СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЖИЗНЕСПОСОБНОСТИ КОКОНОВ ЗЕМЛЯНЫХ ЧЕРВЕЙ Российский патент 2003 года по МПК A01K67/33 

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способам определения жизнеспособности коконов дождевых червей.

Известен способ определения физиологического состояния активного ила по дегидрогеназной активности микроорганизмов /1/. В основе данного метода лежит способность некоторых веществ (индикаторов, из которых наиболее чувствительным на ферменты дегидрогеназы является 2,3,5-трифенилтетразолий хлористый (ТТХ)) приобретать стойкую ярко-красную окраску при переходе из окисленного состояния в восстановленное. Период инкубации 1-3 часа в термостате при температуре 37^oС, так как при данной температуре ферменты дегидрогеназы наиболее активны, концентрация ТТХ - 5 г/л.

Ближайшим аналогом является способ определения жизнеспособности коконов земляных червей по вылуплению червячков /2/. Для этого готовят среды с нейтральным рН и влажностью 80-85%, помещают коконы червей из расчета 1 кокон на 5-10 мл субстрата. Во время периода инкубации коконов (20-25 суток) поддерживают температуру 20-25^oС. Визуально определяют выход червячков (коконы, из которых вылупились черви, имеют вид пустой прозрачной оболочки) и их количество.

Недостатками известного способа являются его длительность (для созревания кокона требуется 25 и более суток в зависимости от внешних условий), дороговизна и трудоемкость (ввиду необходимости создания оптимальных условий: специальные контейнеры, субстрат, поддержание постоянных температуры 20-25^oС, влажности 80%, рН 7), недостаточная точность, так как коконы при длительном инкубировании могут погибнуть в процессе эмбриогенеза под влиянием изменения внешних факторов.

При биотестировании на дождевых червях, а также вермитрансформации загрязненных, в частности нефтепродуктами, субстратов необходимо иметь данные по токсикорезистентности не только самих червей, но и их яйцевых коконов, чтобы предотвратить опасность гибели популяции на стадии эмбрионов.

Задачей предлагаемого изобретения является создание способа определения жизнеспособности коконов дождевых червей, позволяющего повысить эффективность способа.

Поставленная задача достигается тем, что в известном способе коконы помещают в раствор ТТХ концентрацией 8-12 г/л и инкубируют в термостате при температуре 37-40^oС в течение 55-60 минут, степень жизнеспособности коконов оценивают визуально по наличию и интенсивности красной окраски таковых.

Наиболее оптимальная концентрация ТТХ для проведения дегидрогеназной реакции на коконах - 8-12 г/л (лучшие результаты при концентрации ТТХ - 10 г/л), при которой окрашивается в среднем 93% коконов. При дальнейшем увеличении концентрации ТТХ количество окрашенных коконов уменьшается, возможно, вследствие переизбытка субстрата, а следовательно, и повышения его токсичности.

Время экспозиции коконов при температуре 37-40^oС может быть 55-60 минут. Увеличение времени инкубации, скорее всего, нецелесообразно, так как при этом количество окрашенных коконов увеличивается незначительно (на 10% за 2-5 часов) или остается приблизительно на одном уровне (за 10-24 часа).

Наиболее приемлемая температура для проведения дегидрогеназной реакции на коконах - 37-40^oС (84-90% окрашенных коконов). При уменьшении до 20^oС или увеличении до 60^oС количество окрашенных коконов снижается на 11 и 27% соответственно.

Лучше всего окрашиваются неповрежденные коконы (в среднем 92%). Надрезание оболочки практически не влияет на количество окрашенных коконов (в среднем 86%), но окраска точечная. Гомогенизированные коконы окрашиваются всего в 13% случаев.

Наивысший процент окрашенных коконов можно получить при использовании коконов, возраст которых 5-15 суток (в среднем 90%). 0-5-дневные коконы почти не дают дегидрогеназной реакции, возможно, так как большинство яиц еще не оплодотворены и ферменты недостаточно активны. 15-30-дневные коконы окрашиваются в 67% случаев. Вероятно, этот показатель снижается из-за гибели эмбрионов или их вылупления.

Экспозиция коконов в физиологическом растворе до проведения дегидрогеназной реакции для выравнивания уровня рН оболочек коконов в течение 1-5 часов практически не изменяет показателей, дальнейшая инкубация (10-120 часов) наоборот снижает процент окрашенных коконов (в среднем на 17%).

Коконы, предварительно содержавшиеся 2 часа при температуре 100-150^oС, не окрашивались, это подтверждает то, что дегидрогеназная реакция проявляется только у живых коконов.

Данный способ осуществляется следующим образом.

Готовят раствор ТТХ концентрацией 10 г/л. В пробирки наливают по 5 мл дистиллированной воды и по 0,5 мл раствора ТТХ. В каждую пробирку помещают по 10 коконов (возраст 5-15 суток). Плотно закрытые пробирки оставляют в термостате на 55-60 минут при температуре 37^oС. Критерием оценки служит окраска коконов: при положительной дегидрогеназной реакции коконы приобретают красную окраску (в зависимости от активности фермента окрашивается весь кокон или окраска точечная), окраска погибших коконов не изменяется.

Пример. В колбы (в двух экземплярах) наливают по 20 мл растворов нефти и нефтепродуктов различных концентраций от 85 до 10^-2 мл/л с интервалом в полпорядка, помещают по 10 неповрежденных коконов, возраст которых 5-15 суток. В качестве контроля используют дехлорированную водопроводную воду с коконами, не подвергшимися никакому воздействию (живые), и коконы, которые кипятят при температуре 100-150^oС в течение 2 часов (мертвые). Колбы оставляют на 24 часа при комнатной температуре.

Коконы из первой серии помещают в дерново-подзолистую почву и содержат до вылупления червячков (20-25 суток) при оптимальных условиях (температура 20-25^oС, влажность 80% рН 7).

В пробирки наливают по 5 мл дистиллированной воды и по 0,5 мл раствора ТТХ (концентрацией 10 г/л), помещают туда коконы из второй серии. Пробирки ставят в термостат на 55-60 минут при температуре 37^oС. После чего оценивают жизнеспособность коконов по наличию и интенсивности красной окраски.

Необработанные коконы окрашивались в среднем в 90% случаев, при этом из одного такого кокона вылуплялось в среднем 2,8±0,6 червячков. Коконы, подвергшиеся кипячению, не окрасились, из них не вылупилось ни одного червячка.

Полученные результаты по определению дегидрогеназной активности коконов и по вылуплению червячков из коконов, находившихся в растворах токсикантов, позволяют выявить минимальные действующие и максимальные недействующие концентрации нефти и нефтепродуктов для коконов красных калифорнийских червей (см. таблицу).

Как видно из материалов таблицы, данные по дегидрогеназной реакции коконов и по вылуплению червячков практически полностью совпадают. Таким образом, данный способ определения жизнеспособности коконов позволяет достаточно быстро и объективно определить токсикорезистентность коконов земляных червей к различным токсикантам.

Источники информации
1. Городний Н. М., Мельник И.А., Повхан М.Ф. Биоконверсия органических отходов в биодинамическом хозяйстве. - Киев.: Урожай, 1990. - 256 с.

2. Фридман Р. А., Рудненко Е.В. Определение дегидрогеназной активности микроорганизмов активного ила//Охрана окружающей среды, 1983. - 12 с.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к определению жизнеспособности коконов дождевых червей. Коконы помещают в раствор ТТХ концентрацией 8-12 г/л. Инкубируют в термостате при температуре 37-40^oС в течение 55-60 мин. Степень жизнеспособности коконов оценивают визуально по наличию и интенсивности красной окраски таковых. Изобретение позволяет уменьшить длительность и повысить точность определения жизнеспособности коконов дождевых червей. 1 табл.

Способ определения жизнеспособности коконов дождевых червей, отличающийся тем, что коконы помещают в раствор 2,3,5-трифенилтетразолия хлористого (ТТХ) концентрацией 8-12 г/л и инкубируют в термостате при температуре 37-40^oС в течение 55-60 мин, степень жизнеспособности коконов оценивают визуально по наличию и интенсивности красной окраски таковых.