СПОСОБ СОЗДАНИЯ ИСХОДНОГО МАТЕРИАЛА ДЛЯ СЕЛЕКЦИИ РАСТЕНИЙ Российский патент 2003 года по МПК A01H1/00 

Изобретение относится к сельскому хозяйству и может быть использовано в селекции растений.

Известен способ селекции растений, включающий скрещивание искусственно измененной формы и исходного сорта, отбор ценных форм среди гибридов и их размножение, причем в качестве искусственно измененной формы используют миксоплоиды, которые в скрещивании участвуют в качестве материнского компонента. Необходимый миксоплоид, например пшеницы, получают экспериментальным замачиванием сухих семян в водном растворе 5%-ного колхицина в течение 24 ч при 25^oС и высева их на постоянное место в поле без предварительной промывки в воде (А. с. СССР 1292681, А 01 Н 1/04, публ. 28.02.87 г., Бюлл. 8).

Недостатком известного способа является то, что в качестве искусственно измененной формы для скрещивания используют миксоплоиды, отличающиеся смешанной плоидностью (исходной, удвоенной и анеуплоидной) генома. При этом видимые миксоплоидные морфологические изменения колоса, принадлежащие материнскому растению не позволяют предсказать уровень плоидности макро- и микрогамет в каждом цветке колоса пшеницы или ячменя. Участвующие в скрещивании цветки могут иметь как исходную, так и измененную плоидность. При скрещивании цветка с неизмененной плоидностью на миксоплоидном колосе с исходным нормальным сортом поколение F₁ будет полностью гомозиготным и аналогичным исходному сорту. При скрещивании исходного сорта, например гексаплоидной (2n= 6х= 42) мягкой пшеницы или ярового ячменя (2n=2х=14), с цветком удвоенной плоидности (4n=12х=84 или 4n=4x=28 соответственно) на миксоплоидном колосе, будут получены зиготы промежуточной плоидности (3n=9х=63 или 3n=3х=21 соответственно) с выраженными нарушениями конъюгации хромосом в профазе I мейоза I из-за некратного их числа и последующего несимметричного расхождения хромосом в анафазе мейоза. Следствием этого будет формирование ярко выраженной стерильности, угнетения, сублетальности или летальности гибридных растений. Использование в скрещивании анеуплоидных цветков миксоплоидного колоса с числом хромосом больше или меньше на 1 или 2 хромосомы относительно базового генома приведет к образованию унивалентов в мейозе из-за наличия непарных хромосом и во многих случаях к последующей полной стерильности или летальности растений. В целом, использование миксоплоидов для скрещивания с исходными сортами из-за высокой доли образующихся форм с промежуточной (3n) плоидностью или анеуплоидов и связанной с этим высокой летальностью или стерильностью не позволяет обнаруживать и закреплять в потомстве большое количество полезных рекомбинаций и не обеспечивает увеличения полиморфизма количественных и качественных признаков у сортов и видов растений.

Известен способ селекции ячменя, включающий перевод диплоидных сортов на тетраплоидный уровень, получение тетраплоидных форм, проведение искусственной деполиплоидизации аутотетраплоидов в поколении не ниже С₅ путем воздействия на выращиваемые в сосудах проростки температурой 5-10^oС и 7-8-часовым освещением и последующее выделение диплоидных реверсантов - по размерам клеток первичных корешков, которые должны быть близки к размерам клеток тетраплоидных форм (А.с. СССР 1591885, А 01 Н 1/04, публ. 1990 г.).

Недостатком известного способа является то, что для деполиплоидизации используются тетраплоиды не ранее чем 5-го поколения (С₅), при этом в отборе не участвуют более ранние поколения автотетраплоидов (C₂-C₄) с наибольшей частотой рекомбинации признаков. При использовании данного способа диплоидным реверсантам передаются цитоплазматически детерминируемые признаки и не учитывается большинство хозяйственно ценных признаков, контролируемых ядерными хромосомами. Выявление диплоидных реверсантов с признаками тетраплоидов только методом определения размеров клеток корешков без прямого подсчета плоидности способствует потере части диплоидных реверсантов, а также отбору большого количества стабилизированных тетраплоидов с более крупными по сравнению с диплоидным сортом морфологическими элементами растения, как это приведено в описании известного способа, отличающимися, как правило, рыхлой соматической тканью и пониженным внутриклеточным осмотическим давлением. Искусственная деполиплоидизация тетраплоидов в сосудах существенно снижает эффективность способа за счет ограниченного числа растений, определяемого числом сосудов и размерами сооружений искусственного климата. Пониженная, 12-15^oС, температура при деполиплоидизации требует дополнительных энергозатрат и оборудования на поддержание требуемых температурных режимов. В целом, применение известного способа существенно ограничивает выявление возможного полиморфизма количественных и качественных признаков из-за того, что полезные рекомбинации, образующиеся в более ранних, чем С₅, поколениях, не выделяются и не используются, а также из-за отбора ограниченного объема форм растений не установленной плоидности (в т.ч. фертильных стабилизированных тетраплоидов), именуемых в известном способе диплоидными реверсантами, определяемого техническими условиями реверсии плоидности в контролируемых условиях среды.

Известен также способ создания исходного материала для селекции зерновых и крупяных культур, включающий перевод диплоидных сортов на тетраплоидный уровень колхицинированием или другим известным способом, обработку семян тетраплоидов γ-излучением или раствором нитрозоэтилмочевины в дозе, критической для диплоидной формы, выращивание поколений M₁ и М₂ в виде популяций, выделение в поколении М₂ реверсивных диплоидных растений (по следующим признакам: большая высота растений, раннее колошение, высокая озерненность колоса), использование семян с отобранных растений для закладки линий (А.с. СССР 1519596, А 01 Н 1/04, публ. 1989 г.).

Недостатком известного способа, взятого нами в качестве прототипа, является то, что целью данного изобретения является получение мутантов реверсивно диплоидного происхождения. Использование физических или химических мутагенов в критических дозах (LD₅₀) приводит к модификации хозяйственно ценных признаков за счет нарушения функциональности отдельных локусов, контролирующих их реализацию. При этом в геноме растения увеличивается доля морфологически незаметных мутаций и микромутаций, оказывающих аддитивно-негативное действие на жизнеспособность организма в целом. Как правило, все признаки, полученные путем мутагенеза, в том числе и при использовании известного метода, взятого нами в качестве прототипа, рецессивны и требуют поддержания организма в гомозиготном состоянии. Частота встречаемости реверсивных диплоидов при использовании γ-излучения имеет ярко выраженную сортовую зависимость, а их разнообразие определяется только количественными признаками, контролирующимися полимерно (большая высота растений, раннее колошение, высокая озерненность колоса). Использующиеся в прототипе приемы для увеличения частоты появления реверсивных диплоидов существенно ограничивают возможности для отбора хозяйственно ценных диплоидных реверсантов по модифицированным количественным и качественным признакам, поскольку отбор реверсантов ведется только после обработки мутагенами в критических дозах (т.е. при мутагенной летальности не менее 50% особей). При этом часть полезных генных рекомбинаций, образовавшихся на полиплоидном уровне или при реверсии на диплоидный уровень, будет утеряна из-за образования несовместимых с жизнью организма мутаций, вызванных применением критических доз мутагенов, а большинство вновь образовавшихся признаков, в т.ч. и изначально доминантных у исходного сорта или тетраплоида, приобретут рецессивность из-за частичного повреждения и нарушения функциональности мутировавших локусов. В целом, известный способ, выбранный нами в качестве прототипа, существенно ограничивает получение, выявление и последующее сохранение максимально возможного полиморфизма по количественным и качественным признакам растений.

Заявляемым изобретением решается задача повышения эффективности способа за счет расширения полиморфизма как доминантных, так и рецессивных аллелей качественных и количественных признаков при получении реверсантов (реплоидов) (впервые введенный нами термин) у любых видов высших растений, не достигших критического уровня плоидности.

Цель изобретения - увеличение полиморфизма количественных и качественных признаков растений, а также получение новых признаков или возврат утерянных в процессе филогенеза вида признаков, без использования мутагенов различной природы, путем полиплоидизации растений, последующего отбора рекомбинантных полиплоидов и выделения среди них за счет спонтанной редукции плоидности гамет форм с возвратной кратно-пониженной плоидностью - реплоидов.

Технический результат достигается тем, что в известном способе, включающем перевод исходных диплоидных сортов на тетраплоидный уровень колхицинированием или другим известным способом, выделение реверсивных диплоидных растений по морфологическим и другим хозяйственно ценным признакам и использование их в качестве исходного материала, согласно изобретению получают полиплоиды удвоением плоидности исходных сортов с любым ее начальным уровнем, выращивают полиплоиды в течение нескольких поколений и одновременно с этим отбирают рекомбинированные полиплоидные формы, отличающиеся от базового полиплоидного морфотипа, отобранные формы размножают, каждую в отдельности, в течение ряда поколений, в каждом из которых выделяют формы с реверсивно кратно-пониженной плоидностью (реплоиды), уровень плоидности которых определяют по морфологическим признакам и прямым подсчетом хромосом, оценивают реплоиды по комплексу хозяйственно ценных признаков, выделяя формы, отличающиеся от растений с исходной плоидностью измененными или новыми качественными и количественными признаками.

Сопоставительный анализ заявляемого технического решения с прототипом позволяет сделать вывод, что заявляемый способ отличается от известного наличием нового приема: выделением рекомбинированных полиплоидов из внутрисортовой популяции полиплоидов, полученных удвоением плоидности исходных сортов и выращиваемых в течение нескольких поколений, а также порядком выполнения известного приема "выделение реверсивных форм": формы с реверсивно кратно-пониженной плоидностью (реплоиды) выделяют из рекомбинированных полиплоидных форм при их размножении в течение ряда поколений. Таким образом, заявляемый способ соответствует критерию патентоспособности "НОВИЗНА".

Исследуя уровень техники в процессе проведения патентного поиска по всем видам сведений, общедоступных в печати, мы обнаружили, что способ создания исходного материала для селекции растений, включающий заявленную нами совокупность признаков, для специалиста в области селекции явным образом не следует из известного на сегодня существующего уровня техники. Нашими исследованиями на протяжении ряда лет выявлено, что в природе с определенной частотой постоянно осуществляется спонтанная полиплоидизация высших растений. Полиплоидизация приводит к образованию поливалентов в профазе I мейоза I. С этим связаны различные нарушения конъюгации и кроссинговера гомологичных хромосом, вызывающие их структурные изменения. Нерегулярное распределение дочерних хромосом в мейозе у "ранних" автополиплоидов приводит к редукции плоидности гамет и образованию анеуплоидов и возвратных диплоидов (реплоидов). У "ранних" автополиплоидов при мультивалентной конъюгации и кроссинговере могут происходить асимметричные обмены гомологичными участками хромосом. Структурные изменения хромосом могут приводить к количественным и качественным изменениям существующих или к образованию новых признаков. Реплоидные формы образуются на основе составляющих полиплоидный геном диплоидных геномов, включая рекомбинированные наборы хромосом. При этом образовавшиеся реплоиды могут быть гомологичными исходной диплоидной форме или отличаться от нее, сохраняя возникшие на полиплоидном уровне новые признаки или приобретая их при мультивалентной конъюгации и неравном кроссинговере, предшествующем редукции плоидности. Реплоиды, отличающиеся измененными качественными и количественными признаками, а также новыми признаками, в т.ч. утерянными в процессе филогенеза вида, могут использоваться в качестве исходного материала при селекции растений. На основании вышеизложенного можно сделать вывод о соответствии заявляемого технического решения критерию патентоспособности "ИЗОБРЕТАТЕЛЬСКИЙ УРОВЕНЬ".

Заявляемое техническое решение соответствует и критерию патентоспособности "ПРОМЫШЛЕННАЯ ПРИМЕНИМОСТЬ", т.к. оно может быть использовано в сельском хозяйстве, и, кроме того, в описании изобретения будут представлены средства и методы, с помощью которых возможно осуществление технического решения в том виде, как оно охарактеризовано в независимом пункте формулы изобретения.

Способ осуществляют следующим образом. Начинают с того, что берут сорта или формы растений с исходной плоидностью (например, диплоиды) и переводят их на полиплоидный (например, тетраплоидный) уровень колхицинированием или другим известным способом. В первом полиплоидном поколении (C₁) выделяют полиплоиды по характерным морфологическим признакам, свойственным полиплоидам данного вида, и прямым подсчетом хромосом. Выделенные полиплоиды выращивают (в полевых условиях или в условиях искусственного климата) в течение нескольких поколений. В каждом полиплоидном поколении отбирают рекомбинированные полиплоидные формы, явно отличающиеся от базового полиплоидного морфотипа (по любым количественным и качественным признакам), что свидетельствует о структурных изменениях хромосом одного или более составляющих полиплоид диплоидных геномов. Выделенные рекомбинированные полиплоидные формы выращивают в течение нескольких поколений отдельными популяциями, выделяя в каждом поколении реплоиды с возвратно кратнопониженной плоидностью по морфологическим признакам и прямым подсчетом хромосом. Оценивают реплоиды по комплексу хозяйственно ценных признаков, выделяя формы, отличающиеся от растений с исходной плоидностью измененными или новыми качественными и количественными признаками. Все выделенные реплоиды, отличающиеся измененными, улучшенными или новыми морфологическими, биохимическими или иными признаками, используют в качестве исходного материала в селекционных или иных целях.

Пример осуществления способа
В качестве исходных форм были взяты сорта сои Фора и Вилана с 2n=40. Их семена высеяли в полевых условиях и в фазу 1-го тройчатого листа растений перевели на полиплоидный уровень путем обработки апикальных меристем водными растворами колхицина в концентрации 0,05%. Образующиеся ниже зоны колхицинирования диплоидные побеги удаляли по мере их появления. Колхицинированные побеги доводили до созревания и на них убирали семена С₁.

Полученные семена С₁ маркировали и индивидуально проращивали в чашках Петри до получения корешков длиной 2-5 см, отрезали кончик корешка длиной 0,5 см и цитологически исследовали стандартными методиками. Проростки, у которых была установлена удвоенная плоидность (4n=80), высевали в грунт, формируя по каждому сорту полиплоидную популяцию C₁.

Начиная с поколения C₁ во внутрисортовых популяциях полиплоидов сои ежегодно выделяли рекомбинированные полиплоидные формы, явно отличающиеся от базового полиплоидного морфотипа по скорости и продолжительности этапов органогенеза, высоте растений, характеру ветвления, форме и числу листочков настоящих листьев, длине черешка, окраске опушения, гипокотиля, венчика цветков, оболочки и рубчика семян (табл. 1). Поскольку соя является строгим самоопылителем, и кроме этого, гибридизация между диплоидами и тетраплоидами у сои исключена из-за нежизнеспособности триплоидных зигот, появление измененных, генетически детерминированных признаков во внутрисортовых полиплоидных популяциях свидетельствует о полиплоидной рекомбинации генома без привлечения генетического материала извне.

Анализ табл. 1 свидетельствует о наличии полиморфизма по обнаруженным рекомбинированным признакам полиплоидных (4n=80) форм сои. Так, при рекомбинации признака, контролирующего формирование тройчатого сложного листа диплоидного сорта и базовой полиплоидной формы у полиплоидных рекомбинантов, количество составляющих сложный лист листовых пластинок варьировало от пяти листочков (очень редко встречающейся формы) до однолисточковой формы, полностью отсутствующей в естественном генофонде вида. Выявлен полиморфизм у рекомбинантов по форме верхушки листа, варьирующей от остроконечной до тупой и выемчатой. Окраска опушения стеблей, имеющая серую окраску у обоих диплоидных сортов и их базовых полиплоидных форм, у отдельных полиплоидов приобретала рыжевато-коричневую окраску, воспроизводимую в последующих поколениях. У некоторых рекомбинантных полиплоидов белоцветкового сорта Фора была обнаружена фиолетовая окраска венчика, а у сорта Вилана, имеющего фиолетовые цветки, - были выделены белоцветковые полиплоиды. У рекомбинантных полиплоидов обоих сортов заметно увеличился диапазон изменчивости по высоте растений от карликовых до высокорослых форм, а также по количеству ветвей.

В потомстве рекомбинированных полиплоидов ежегодно выделяли реплоиды по визуально различимым морфологическим признакам, свойственным сое с исходной базовой плоидностью: пропорциям листовых пластинок, размерам пыльцевых зерен и числу на их поверхности микропор, форме, характеру поверхности и размерам бобов и семян и проверяли уровень плоидности реплоидов прямым подсчетом хромосом.

Выделенные реплоиды сои сравнивали по комплексу качественных и количественных признаков в сравнении с исходным диплоидным сортом, выделяли формы с улучшенными хозяйственно ценными признаками и использовали их как исходный материал для селекции сои (табл. 2-3).

Анализ табл. 2 свидетельствует о наличии морфологических рекомбинаций по ряду признаков у реплоидов, выделенных из рекомбинированных полиплоидов. Так, высота реплоидных растений варьировала от 85 до 147 см у сорта Вилана и от 69 до 150 см у сорта Фора, в отдельных случаях в 3 раза превышая высоту исходного сорта. Были выделены реплоиды, отличающиеся от исходных сортов по цвету окраски опушения стеблей и венчика цветков. Обнаружен полиморфизм по таким качественным признакам, как окраска створок бобов, варьирующая от светло-бежевой до коричневой и темно-коричневой, и окраска рубчика семени, варьирующая от желтой до черной.

Выделенные реплоиды отличались от исходных сортов также и по биохимическим, полимерно наследуемым признакам (табл.3). Так, содержание белка в семенах реплоидов отличалось от уровня исходных сортов: на 2,75 абсолютных % у сорта Вилана и на 5,86 абсолютных % у сорта Фора. У сорта Фора отмечен полиморфизм по содержанию масла в семенах, варьирующий от 14,79 до 19,86%. Полиплоидной рекомбинации подвергся и показатель трипсинингибирующей активности белка, в отдельных случаях увеличиваясь на 3,69 мг/г у реплоидов сорта Вилана, а у реплоидов низкоингибиторного сорта Фора - варьируя от 11,77 до 22,88 мг/г при исходном уровне 13,02 мг/г. Анализ жирно-кислотного состава масла у реплоидов сои также показал наличие генетических рекомбинаций уровня биохимического синтеза отдельных жирных кислот. У реплоидов сорта Вилана отмечено снижение на 4 абсолютных % содержания олеиновой кислоты с одновременным увеличением на 2-5 абсолютных % содержания линолевой кислоты. Жирно-кислотный состав масла у реплоидов низкомасличного сорта Фора отличался более широким полиморфизмом и по содержанию олеиновой кислоты варьировал от 18,02 до 40,37% при исходном уровне 22,75%, а по содержанию линолевой кислоты - от 43,07 до 60,46% при исходном содержании 55,77%.

Жирно-кислотный состав соевого масла с пониженным, менее 20%, содержанием олеиновой кислоты и повышенным, до 60%, содержанием линолевой кислоты близок к балансу жирных кислот в масле дикорастущих предков сои.

Жирно-кислотный состав масла реплоида из сорта Фора 1338/6 с содержанием олеиновой кислоты 40,37%, удвоенным по сравнению с исходным сортом, и с пониженным до 43,07% содержанием линолевой кислоты является аналогом кунжутного масла и практически не неизвестен в естественном генофонде сои и, следовательно, является примером нового признака, созданного заявляемым способом.

Аналогичным способом можно получать реплоиды с измененными или новыми количественными и качественными признаками у любого вида высших растений.

Получение полиплоидов удвоением плоидности исходных сортов с любым ее начальным уровнем обеспечивает изменение существующих или появление новых признаков за счет нарушений конъюгации и кроссинговера мультивалентных комплексов хромосом в мейозе, сопровождающихся структурными изменениями отдельных участков (локусов).

Выращивание полиплоидов в течение нескольких поколений и одновременный с этим отбор в каждом поколении рекомбинированных полиплоидных форм, отличающихся от базового полиплоидного морфотипа, позволяет выявить и сохранить все визуально различимые морфологические рекомбинации на полиплоидном уровне, т. е. расширить, таким образом, существующий полиморфизм признаков у полиплоидов по количественным и качественным признакам без использования мутагенов различной природы и сформировать популяцию полиплоидных рекомбинантов для последующего выделения реплоидов.

Размножение отобранных рекомбинантных полиплоидных форм, каждой в отдельности, в течение ряда поколений и выделение реплоидных форм обеспечивает повышение частоты встречаемости реплоидов с признаками генетически детерминированных рекомбинаций, образовавшихся на полиплоидном уровне или в процессе деполиплоидизации при редукции плоидности гамет, т.е. позволяет расширить полиморфизм количественных и качественных признаков на реплоидном уровне без использования мутагенов различной природы.

Определение уровня плоидности реплоидов прямым подсчетом хромосом обеспечивает достоверную идентификацию истинных реплоидов с признаками генетической рекомбинации по количеству хромосом, исключая отнесение к этой категории стабилизированных полиплоидов и анеуплоидов, также морфологически отличающихся от исходных сортов или видов растений и их базовых полиплоидных морфотипов, т.е. обеспечивает увеличение полиморфизма стабильно наследуемых количественных и качественных признаков, а также новых или утерянных в процессе филогенеза вида признаков, у истинных реплоидов.

Оценка реплоидов по комплексу хозяйственно ценных признаков с выделением форм, отличающихся от растений с исходной плоидностью измененными или новыми качественными и количественными признаками, позволяет выявить и использовать в селекции растений все положительные генетически детерминированные рекомбинации, т.е. расширить, таким образом, существующий в естественном генофонде вида растений полиморфизм признаков.

Таким образом, заявляемым изобретением обеспечивается достижение поставленной цели и решение поставленной задачи.

Изобретение предназначено для использования в области сельского хозяйства. Способ включает перевод исходных диплоидных сортов на тетраплоидный уровень колхицинированием или другим известным способом. Выделяют реверсивные диплоидные растения по морфологическим и другим хозяйственно ценным признакам и используют их в качестве исходного материала. Получают полиплоиды удвоением плоидности исходных сортов с любым ее начальным уровнем и выращивают их в течение нескольких поколений. Одновременно с этим в каждом поколении отбирают рекомбинированные полиплоидные формы, отличающиеся от базового полиплоидного морфотипа. Отобранные формы размножают, каждую в отдельности, в течение ряда поколений, в каждом из которых выделяют формы с реверсивно кратнопониженной плоидностью - реплоиды по морфологическим, биохимическим или иным признакам, уровень плоидности которых определяют прямым подсчетом хромосом. Оценивают реплоиды по комплексу хозяйственно ценных признаков, выделяя формы, отличающиеся от растений с исходной плоидностью измененными или новыми количественными или качественными признаками. Изобретение позволяет увеличить полиморфизм количественных и качественных признаков растений, получить новые признаки, а также вернуть утерянные в процессе филогенеза признаки без использования мутагенов различной природы. 1 з.п. ф-лы, 3 табл.

1. Способ создания исходного материала для селекции растений, включающий перевод исходных диплоидных сортов на тетраплоидный уровень колхицинированием или другим известным способом, выделение реверсивных диплоидных растений по морфологическим и другим хозяйственно ценным признакам и использование их в качестве исходного материала, отличающийся тем, что получают полиплоиды удвоением плоидности исходных сортов с любым ее начальным уровнем, выращивают полиплоиды в течение нескольких поколений и одновременно с этим в каждом поколении отбирают рекомбинированные полиплоидные формы, отличающиеся от базового полиплоидного морфотипа, отобранные формы размножают, каждую в отдельности, в течение ряда поколений, в каждом из которых выделяют формы с реверсивно кратнопониженной плоидностью - реплоиды, уровень плоидности которых определяют прямым подсчетом хромосом, оценивают реплоиды по комплексу хозяйственно ценных признаков, выделяя формы, отличающиеся от растений с исходной плоидностью измененными или новыми количественными или качественными признаками. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что реплоиды выделяют по морфологическим, биохимическим или иным признакам.