Гепатопротекторное средство с антиоксидантной и репаративной активностями. Российский патент 2022 года по МПК A61K38/06 A61P1/16 

Изобретение относится к медицине (фармакологии, гепатологии, патофизиологии), ветеринарии и может быть использовано для повышения антиоксидантной и репаративной активностей и для достижения гепатопротекторного воздействия при применении пептида H₂N-L-Glu-L-Trp-D-Ala-COOH в условиях поражения печени.

Известен пептидный препарат - тимоген, представляющий собой дипептид (H₂N-L-Glu-L-Trp-COOH), который является иммуномодулятором и обладает рядом других биологических эффектов (Регистр лекарственных средств России (РЛС) Энциклопедия лекарств, 2004, 11 выпуск, с.849-850).

Однако, особенностью действия природных регуляторных пептидов является непродолжительный период их эффектов, из-за инактивации протеазами, уровень которых особенно высок в зоне воспаления (Robson, M.C. Wound infection: a failure of wound healing caused by an imbalance of bacteria / M.C. Robson // Surg. Clin. North. Am. - 1997. - Vol.77. - P. 637-650.), (Saidakhmedova, Z.T. Immunomodulating activity of thymogen in acute pancreatitis / Z.T. Saidakhmedova // Vopr. Pitan. - 2000. - Т.69, N 6. - Р. 35-36.) Одним из способов повышения устойчивости пептидов к действию протеаз считается введение в молекулу D-аминокислот (Greven H.M., De Wied D. Influence of peptides structurally related to ACTH and MSH on active avoidance in rats // Frontiers of Hormone research. 1977, v. 4, p. 140-152)

В то же время, регуляторные пептиды представляют собой особый класс сигнальных молекул, структурное сходство которых не является основанием для сходства их биологических эффектов. Даже изменение тех же аминокислот в их молекулах с L-изомера на D-изомер часто приводит к изменению направленности эффектов в противоположную сторону или их полное нивелирование (Deigin, Vladislav. EW-peptide family. One family, two drugs / Vladislav Deigin // Journal of peptide science. - 2008. - V. 14. - Issue 8. - P.163.). Особенно данные закономерности характерны для коротких пептидов (Ашмарин И.П., Антонова JI.B., Титов С.А., Максимова JI.A., Каменский А.А. Возможные механизмы разнонаправленного действия АКТГ₄-₁₀ и его аналога, содержащего D-изомер фенилаланина, на поведение // Журнал ВНД, 1980, т.ЗО, вып.6, с.1196-1202А.; А, Ярилин, «Иммунология. Учебник», Гэотар-Медиа, 2010). В связи с этим, учитывая многочисленные данные исследований биологических эффектов регуляторных пептидов, при таких модификациях их молекул, как изменение L-аминокислот на их D-изомеры, заранее невозможно предполагать, как изменятся их эффекты в сравнении с исходной молекулой. Напротив, в данном случае, можно предполагать проявление новых самых различных биологических эффектов.

Вероятно благодаря введению в молекулу тимогена с С-конца аминокислоты D-Ala (D-аланина) усиливаются иммуностимулирующая и репаративная активности. Так при введении в эквимолярных дозах пептид H₂N-L-Glu-L-Trp-D-Ala-COOH в условиях кожных ран обладал более выраженным по сравнению с тимогеном (H₂N-L-Glu-L-Trp-COOH) иммуностимулирующим и ранозаживляющим эффектами (Средство для заживления ран, обладающее иммуностимулирующим эффектом Корошвили В.Т.,Смахтин М.Ю., Бобынцев И.И., Ардемасова З.А., Калихевич В.Н.,Затолокина М.А. Патент РФ №2555338 Заявка №2014129154, Зарегистрировано 4 июня 2015 г.; Иммунотропные, антиоксидантные и репаративные эффекты нового аналога тимогена, модифицированного D-аланином. Смахтин М.Ю., Бобынцев Я.И., Корошвили В.Т., Чуланова А.А., Должикова И.Н. //Курский научно-практический вестник «Человек и его здоровье ». - 2019. - №1. - С.77 - 82.)

Данные о влиянии пептида общей формулы H₂N-L-Glu-L-Trp-D-Ala-COOH на состояние печени и его антиоксидантную активность при патологиях этого органа в литературных источниках отсутствуют.Данное исследование было проведено впервые.

Технический результат изобретения: применение по новому назначению пептида общей формулы H₂N-L-Glu-L-Trp-D-Ala-COOH для повышения антиоксидантной и репаративной активностей и для достижения гепатопротекторного воздействия при поражениях печени.

Технический результат изобретения достигается путем применения пептида общей формулы H₂N-L-Glu-L-Trp-D-Ala-COOH для повышения антиоксидантной и репаративной активностей и для достижения гепатопротекторного воздействия при поражениях печени.

Предлагаемый для этого пептид получают путем химического синтеза из отдельных аминокислот.Пептид может быть синтезирован в любой лаборатории синтеза пептидов. Нами был использован препарат, синтезированный в НИИ химии Санкт-Петербургского государственного университета.

Растворенный в изотоническом растворе хлорида натрия пептид H₂N-L-Glu-L-Trp-D-Ala-COOH вводился экспериментальным животным (крысы) один раз в сутки парентерально (внутрибрюшинно) в разовой дозе - 1,2 мкг/кг в течение 5 дней. В качестве гепатотропных ядов были использованы тетрахлорметан и гидразин. Пептид вводили животным в обьеме 0,1 мл один раз в сутки с интервалом в 24 часа между инъекциями. Антиоксидантную активность пептида определяли по уровню малонового диальдегида (МДА) в плазме крови и гомогенате печени (Рагино, Ю.И. Определение резистентности к окислению гепарин-осажденных в-липопротеинов сыворотки крови у больных ишемической болезнью сердца / Ю.И. Рагино, М.И. Душкин // Клин. лаб. диагностика. - 1998. - №11. - С.3-5). Навеску части печени помещали в десятикратный объем ледяного физиологического раствора и гомогенизировали. Полученный гомогенизат центрифугировали в течение 10 минут при скорости 3000 оборотов в минуту и образовавшийся супернатант использовали для исследований. МДА является конечным продуктом перекисного окисления липидов (Mihara, M. Thiobarbituric acid value on such homogenate of rat as parameter of lipid peroxidation in aging, CCl₄ intoxication and vitamin E definienes / M. Mihara, M. Uchiama // Biochem. Med. - 1980. - Vol.23, №3. - P. 302-311). Подсчитывали митотический индекс (МИ) гепатоцитов, характеризующий активность их репаративной регенерации. Статистическую обработку результатов производили по расхождению границ доверительных интервалов и с помощью критерия Манна-Уитни.

Изменение уровня МДА в печени и репаративной регенерации гепатоцитов также используется при определении гепатотоксичности или гепатопротекторных эффектов фармакологических препаратов и служат показателями состояния печени (Подымова, С.Д. Болезни печени / С.Д. Подымова. - М., 1993. - 544 с.Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. - М.: Миндзрав РФ, ЗАО ИИА «Ремедиум», 2000.)

Пример конкретного выполнения.

Пример 1. Эффекты пептида H₂N-L-Glu-L-Trp-D-Ala-COOH при отравлении тетрахлорметаном.

Крысам Вистар моделировали поражение печени тетрахлорметаном, путем внутрижелудочного введения его 50% раствора в растительном масле по 3 мл/кг массы тела в течение 5 дней подряд. Пятидневное введение тетрахлорметана сопровождается среднекапельной жировой дистрофией гепатоцитов (Фармакологическая коррекция пептидом GLY-HIS-LYS иммунометаболических нарушений в условиях поражения печени тетрахлорметаном / М.Ю. Смахтин, А.И. Конопля, Л.А. Северьянова, И.А. Швейнов // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. - 2003. - №2. - С.19-21.).

Навеску пептида H₂N-L-Glu-L-Trp-D-Ala-COOH растворяли в стерильном изотоничном растворе хлорида натрия и вводили животным в обьеме 0,1 мл внутрибрюшинно в разовой дозе 1,2 мкг/кг массы пятикратно (один раз в сутки) одновременно с введением тетрахлорметана. Животные контрольной группы получали эквивалентные обьемы изотоничного раствора (NaCl). На следующий день после последнего введения животных выводили из эксперимента, обескровливанием под хлоралгидратным наркозом.

Антиоксидантную активность пептида определяли по уровню малонового диальдегида (МДА) в плазме крови и гомогенате печени (Рагино, Ю.И. Определение резистентности к окислению гепарин-осажденных в-липопротеинов сыворотки крови у больных ишемической болезнью сердца / Ю.И. Рагино, М.И. Душкин // Клин. лаб. диагностика. - 1998. - №11. - С.3-5). МДА является конечным продуктом перекисного окисления липидов (Mihara, M. Thiobarbituric acid value on fuch homogenate of rat as parameter of lipid peroxidation in aging, CCl₄ intoxication and vitamin E definienes / M. Mihara, M. Uchiama // Biochem. Med. - 1980. - Vol.23, №3. - P. 302-311). Также кусочки печени фиксировали в 10% нейтральном формалине на 0.1 М фосфатном буфере рН=7.2 и заливали в парафин по общепринятой методике. Парафиновые срезы печени окрашивали гематоксилином и эозином. Подсчитывали митотический индекс (МИ) гепатоцитов, характеризующий активность их репаративной регенерации (Саркисов, Д.С.Микроскопическая техника / Д.С.Саркисов. - М.: Медицина, 1996. - 543 с.). Выявленные эффекты представлены в таблице 1.

Пептид H₂N-L-Glu-L-Trp-D-Ala-COOH снижает уровень малонового диальдегида (МДА) в плазме крови и в печени (гомогенате), что свидетельствует о его антиоксидантной активности (таблица 1). Также пептид H₂N-L-Glu-L-Trp-D-Ala-COOH стимулирует репаративную регенерацию гепатоцитов, повышая число их митозов в печени и тем самым активируя восстановление органа, пораженного тетрахлорметаном. Снижение уровня МДА в печени и повышение митотического индекса гепатоцитов свидетельствует о проявлении гепатопротекторного эффекта.

Таблица 1

Влияние пептида H₂N-L-Glu-L-Trp-D-Ala-COOH на концентрацию МДА и митотический индекс (M±m, n=8) гепатоцитов в условиях отравления тетрахлорметаном

Группы животных Антиоксидантная активность Репаративная активность МДА, мкмоль/л в плазме крови МДА, мкмоль/л в гомогенате печени Митотический индекс гепатоцитов, ‰ 1.Контроль (NaCl) 6,1±0,6 6,9±0,7 2,5±0,1 2. H₂N -L-Glu-L-Trp-D-Ala-COOH 1,4±0,2* 4,5±0,4* 13,1±0,4*

Примечание: * - показывает достоверные отличия, р<0,05; n - количество животных в группе.

Пример 2. Эффекты пептида H₂N-L-Glu-L-Trp-D-Ala-COOH при отравлении гидразином.

В качестве другой модели острой токсической гепатопатии использовали также поражение печени однократным внутрибрюшинным введением солянокислого гидразина (50 мг/кг) (Иванова, А.П. Формирование иммунного ответа и его коррекция при токсическом поражении печени различной этиологии: Дис.…канд. мед. наук / А.П. Иванова. - Курск, 1995. - 140 с.). Навеску пептида H₂N-L-Glu-L-Trp-D-Ala-COOH растворяли в стерильном изотоничном растворе хлорида натрия и вводили животным в обьеме 0,1 мл внутрибрюшинно в разовой дозе 1,2 мкг/кг массы пятитикратно (один раз в сутки) одновременно и после введения гидразина. Животные контрольной группы получали эквивалентные обьемы изотоничного раствора (NaCl). На следующий день после последнего введения животных выводили из эксперимента, обескровливанием под хлоралгидратным наркозом. Определяли те же показатели.

Выявленные эффекты представлены в таблице 2.

Таблица 2

Влияние пептида H₂N-L-Glu-L-Trp-D-Ala-COOH на концентрацию МДА и митотический индекс (M±m, n=8) гепатоцитов в условиях отравления гидразином

Группы животных Антиоксидантная активность Репаративная активность МДА, мкмоль/л в плазме крови МДА, мкмоль/л в
гомогенате печени Митотический индекс гепатоцитов, ‰ 1.Контроль (NaCl) 5,1±0,5 6,3±0,6 2,1±0,1 2. H₂N -L-Glu-L-Trp-D-Ala-COOH 2,7±0,3* 4,1±0,5 * 17,3±0,5*

Примечание: * - показывает достоверные отличия, р<0,05; n - количество животных в группе.

Пептид H₂N-L-Glu-L-Trp-D-Ala-COOH снижает уровень малонового диальдегида (МДА) в плазме крови и в печени (гомогенате), что свидетельствует о его антиоксидантной активности (таблица 2). Также пептид H₂N-L-Glu-L-Trp-D-Ala-COOH активирует репаративную регенерацию гепатоцитов, повышая число их митозов в печени и тем самым активируя восстановление органа пораженного гидразином. Снижение уровня МДА в печени и повышение митотического индекса гепатоцитов свидетельствует о проявлении гепатопротекторного эффекта.

Таким образом, пептид, имеющий общую формулу H₂N-L-Glu-L-Trp-D-Ala-COOH обладает антиоксидантным эффектом, стимулирует процессы репаративной регенерации гепатоцитов, повышая число их митозов, а следовательно, активирует процесс восстановления печени, проявляя тем самым гепатопротекторную активность.

Изобретение относится к применению пептида, имеющего формулу H₂N-L-Glu-L-Trp-D-Ala-COOH, обладающего антиоксидантным и репаративным эффектами для гепатопротекторного воздействия при поражениях печени. Технический результат: эффективное гепатопротекторное действие при поражениях печени. 2 табл., 2 пр.

Применение пептида общей формулы H₂N-L-Glu-L-Trp-D-Ala-COOH, обладающего антиоксидантным и репаративным эффектами, для гепатопротекторного воздействия при поражениях печени.