СПОСОБ КОРРЕКЦИИ БИОХИМИЧЕСКИХ И ИММУНОЛОГИЧЕСКИХ НАРУШЕНИЙ В УСЛОВИЯХ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ОСТРОЙ ТОКСИЧЕСКОЙ ГЕПАТОПАТИИ, СОПРОВОЖДАЮЩЕЙСЯ ПОВЫШЕНИЕМ ИММУНОЛОГИЧЕСКОЙ РЕАКТИВНОСТИ Российский патент 2003 года по МПК A61K38/06 A61P1/16 

Предлагаемый способ относится к медицине, а именно к гепатологии и иммунологии, и может быть использован для коррекции и профилактики биохимических и иммунологических сдвигов при токсических гепатопатиях.

Реактивность иммунной системы при различных формах патологии печени играет существенную роль в патогенезе заболевания, что обусловлено непосредственным влиянием иммунной системы организма на развитие аутоиммунных осложнений токсических и инфекционных поражений печени, на переход острой формы заболевания печени в хроническую и в цирроз печени ( Логинов А.С. Иммунологические аспекты хронических заболеваний печени. // Wiss. Beitr. M.- Luther-Univ. Halle-Wittenberg R.-1987.- 99.-Р.192-198.), а также в поддержании хронического течения патологического процесса (Яхонтова О.И., Карашурова Л. Л. , Старкова С.А. Некоторые иммунологические изменения и их диагностическое значение при хронических заболеваниях печени. // Врачеб. дело. -1988.- 4.-С. 39-42. ) Многие вопросы связей печени и иммунной системы решаются в эксперименте при моделировании патологического процесса в печени с помощью различных гепатотропных веществ (Алексеева И.Н., Брызгина Т.М., Павлович С.И., Ильчевич Н. В. Печень и иммунологическая реактивность. -Киев: Наук. думка, 1991.-С.5). Реакция иммунной системы зависит не только от повреждающего агента, но и от его дозы, кратности и способа введения в организм. В условиях токсических гепатопатий можно ожидать как снижение иммунологической реактивности (Молотков А.О. Нарушения физиологических механизмов регуляции системы иммунитета при остром отравлении фосфорорганическим соединением карбофосом: Автореф на соискание уч. степени канд. мед. наук. - Саратов, 2002.-С. 20), так и ее повышение (Конопля А.И. Эндогенные иммуномодуляторы как фактор сохранения гомеостаза при патологии печени: Автореф. дис. на соискание уч. степени д-ра мед. наук. - Киев, 1989.-С.39). Такая дисфункция в иммунной системе требует соответствующей иммунокорригирующей терапии (Алексеева И.Н., Брызгина Т.М., Павлович С.И., Ильчевич Н.В. Печень и иммунологическая реактивность. -Киев: Наук. дум-ка, 1991. -С.43-45). Она может быть эффективной только при условии строгого учета стадии заболевания, характера и степени иммунных нарушений. Поскольку в условиях токсических гепатопатий может наблюдаться различная реакция иммунной системы, показана эффективность лечения в одних случаях иммуностимуляторами, а в других - иммунодепрессантами. Иммуностимуляторы эффективны в борьбе с иммунодефицитами, наблюдающимися при некоторых формах патологии печени, и для активации регенераторных процессов в органе. Но использование иммуностимуляторов (тимогена) в условиях патологии печени именно с повышенной реактивностью иммунной системы и высоким уровнем иммуноглобулинов в крови часто приводит к обострению патологического процесса (Б.И. Кузник, В.Г.Морозов, В.Х. Хавинсон. Цитомедины 25-летний опыт экспериментальных и клинических исследований. Санкт-Петербург.- "Наука".-1998.-С.197-198.). Иммуносупрессоры показаны для того, чтобы избежать повреждающего действия иммунных механизмов на печень (Алексеева И.Н., Брызгина Т. М. , Павлович С.И., Ильчевич Н.В. Печень и иммунологическая реактивность. - Киев: Наук. дум-ка,1991.-С.43), поскольку активация иммунного ответа может свидетельствовать о запуске аутоиммунных механизмов повреждения печени ( Там же, С. 77).

Наиболее близким способом коррекции в условиях острого токсического поражения печени CCL₄ (тетрахлорметаном (ТХМ), другое название четыреххлористый углерод (ЧХУ), является применение полисахаридного комплекса, извлеченного из корней и корневищ лабазника шестилепестного (ПСК ЛШ), обладающего иммуносупрессорной активностью ( Мансимова О.В. Автореф. дисс. на соискание уч. степени кандидата медицинских наук. Курск, 1999, С.12-16). В полисахаридном комплексе корневищ и корней лабазника шестилепестного содержится глюкозы - 13,6%, арабинозы - 8,5%, ксилозы -%, галактозы -%, маннозы - 3,5%, рамнозы - 7,1%. В условиях повышенной иммунологической реактивности, вызванной введением CCL₄, ПСК ЛШ проявляет существенный иммунокорригирующий эффект, то есть снижает повышенную иммунологическую реактивность до уровня здоровых животных. Такая нормализация иммунологической реактивности сопровождается и уменьшением выраженности биохимических симптомов поражения печени: синдромы цитолиза (активность аланин- и аспартатаминотрансфераз), холестаза (концентрация билирубина, холестерина) и гепатодепрессивного синдрома (концентрация фибриногена), что свидетельствует об улучшении состояния печени. Таким образом, в этом способе коррекции ограничивается гиперактивация иммунной системы, которая может привести к развитию аутоиммунных осложнений, хронизации процесса и ухудшению состояния печени, но и иммунодефицит не возникает, так как реактивность иммунной системы снижается до уровня здоровых животных, но не ниже него.

Недостатком такого способа коррекции является трудоемкость получения ПСК ЛШ, трудность в его стандартизации, поскольку процентное содержание действующих веществ в ПСК ЛШ может зависеть от качества первоначального сырья и условий выделения, кроме того, не ясно, что является основным действующим веществом в этом комплексе, от чего зависят его эффекты - от точного процентного содержания моносахаров или их последовательности в полисахаридах.

Задача изобретения - разработать способ коррекции биохимических и иммунологических сдвигов в условиях экспериментальных острых токсических гепатопатий, сопровождающихся повышением иммунологической реактивности.

Задача изобретения достигается тем, что экспериментальному животному (крысе) с токсической гепатопатией, сопровождающейся повышенной иммунологической реактивностью, вводят парентерально (внутрибрюшинно) растворенный в физиологическом растворе (ФР) хлорида натрия супрессирующий иммунный ответ трипептид H₂N-Gly-L-His-L-Lys-COOH (химическое название - glycyl-L-histidyl-L-lysine) (в дальнейшем обозначаемый как Gly-His-Lys) в дозе 1,5 мкг/кг массы тела десятикратно, с интервалом в 24 ч между инъекциями.

В разработанном нами способе коррекции используется трипептид, обладающий слабым иммуносупрессорным эффектом, и подобрана такая доза и кратность его введения, что, не вызывая иммунодефицита, он ограничивает гиперактивацию иммунной системы. Можно утверждать, что такая иммунокоррекция положительно влияет на состояние печени, так как уменьшается выраженность биохимических симптомов ее поражения (синдром воспаления и частично холестаза).

Этот пептид выделен из плазмы крови и известно его стимулирующее влияние на рост волос, синтез коллагена фибробластами, накопление межклеточного вещества соединительной ткани, чем во многом объясняется ускоренное заживление ран и язв под его влиянием и на основании чего высказываются предположения о физиологической роли этого пептида, как о стимуляторе ранозаживления ( Maquart F. X., Pickart L., Laurent M., Gillery P., Monboisse JC, Borel JP. Stimulation of collagen synthesis in fibroblast cultures by the tripeptide-copper complex glycyl-L-histidyl-L-lysine-Cu ²⁺. // FEBS Lett. 1988. Vol. 238. N2. P.343-346; Trachy R.E., Fors T.D., Pickart L., Uno H. The hair follicle-stimulating properties of peptide copper complexes. Results in C3H mice. // Ann. NY Acad.Sci. 1991. Vol. 642. P.468-469.) Gly-His-Lys связывает двухвалентную медь и таким образом может участвовать в активации медьсодержащих ферментов, тем самым обеспечивая антиокислительные процессы, биоэнергетику клеток, синтез эластина, коллагена, катехоламинов (Maquart F.X., Bellon G. , Chaqour В. , Wegrowski J, Patt L.M., Trachy RE, Monboisse JC, Chastang F, Birembaut P, Gillery P. In vivo stimulation of connective tissue accumulation by the tripeptide-copper complex glycyl-L-histidyl-L-lysine-Cu²⁺. // J. Clin. Invest. 1993. Vol 92. N5. P. 2368-2376; Linder M.C. Biochemistry of Copper. E. Freiden, Ed. Plenum Press. 1991).

В настоящий момент, поскольку точно известна химическая формула этого пептида, он может быть синтезирован в любой лаборатории синтеза пептидов либо куплен у фирм, занимающихся поставкой биологически активных соединений (Sigma, ICN, Merk, Bachim и др.). Нами был использован препарат, синтезированный в НИИ химии Санкт-Петербургского Государственного Университета.

На чертеже представлена гистограмма, демонстрирующая иммунокорригирующий эффект пептида Gly-His-Lys, в условиях токсического поражения печени тетрахлорметаном.

Способ осуществляется следующим образом. В качестве модели острой токсической гепатопатии (ОТГ), сопровождающейся стимуляцией иммунологической реактивности, нами была выбрана модель гепатопатии, вызванной отравлением тетрахлорметана (ТХМ), поскольку именно эта модель обладает большим сходством механизмов развития поражения печени с клиническими формами острой, хронической гепатопатии и цирроза печени различной этиологии у людей (Блюгер А.Ф., Майоре А.Я., Горштейн Э.С. и др. Характеристика нарушений целостности мембран клеток печени при некоторых видах поражения органа. // Успехи гепатологии. /Под ред. А.Ф. Блюгера.-Рига.-1981.-Вып.9.-С.5-24.). Экспериментальным животным (крысы), внутримышечно вводили 50% раствор ТХМ в растительном масле в дозе 3 мл/кг массы тела в течение 5 дней подряд. Одновременно с поступлением гепатотропного яда, до и после него, десятикратно (один раз в сутки), внутрибрюшинно вводят 0,1 мл раствора, содержащего пептид Gly-His-Lys в дозе 1,5 мкг/кг массы, растворенный в стерильном изотоничном растворе хлорида натрия. При такой кратности введения пептид обладает корригирующим действием в отношении ряда биохимических показателей, таких как уровень бета-липопротеидов и выраженность тимоловой пробы, а также слабым иммуносупрессирующим эффектом, который, существенно не ослабляя функции иммунной системы, препятствует дальнейшему повышению иммунологической реактивности, что может привести к гиперактивации и возможному развитию аутоиммунных осложнений. При введении пептида в той же дозе, но пятикратно нормализующий биохимические сдвиги эффект менее выражен, а повышенная в условиях отравления ТХМ иммунологическая реактивность практически не снижается. Превышение рекомендуемой дозировки более чем в 10 раз (дозы 50 и 150 мкг/кг) сопровождается более выраженным супрессирующим эффектом пептида и одновременным усилением биохимических нарушений, таких как активность аланин- и аспартатаминотрансфераз, концентрации билирубина, и бета-липопротеидов в крови, а также выраженность тимоловой пробы, что свидетельствует об ухудшении функциональной активности гепатоцитов.

Пример конкретного выполнения
Крысы Вистар были разделены на группы по 8-10 крыс в каждой. Группы животных представлены в таблице 1. Пептид Gly-His-Lys вводился животным десятикратно (один раз в сутки) внутрибрюшинно в дозе 1,5 мкг/кг массы и в 100 раз большей дозе - 150 мкг/кг. ОТГ вызывали путем пятикратного (один раз в сутки) внутримышечного введения 50% раствора ТХМ в растительном масле в дозе 3 мл/кг массы, чередуя лапы. Пептид вводился до и одновременно с введением ТХМ. На следующий день после последнего введения ТХМ крыс забивали обескровливанием под эфирным наркозом, получали сыворотку крови, которую использовали для биохимических исследований. В условиях ОТГ наблюдается повышение активности аланин - и аспартатаминотрансфераз, уровня билирубина, бета-липопротеидов и тимоловой пробы, что свидетельствует о поражении печени и развитии синдромов цитолиза, холестаза и воспаления. В этих условиях проявлялось корригирующее действие пептида в дозе 1,5 мкг/кг массы на концентрацию бета-липопротеидов и уровень тимоловой пробы, а также наблюдалась тенденция к нормализации в отношении других биохимических показателей, в то время как использование пептида в дозе 150 мкг/кг массы приводило к усилению биохимических нарушений (таблица 1).

Такие же группы животных были взяты для изучения состояния иммунологической реактивности. Об интенсивности гуморального иммунного ответа (ГИО) судили по количеству антителообразующих (АОК) и розеткообразующих (РОК) клеток в селезенке на 5-й день после иммунизации экспериментальных животных (крысы) (Мальберг К. , Зигль Э. Иммунологические методы. /Под ред. Г. Фримеля; Пер. с нем. А.П. Тарасова. - М., 1987-с.273-282.). В качестве антигена использовали эритроциты барана (ЭБ). Пептид вводился как до, так и после иммунизации по схеме в табл.2
Результаты эксперимента представлены на чертеже. Введение ТХМ сопровождается развитием ОТГ и стимуляцией ГИО на Т-зависимый антиген-ЭБ. Введение пептида в этих условиях снижает иммунологическую реактивность, что может быть использовано для целей иммунологической коррекции.

Таким образом, использование предлагаемого трипептида в дозе 1,5 мкг/кг десятикратно, внутрибрюшинно экспериментальным животным (крысы, мыши) существенно снижает повышенную иммунологическую реактивность, препятствуя тем самым ее гиперактивации и развитию аутоиммунных осложнений, а также нормализует ряд биохимических показателей сыворотки крови, что свидетельствует о корригирующем эффекте пептида на функциональную активность гепатоцитов. Тем самым, трипептид Gly-His-Lys при таком способе введения обладает одновременным корригирующим эффектом как в отношении функциональной активности гепатоцитов, так и в отношении иммунологической реактивности.

Изобретение относится к медицине, а именно к гепатологии и иммунологии, и касается разработки способа коррекции биохимических и иммунологических сдвигов в условиях экспериментальной острой токсической гепатопатии, сопровождающейся повышением иммунологической реактивности. Для этого экспериментальному животному вводят парентерально (внутрибрюшинно) растворенный в физиологическом растворе хлорида натрия трипептид H₂N-Gly-L-His-L-Lys-COOH в дозе 1,5 мкг/кг массы тела десятикратно с интервалом в 24 ч между инъекциями. Способ обеспечивает купирование гиперактивации иммунной системы, что препятствует развитию аутоиммунного процесса. 2 табл., 1 ил.

Способ коррекции биохимических и иммунологических нарушений в условиях экспериментальной острой токсической гепатопатии, сопровождающейся повышением иммунологической реактивности, отличающийся тем, что парентерально один раз в сутки в течение десяти дней подряд вводят супрессирующий иммунный ответ трипептид H₂N-Gly-L-His-L-Lys-COOH в дозе 1,5 мкг/кг массы.