СПОСОБ ОБНАРУЖЕНИЯ ВИРУСА ЛИХОРАДКИ ЗАПАДНОГО НИЛА Российский патент 2003 года по МПК C12Q1/68 C12N7/00 C07H19/00 

Изобретение относится к молекулярной биологии, в частности к методу диагностики вируса лихорадки Западного Нила, основанном на детекции генетического материала возбудителя и приспособленным для массовых анализов с возможной автоматизацией процесса.

Вирус лихорадки Западного Нила (ЛЗН) относится к семейству Flaviviridae и является одним из широкораспространенных инфекционных агентов во всем мире и, в частности, в южных регионах России. В настоящее время для диагностики данного возбудителя используются иммуноферментные наборы, позволяющие определять наличие вирусных антигенов в биологических пробах и наличие антител к этим антигенам в сыворотках крови (Львов Д.К., Бутенко А.М., Гайдамович С. Я. , Ларичев В.Ф., Лещинская Е.В., Жуков А.Н., Лазоренко В.В., Алюшин А. М., Петров В. Р. , Триханов С. Т., Хуторецкая Э.В., Шишкина Е.О. и Яшков А.Б. (2000): [Эпидемические вспышки менингита и менингоэнцефалита в Краснодарском крае и Волгоградской области, вызванные вирусом Западного Нила (Предварительное сообщение)]. Вопросы вирусологии т.45, 37-38.). В тоже время совершенно очевидна необходимость создания высокочувствительного диагностического набора для выявления в биологических пробах генетического материала (РНК) вируса ЛЗН. Ближайшим аналогом по литературным данным может быть разработка Lanciotti et. al (Lanciotti, R.S., Kerst, A.J., Nasci, R.S., Godsey, M.S., Mitchell, C.J., Savage, H.M., Komar, N, Panella, N.A., Allen, B. C. , Volpe, K.E., Davis, B.S., and Roehrig, J.Т. (2000): Rapid detection of west nile virus from human clinical specimens, field- collected mosquitoes, and avian samples by a TaqMan reverse transcriptase-PCR assay. J Clin Microbiol 38, 4066-71). Однако описанный метод, хотя и использует полимеразную цепную реакцию (ПЦР), но основан на флюоресцентном методе детекции продуктов реакции. Предложенный ими способ диагностики вируса ЛЗН включает в себя проведение реакции обратной транскрипции с последующей двойной амплификацией с праймерами из неструктурной 3'-концевой части генома вируса либо области генома, кодирующего белок E.

Сущность изобретения заключается в том, что способ выявления вируса основан на получении кДНК с помощью реакции обратной транскрипции участка вирусного генома от 5'-конца вирусной РНК до района гена, кодирующего лидерную последовательность мембранного белка с использованием праймера из 23 звеньев со следующей последовательностью нуклеотидов: GGGCATTCATAAGTGATAGTATC и последующей двойной амплификации с помощью праймеров, имеющих следующие последовательности: праймер 2F, 22 звена: GTAGTTCGCCTGTGTGAGCTGA; праймер 26F, 22 звена: -AACTTAGTAGTGTTTGTGAGGA и праймер 518R, 23 звена: TCGGTAGCATTTACCGTCATCAT. Вирус выявляется, если после разделения части реакционной смеси в агарозном геле в анализируемом образце присутствует полоса размером 495 нуклеотидных пар.

Предложенный способ включает в себя две основные стадии. Первая - это построение кДНК-копии части генома вируса ЛЗН с помощью обратной транскриптазы. Матрицей для этой реакции служит одноцепочечная РНК вируса ЛЗН, а затравкой - праймер из 23 звеньев со следующей последовательностью: GGGCATTCATAAGTGATAGTATC и комплементарный последовательности участка генома вируса ЛЗН, кодирующей лидер белка М. Результатом этой реакции является гибридная РНК-ДНК молекула, которая служит матрицей для последующей амплификации с внешней парой праймеров. Вторая стадия состоит из двух последовательных амплификаций с двумя различными парами праймеров - внешней и внутренней. Матрицей для первой амплификации (с внешней парой праймеров 2F и 518R) служит гибридная РНК-ДНК молекула, получающаяся в результате реакции обратной транскрипции, а матрицей для второй амплификации (с внутренней парой праймеров 26F и 518R) - фрагмент, полученный в результате первой амплификации. Следует отметить, что использование разных пар праймеров при двойной амплификации существенно улучшает специфичность конечного продукта. По этой же причине для синтеза кДНК цепи используется праймер, отличный от праймеров, используемых для амплификации. Внешней парой являются олигонуклеотиды 2F, 22 звена: GTAGTTCGCCTGTGTGAGCTGA и 518R, 23 звена: TCGGTAGCATTTACCGTCATCA. Внутренней парой являются олигонуклеотиды 26F, 22 звена: AACTTA GTAGTGTTTGTGAGGA и 518R. Реакционную смесь анализируют с помощью электрофореза в агарозном геле. Присутствие в анализируемом образце полосы размером 495 нуклеотидных пар свидетельствует о наличии в исходном материале РНК вируса ЛЗН.

Предложенный метод является высокочувствительным и высокоспецифичным к вирусу лихорадки Западного Нила и позволяет достоверно определять наличие РНК вируса в пробах крови больных, образцах секционного материала и в переносчиках арбовирусных инфекций.

Пример 1. Выбор последовательности праймеров.

Учитывая большую вариабельность генома вируса ЛЗН, при его обнаружении необходимо использовать праймеры, соответствующие наиболее консервативным участкам вирусного генома. В качестве таких участков-мишеней предлагается использовать те, которые совпадают по нуклеотидной последовательности в штаммах вируса ЛЗН, принадлежащих к различным филогенетическим группам. Одним из наиболее консервативных участков генома вируса является 5'-нетранслируемая область, область гена core и рrе-М. В связи с изложенным, основой для поиска мишеней стало сопоставление нуклеотидных последовательностей по всей длине генома для вируса ЛЗН, EMBL accession AF196835, D00246, М12294, NC_ 001563, AF206518, AF202541 на компьютере с помощью программы Megalign (DNASTAR). Кроме того, учитывались результаты определения нуклеотидных последовательностей штаммов вируса ЛЗН из коллекции Института вирусологии им. Д.И. Ивановского, содержащей штаммы, филогенетически значительно удаленные друг от друга. Затем на основе этих данных были выбраны потенциальные мишени для праймеров, которые далее проверялись на гомологию со всеми имеющимися данными EMBL GenBank (май 2000 г.) по нуклеотидной последовательности вируса ЛЗН с помощью программы Amplify (Macintosh). В качестве критериев, определяющих пригодность праймеров, учитывались следующие: длина мишени не менее 22 звеньев, отсутствие дупликации праймеров и отжига их друг на друга, отсутствие мест ложной посадки на матрицы геномов различных штаммов вируса ЛЗН. Этим критериям удовлетворяют все отобранные праймеры. Расположение праймеров показано на чертеже.

Пример 2. Синтез праймеров.

Праймеры синтезировали фосфоамидитным методом на автомате-синтезаторе по обычной схеме. Для выделения синтезированных олигонуклеотидов из реакционной смеси использовали обращенно-фазовую хроматографию перед снятием метокситритильной 5'-концевой защитной группы. Полученные праймеры были практически гомогенны по результатам гель-электрофореза в полиакриламидном геле.

Пример 3. Выделение тотальной РНК.

РНК из сыворотки крови, культуры тканей или образцов переносчиков выделяли гуанидинизотиоционатом с последующей экстракцией смесью фенола и хлороформа. Водную фазу, содержащую РНК, осаждали этанолом.

Пример 4. Синтез кДНК.

Синтез кДНК осуществлялся с праймером 626R, состоящим из 23 звеньев и имеющим следующую последовательность: GGGCATTCATAAGTGATAGTATC.

Следует отметить, что для синтеза кДНК выбирался праймер, отличный от праймеров для внешней и внутренней амплификации, что существенно повышает специфичность предлагаемого метода.

Пример 5. Амплификация фрагмента кДНК с внешней парой праймеров.

Амплификацию с праймерами 2F и 518R проводили в объеме 50 мкл при конечной концентрации 200 мкмоль каждого из праймеров. В качестве матрицы в реакционную смесь добавляли 2 мкл предварительно разведенной в 10 раз дистиллированной водой смеси, полученной в результате реакции обратной транскрипции. Реакцию ПЦР проводили при следующих условиях: денатурация - 94^oС, 20 секунд; отжиг - 55^oС, 20 секунд; элонгация - 72^oС, 30 секунд; 25 циклов.

Пример 6. Амплификация с внутренней парой праймеров. Полученный в результате первой амплификации продукт служил матрицей для второй амплификации с праймерами 26F и 518R. Условия ПЦР: денатурация - 94^oС, 30 секунд; отжиг - 60^oС, 20 секунд, элонгация - 72^oС, 30 секунд; 35 циклов.

Изобретение относится к молекулярной биологии и может быть использовано при диагностике вируса лихорадки Западного Нила (ЛЗН). Способ основан на реакции обратной транскрипции участка вирусного генома в районе гена, кодирующего лидерную последовательность мембранного белка вируса с помощью праймера из 23 звеньев с последовательностью нуклеотидов GGGCATTCATAAGTGATAGTATC. Последующую двойную амплификацию проводят с помощью системы праймеров. Для первой амплификации используют олигонуклеотиды 2F, 22 звена и 518R 23 звена с последовательностью нуклеотидов соответственно GTAGTTCGCCTGTGTGAGCTGA и TCGGTAGCATTTACCGTTCATCAT, а для второй амплификации - олигонуклеотиды 26 F 22 звена с последовательностью нуклеотидов AACTTAGTAGTGTTTGTGAGGA и 518 R 23 звена. Вирус выявляют при наличии в анализируемом образце полосы размером 495 нуклеотидных пар после разделения части реакционной смеси в агарозном геле. Способ обеспечивает высокую чувствительность и специфичность к вирусу ЛЗН, что позволяет достоверно определять наличие РНК вируса в анализируемых пробах. 1 ил.

Способ обнаружения вируса лихорадки Западного Нила, предусматривающий проведение реакции обратной транскрипции с РНК вируса с использованием праймера и последующей двойной амплификацией с помощью праймеров, анализ реакционной смеси с помощью электрофореза в агарозном геле и выявление РНК вируса по результатам анализа, отличающийся тем, что в качестве праймера для проведения реакции обратной транскрипции с РНК вируса используется олигонуклеотид из 23 звеньев со следующей последовательностью нуклеотидов: GGGCATTCATAAGTGATAGTATC, комплементарной области рrе-М генома вируса, в качестве праймеров для первой амплификации используются олигонуклеотиды из 22 и 23 звеньев, имеющих следующие последовательности: GTAGTTCGCCTGTGTGAGCTGA и TCGGTAGCATTTACCGTCATCAT, в качестве праймеров для второй амплификации используют олигонуклеотиды из 22 и 23 звеньев, имеющих следующие последовательности: AACTTAGT AGTGTTTGTGAGGA и TCGGTAGCATTTACCGTCATCAT, при этом РНК вируса выявляют при наличии в анализируемых образцах полосы размером 495 нуклеотидных пар.