Способ амплификации фрагмента ДНК неизвестной последовательности, расположенного на некотором расстоянии от фрагмента ДНК известной последовательности Советский патент 1993 года по МПК C12Q1/68 

Раз

Изобретение относится к молекулярной генетике, а именно к способам размножения фрагментов ДНК неизвестной последовательности из определенной области ДНК.

иножение фрагмента ДНК является

важчейшим необходимым этапом для его дальнейшего изучения, в частности, определения его последовательности, и использования в других исследованиях, например, в каче стве зонда ДНК. Преимущественно изо- бре-:ение может быть использовано в работах гю поиску неизвестных генов в рамках стргтегии обратной генетики, а также для клонирования неизвестных последователь- ДНК, поиска новых полиморфных мар серов ДНК. В настоящее время известен тол( ко один способ амплификации фраг- менга ДНК неизвестной последовательности, расположенного на некотором

расстоянии от фрагмента ДНК известной последовательности - способ инвертированной цепной полимеразной реакции. Данный способ (фиг. 1) включает синтез олигонуклеотидных праймеров, получение линейных фрагментов ДНК, в которых фрагмент ДНК неизвестной последовательности флакирован фрагментами ДНК с известной последовательностью путем выделения ДНК из исследуемого объекта, обработки ДНК мелкощепящей рестриктазой. сайт рестрикции которой R1 присутствует во фрагменте ДНК известной последовательности, легирования полученной смеси, обработкой ДНК крупнощепящей рестриктазой, сайт рестрикции которой R2 находится в известной последовательности .на большем удалении от фрагмента ДНК неизвестной последовательности, чем сайт

VJ

О

го о

4 ГО

рестрикции R1: или, вместо этой операции, нагреванием раствора ДНК для производства статистических разрывов в кольцевых ДНК; с последующим проведением реакции полимеризации с использованием фрагмен- та ДНК неизвестной последовательности и праймеров..

Недостатком способа является то, что может быть размножен только фрагмент, непосредственно примыкающий к фрагмен- ту ДНК известной последовательности. Указанный недостаток делает практически неэффективным применение этого способа для поиска неизвестных генов в рамках0 стратегии обратной генетики, для чего в типичном случае необходимо проанализировать несколько десятков фрагментов, расположенных примерно равномерно на участке общим размером несколько десят- ков - несколько сотен тысяч нуклеотидных пар.

. Цель изобретения - расширение функциональных возможностей способа за счет увеличения расстояния между фрагментом ДНК известной последовательности и раз- множэемым фрагментом ДНК неизвестной последовательности.

Цель достигается тем, что после выделения ДНК из исследуемого объекта проводят дополнительную обработку ДНК крупноще- лящей рестриктазой, сайт рестрикции которой RO присутствует во фрэгменте ДНК известной последовательности, а сайты рестрикции R1 и R2 лежат между сайтом рестрикции RO и фрагментом ДНК неизвест- ной последовательности; и последующее легирование полученной смеси для получения кольцевых молекул ДНК. .

В результате этой процедуры фрагмент ДНК неизвестной, последовательности, рас- положенный на расстоянии, определяемым расстоянием между сайтами рестрикции RO, оказывается непосредственно примыкающим- к фрагменту ДНК известной последо- вательности (фиг. 2). К такой конструкции в принципе можно применить способ прототипа для размножения полимеразной цепной реакцией фрагмента ДНК неизвестной последовательности, непосредственно примыкающего к фрагменту ДНК известной по- следовательности.

Совокупность отличительных признаков е литературе не описана,

Использование изобретения позволяет расширить функциональные возможности способа за счет увеличения расстояния между фрагментом ДН К известной последовательности и размножаемым фрагментом ДНК неизвестной последовательности. Расстояние между фрагментом ДНК-известной

последовательности и размножаемым фрагментом ДНК неизвестной последовательности при использовании способа прототипа равно нулю, тогда как при использовании способа изобретения расстояние между фрагментом ДНК известной последовательности и размножаемым фрагментом ДНК неизвестной последовательности может достигать нескольких десятков тысяч нуклеотидных пар. Этот факт делает возможным эффективное использование способа, предложенного в изобретении, для поиска неизвестных генов в рамках стратегии обратной генетики. В типичном случае для поиска гена необходимо размножить и изучить несколько десятков фрагментов ДНК, расположенных примерно равномерно в области, размеры которой составляют несколько десятков - несколько сотен тысяч нуклеодит- ных :пар. Таким образом, способ, предложенный в изобретении, по своим функциональным возможностям сравним с использованием методов прогулки по хро- мосоме и прыжка по хромосоме, но в связи с использованием цепной полимеразной реакции, является значительно более дешевым, простым и не требует дорогостоящего оборудования.

П р и м е р. Для проверки- заявленного способа мы применили его к 5 концевой области гена дистрофина человека, последовательность которой была известна (рис.

з)- : . . : - -. .

Были синтезированы олигонуклеиодит- ные праймеры следующей последовательности ДНК:

первый- 5 ATATAAGGTTGTG CTTCCAG CATAACAAG,

второй ..--5 GTGCGCAGGTCCTGGAATTTGAAATATCCG

При этом первый праймер мог гйбриди- зоваться с участком ДНК между сайтом рестрикции R2 рестриктазы Neb I (сайт 749) и сайтом рестрикции R1 рестриктазы EcoR I (сайт 701) в нзтивной ДНК до обработки рестриктазами, и мог обеспечивать синтез ДНК в направлений сайтов рестрикции R1 рестриктазы EcoR I (сайты 701 и 315) в нативной ДНК до обработки рестриктазами,

а второй праймер мог гибридизоваться с участком ДНК между сайтом рестрикции R2 реетриктазы Мсо I (сайт 749) и сайтом рестрикции RO рестриктазы Nla IV(сайт 836) в нативной ДНК до обработки рестриктазами, и мог обеспечивать синтез ДНК в направлении противоположном тому, в котором мог обеспечивать синтез ДНК первый праймер.

ДНК была выделена из крови по следующей схеме: первая стадия состояла в получении ядер, затем проводили лизис в растворе, содержащем 0,5% SDS и 100 ед/мл пр отеиназы К, и фенольную экстракцию бетков.

10 мкг геном ной ДНК в объеме 100 мкл обэабатывали 40 единицами рестриктазы ) IV в течение ночи при 37 С. Рестриктазу ибировали 10 мин при 65 С. Тупые концы ировали 500 единицами Т4 ДНК-лигазы в объеме 1 мл при 21 С в течение носи с тем, чтобы интересующие нас фрагменты ДНК

N1

ин ле

Дл ос . ря

/той 693 нп замкнулись в кольца. ДНК ждали в присутствии 0,4 М LiCI и раство- и в 80 мкл ТЕ рН 8,0.

ДНК обрабатывали 50 единицами ре- стриктазы EcoR I (сайты рестрикции кото- ро i R1 (сайты 315 и 701) располагались мекду сайтами рестрикции RO рестриктазы

Ml;

об

этом от интересующего нас кольцевого

фрагмента ДНК длиной 693 нп отщеплялся

фрагмент длиной 386 нп. Ликие концы легиIV (сайты 143 и 836) в нативной ДНК) в еме 100 мкл в течение ночи при 37 С, при

ро ем

али 50 единицами Т4 ДНК-лигаэы в объ- 0,7 мл при 21 С в течение ночи с. тем, 21

дл

ОСс

ря

чтсбы интересующие нас фрагменты ДНК ной 307 нп замкнулись в кольца. ДНК ждали в присутствии 0,4 М LiCI и раствол в 50 мкл ТЕ рН 8,0.

ДНК обрабатывали 60 единицами ре- стриктазн.Мсо I (сайт рестрикции которой R2 (сайт 749) в нативной ДНК располагался между сайтом рестрикции RO рестриктазы NI; IV (сайт 836) с одной стороны и сайтом рестрикции R1 рестриктазой EcoR I (сайт

70

за которым на большем удалении от

5

0

0

1

0 5

сайта R2 следовали последовательно еще один сайт рестрикции R1 (сайг 315) и сайт рестрикции RO (сайт 143), с другой стороны), в объеме 100 мкл в течение ночи при 37 С, при этом происходило раскрытие интересующего нас кольца.

Затем была проведена полимерззная цепная реакция (ПЦР) с использованием первого и второго праймеров, по следующей схеме: 1,0 мкг подготовленной (обработанной тремя рестриктазами) ДНК, 0,05 иМ каждого праймера, 200 иМ каждого dNTp в 50 мкл стандартного буфера для ПЦР (50 тМ KCI, 10 т.М Tris рН 8,4, 2,5 тМ MgCl2, 200 мкг/мл желатины) прогревали 10 мин при 95 С, добавляли 2 ед. Taq-полимеразы, и проводили 38 циклов с параметрами: 95 С - 1 мин., 56 С - 1 мин., 68 С - 2 мин., затем добавляли дополнительно 2 ед. Тад-полиме- разы и 0,5 иМ каждого праймера, проводили еще 14 циклов с теми же параметрами и финальную инкубацию при 68 С в течение 8 мин. Амплификацию проводили без минерального масла, после каждых семи циклов пробирки центрифугировали для осаждения, конденсата.

В результате описанных процедур был амплифицировян фрагмент ДНК ожидаемой длины 242 нп, который включал в себя фрагмент ДНК расположенный в нативной ДНК между сайтами рестрикции RO рестрик.тэзы Nla IV (сайт 143) и R1 рестриктазы EcoR I (сайт 315) и удаленный в нативной ДНК на некоторое расстояние от области ДНК, с которой могли гибридизоваться первый и второй праймеры.

Использование: молекулярная генетика, а именно способы размножения фрагментов ДНК неизвестной последовательности из определенной области ДНК. Сущность изобретения: осуществляют последовательные обработки ДНК рестрикта- зами и легирование, в результате которых фрагмент ДНК неизвестной последователь- ности, расположенный в нативной ДНК на некотором расстояний от фрагмента ДНК известной последовательности, оказывается непосредственно примыкающим к фрагменту ДНК известной последовательности; синтез олигонуклеотидных праймеров, проведение с их использованием амплификации (размножения) фрагмента ДНК неизвестной последовательности, 3 ил. SЈ

|Формул а изобретения .Способ амплификации фрагмента ДНК неизвестной последовательности, расположенного на некотором расстоянии or фрагмента ДНК известной последовательности, включающий синтез олигонуклеотидных праймеров, получение линейных фрагментов ДНК, в которых.фрагмент ДНК неизве- последовательности фланкирован фрагментами ДНК с известной последовательностью путем выделения ДНК из иссле- ду мого объекта, обработки ДНК ме л кощепящей рестриктазой, сайт рестрикции которой R1 присутствует во фрагменте ДНК известной последовательности, легирование полученной смеси, обработку ДНК крупнощепящей рестриктазой, сайт рестрикции которой R2 находится в известной последовательности на большем удалении от фрагмента ДНК неизвестной последовательности, чем сайт R1. или путем нагревания раствора ДНК для производства статистических разрывов с кольцевых ДНК с последующим проведением реакции полимеризации с использованием фрагмента ДНК неизвестной последовательности и праймеров, отличающийся тем, что, с целью расширения функциональных возможностей способа за счет увеличения расстояний между фрагментами ДНК известной последовательности и размножаемым фрагментом ДНК неизвестной последовательности, после выделения ДНК из исследуемого объекта проводят дополнительную обработку ДНК крупнощепящей рестриктазой, сайт рестрикции которой RO присутствует во фрагменте ДНК известной последовательности, а сайт рестрикции R1 и R2 л ежат между сайтом рестрикции RO и фрагментом ДНК неизвестной последовательности и легирование полученной смеси для получения кольцевых молекул ДНК.

12 6I 1271 1.281 1291 .130.1 .Utl- . АТАТДТАТОТЛТТТАТТСЛСОАЛТАТАТАТТТТТСЛТТаЙСААЛАСТТТТ СААСЛОАЛАТ

1Я21 1331 1341 1351 1361 1371 ООАОТОТААААОТТТТТСТТТОСОАТАОААСТАААСАСАГОАТТТСТТСАТТААСАААСС

Рестикт-аэа Узнаваемая послеловательность сайты узна йання

Фиг. 2:

lit