствуют увеличению физической работоспособности как у мужчин, так и у женщин, носителей генотипов ИИ и ИД. При этом отмечается, что у мужчин с генотипом ИИ работоспособность увеличилась в среднем на 40 с, у женщин с таким же генотипом - на 93,5 с; у мужчин с генотипом ИД на 26,4 с, у женщин - на 105,3 с, тогда как у носителей генотипа ДД прирост работоспособности как у мужчин, так и у женщин, был существенно меньше - на 15,3 с и 34,3 с соответственно. Таким образом, полученные данные свидетельствуют о наличии связи между физической работоспособностью и генотипом гена АПФ. Носители генотипа ИИ гена АПФ обладают большей предрасположенностью к выполнению длительной физической нагрузки, чем носители генотипа ДД гена АПФ. Это позволяет использовать данный способ для выявления генетической предрасположенности человека к выполнению длительной физической работы и использовать его при отборе в разные сферы деятельности человека с повышенной двигательной активностью (от спорта до работы в экстремальных условиях).

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Bouchard C., Simoneau J.A. et al. Genetic effects in human skeletal muscle fiber type distribution and enzymes activities // Сan. J. Physiologi Pharmacol. - 1986. - Vol.64. - P.1245-1251.

2. Bouchard С. , Changen M. et al. Absence of charge variants in human skeletal muscle enzymes of the glycolitic pathway // Hum. Genet. -1988. - Vol.78. - P.100.

3. Rivera M. A. , Wolfarth B. et al. The mitochondrial DNA restriction polymorphism in elite endurance athletes and sedentary controls// Med. Sci. Sport. Exer. - 1998. - Vol.30. - P. 687-690.

4. Arnett D. K., Berecki I.B. et al. Angiotensinogen and angiotensin-converting enzyme genotypes and carotid atherosclerosis// Atherosclerosis. - 1998. - Vol.138. - P.111-116.

5. Rosendorff С. The renin-angiotensin system and vascular hypertrophy/ J.Amer.Cell.Cardiology. - 1996. - Vol.28. - P.803-812.

6. Казаков В.И. Консервативные нуклеотидные последовательности ретропозонов Alu семейства: происхождение и роль в регуляции генной экспрессии: Автореф. дис... канд.биол.наук. - CПб, 1998.

7. Лызлова С.Н., Владимирова В.Г. Ферменты и нуклеиновые кислоты: Учеб. пособие. - СПб: Изд-во Гос.ун-та, 1997. - C.113 и 114.

Изобретение относится к спортивной медицине и касается способа выявления предрасположенности к длительной физической работе. Сущность изобретения включает проведение исследования полиморфизма гена ангиотензинпревращающего фермента (АПФ) в геномной ДНК из промывной жидкости ротовой полости обследуемого посредством ПЦР, разделение обследуемых на три генотипа ИИ, ИД, ДД и по наличию И-аллеля АПФ и выявление генетической предрасположенности человека к выполнению длительной физической работы по наличию И-аллеля. Преимущество изобретения заключается в повышении чувствительности способа. 3 табл.

Способ выявления предрасположенности человека к выполнению длительной физической работы, отличающийся тем, что из промывной жидкости ротовой полости обследуемого выделяют геномную ДНК, в выделенной ДНК эпителиальных клеток посредством ПЦР определяют полиморфизм гена анпеотензин - превращающего фермента (АПФ), проводят разделение обследуемых на три генотипа ИИ, ИД и ДД и по наличию И-аллеля АПФ выявляют генетическую предрасположенность человека к выполнению длительной физической работы.