СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ УСТОЙЧИВОСТИ ПОДСОЛНЕЧНИКА К ФУЗАРИОЗУ Российский патент 2003 года по МПК A01H1/04 

Изобретение относится к области сельского хозяйства и может быть использовано в селекции подсолнечника, в частности на улучшение неспецифического иммунитета корневой системы.

По нашим данным неспецифический антимикробный иммунитет корневой системы проявляется в виде раневой реакции коры в ответ на любое повреждение, в том числе и патогенами. Патогены, вызывающие фузариоз и другие гнили, паразитируют в сосудистой системе растения и попадают они туда, преодолевая изначально сопротивление клеток эпидермиса и коры корня. Поэтому очень актуальной является разработка лабораторного метода оценки устойчивости корней подсолнечника к фузариозу на ранних стадиях развития проростков и с использованием простых и дешевых средств.

Известен способ оценки растений на устойчивость к фузариозу по а.с. 1598928, А 01 Н 1/04, Бюл. 38, 1990 г., согласно которому семена испытываемых образцов стерилизуют и проращивают в чашках Петри на фильтровальной бумаге. У проростков отделяют кончики корней длиной 3-5 мм и помещают их в мацерирующий раствор, содержащий ферменты: пектиназу, целлюлазу, хлористый кальций, итаконовую кислоту и воду. После инкубирования под микроскопом подсчитывают количество протопластов. В качестве стандартов используют сорта с известной степенью устойчивости. Наибольшее количество протопластов выделяется у восприимчивых сортов, наименьшее - у устойчивых.

Недостатком способа является его относительная сложность и недостаточная точность.

Известно устройство для оценки устойчивости озимой пшеницы к фузареозной корневой гнили и селекционного материала сои на ранних фазах развития растений, состоящее из кассет, которые включают две боковые пластины из оргстекла с отверстиями диаметром 0,6-0,8 см, три прокладки из полиуретанового поропласта и четыре - из ткани. Прокладки из полиуретанового поропласта используют в качестве субстрата для роста и развития растений, а по тканевым прокладкам поступает вода к семенам, размещенным между ними, из кюветы с водой, в которую помещают собранную кассету таким образом, чтобы тканевые прокладки оказались в воде. Семена перед размещением в кассету в течение двух суток замачивают в чашках Петри в инокулюме патогенного штамма фузариума, выращенного на жидкой среде Чапека. Проращивание семян, размещенных в кассете, проводят в климатической камере в режиме: 12 ч - день при 24^oС, 12 ч - ночь при 20^oC. Через 10 дней кассету разбирают и определяют степень поражения образца по общепринятой методике (в баллах) (см. Устройство для оценки устойчивости селекционного материала сои к фузариозу. О.И. Милякова, В. И. Сичкарь, УДК 632.938.1+632.4:633.34, ж. Селекция и семеноводство, 2, 1986 г., с.2-27).

Недостатком известного устройства является его относительная громоздкость и недостаточная точность.

Известен также способ определения устойчивости растений к микроорганизмам - возбудителям белой и серой гнили и их токсинам по а.с. 1020067, А 01 С 7/00//А 01 Н 1/04, публ. 1983 г., включающий проращивание семян во влажной камере до образования зародышевых корешков, высаживание их в отверстия на пластинах из фольги, размещение фольговых пластин с проростками в пластмассовых кюветах, наполненных водой так, чтобы зародышевые корни погружались в воду, выращивание проростков до образования боковых корешков, инокуляцию зародышевых корней путем приподнимания пластин с проростками, замены воды в кюветах смесью гомогената мицелия и культуральной жидкости возбудителя гнили и опускания пластин в кюветы с обеспечением погружения в содержимое кювет зародышевых корешков, инкубирование при 20-24^oC во влажной камере в течение 48 ч и визуальную оценку иммунологической реакции растений по появлению некрозов в виде утолщений на зародышевых корнях и по образованию новых боковых корешков над зоной некрозов (прототип способа).

Недостатком известного способа является относительная сложность приготовления патогена, относительная длительность периода заражения проростков и в целом способа определения устойчивости.

Настоящим изобретением решается задача расширения методов и средств для осуществления селекции подсолнечника на улучшение неспецифического антимикробного иммунитета его корневой системы за счет повышения эффективности заражения и качества отбора устойчивых к фузариозу растений, ускорения процесса оценки, снижения затрат, повышения удобства в работе.

Цель изобретения - упрощение операции приготовления патогена, защита работников от вредного воздействия токсинов патогена, уменьшение возраста проростков, подвергаемых заражению, сокращение периода их заражения, а также применение для этого простых и дешевых средств, выпускаемых в серийном производстве и имеющихся почти в каждой лаборатории, с незначительной их доработкой.

Технический результат достигается тем, что в известном способе определения устойчивости растений к микроорганизмам - возбудителям гнили и их токсинам, включающем приготовление патогена, проращивание семян во влажной среде, высаживание двухдневных проростков на плоское основание с отверстиями, размещаемое на емкости с патогеном, инокуляцию путем выдерживания проростков в контакте с патогеном и визуальную оценку иммунологической реакции растения, согласно изобретению в качестве патогена используют 15-дневную культуру гриба фузариума, выращенного в чашках Петри, в качестве плоского основание с отверстиями для высаживания в них двухдневных проростков используют отперфорированные крышки чашек Петри, инокуляции подвергают двухдневные проростки в течение 6-ти ч, затем зараженные проростки выдерживают в контакте со стерильной водой в течение 3-х дней во влажной камере, а визуальную оценку иммунологической реакции растения осуществляют по распространению поражения на корневую шейку и гипокотиль.

Сопоставительный анализ заявляемого технического решения с прототипом позволяет сделать вывод, что заявляемый способ отличается от известного формой используемого патогена (15-дневная культура гриба вместо смеси гомогената мицелия гриба и культуральной жидкости), возрастом проростков, подвергаемых инокуляции (двухдневные вместо 4-5-дневных), продолжительностью выдерживания проростков в контакте с патогеном (6 ч вместо 48 ч), дополнительной операцией выдерживания зараженных проростков во влажной камере, признаками, по которым определяется устойчивость растений к фузариозу, а также применяемыми элементами. Таким образом, заявляемое техническое решение соответствует критерию патентоспособности - новизна.

Исследуя уровень техники в процессе проведения патентного поиска по всем видам сведений, общедоступных в печати, мы не выявили технических решений, имеющих совокупность отличительных признаков заявляемого технического решения. Вся совокупность отличительных от прототипа признаков является новой, следовательно, заявляемое техническое решение соответствует критерию патентоспособности - изобретательский уровень.

Заявляемое техническое решение соответствует и критерию патентоспособности - промышленная применимость, т.к. может быть использовано в сельском хозяйстве, в частности в селекции подсолнечника на иммунитет к фузариозу. И, кроме того, в описании изобретения представлены средства и методы, с помощью которых возможно осуществление технического решения в том виде, как оно охарактеризовано в формуле изобретения.

Способ осуществляют следующим образом.

Для приготовления патогена выращивают 15-дневную культуру гриба фузариума в чашках Петри по известной методике. Пока гриб растет, за два дня до закладки опыта, проращивают семена подсолнечника во влажной среде. Двухдневные проростки высаживают в отверстия оперфорированной чашки Петри и ставят ее на чашку Петри с 15-дневным грибом фузариума, сняв с последней крышку, под которой выращивали гриб. Инокуляцию проводят в течение 6-ти ч, выдерживая проростки в контакте с грибом кончиками корней проростков, а затем зараженные проростки выдерживают в контакте со стерильной водой во влажной камере в течение 3-х дней, после чего осуществляют визуальную оценку иммунологической реакции растений по распространению поражения на корневую шейку и гипокотиль.

Пример осуществления способа.

Готовили сусловый агар по методике Билай, разливали в стерильные чашки Петри и после его остывания высевали туда чистую культуру фузариума. Чашки Петри накрывали крышками без отверстий и выращивали гриб в течение 15-ти дней при температуре 21-24^oС и дневном свете. За два дня до закладки опыта (на 13-й день выращивания гриба) проращивали семена подсолнечника в рулонах фильтровальной бумаги при том же температурном режиме. Затем на 15-й день выращивания культуры гриба с чашки Петри с грибом снимали крышку и для сохранения чистоты окружающей среды эту крышку помещали в пластиковый пакет, а на чашку Петри с грибом ставили такую же по размеру отперфорированную крышку Петри, например с 20-ю сквозными отверстиями диаметром 1-2 мм. В эти отверстия помещали двухдневные проростки, очищенные от лузги так, чтобы кончик корня соприкасался с инфекцией. Проростки выдерживали в контакте с грибом в течение 6-ти ч, затем крышку с зараженными проростками снимали с чашки Петри с грибом и переносили на чашку Петри со стерильной водой, а чашку с грибом закрывали ее же крышкой, взятой из пластикового пакета. Обеспечивали контакт кончиков корней зараженных проростков со стерильной водой таким обрезом: дно чашки Петри покрывали кружком фильтровальной бумаги, смоченной стерильной водой, и добавляли стерильную воду до установления соответствующего уровня, необходимого для контакта кончиков корней проростков с ней. Это простое устройство, состоящее из чашки Петри с водой и перфорированной крышки с зараженными проростками, помещали во влажную камеру, для чего брали полиэтиленовую пленку, складывали ее вдвое, на ее нижнюю часть помещали увлажненную ткань и на нее ставили указанное выше устройство, которое накрывали верхней частью пленки, а края пленки загибали. Устройство с зараженными проростками выдерживали во влажной камере в течение 3-х дней, а затем устройство извлекали из влажной камеры, и осуществляли визуальную оценку иммунологической реакции растения по распространению поражения на корневую шейку и гипокотиль: к восприимчивым относили те растения, у которых поражение распространилось по всему корню на корневую шейку и гипокотиль, а к устойчивым - те растения, у которых поражение не распространилось на верхнюю треть корня и корневую шейку и из здоровой верхней трети корня образовались боковые корешки. Отобранные устойчивые растения высаживали в почву, получали от них здоровое потомство и вовлекали его в последующий селекционный процесс.

Выращивание 15-дневной чистой культуры гриба фузариума в чашках Петри для приготовления патогена обеспечивает упрощение операции приготовления патогена и удобство выполнения последующих операций.

Использование отперфорированных крышек Петри в качестве плоского основания для высаживания на нем двухдневных проростков обеспечивает упрощение и удешевление способа за счет применения простых и дешевых средств, выпускаемых в серийном производстве и имеющихся почти в каждой лаборатории, с незначительной их доработкой. Кроме того, оно сводит до минимума контакт исследователя с патогеном.

Инокулирование проростков в двухдневном возрасте и выдерживание их в контакте с грибом в течение 6-ти ч, а затем в контакте со стерильной водой во влажной камере в течение 3-х дней ускоряет процесс заражения и в целом процесс оценки.

Визуальная оценка иммунологической реакции растения по распространению поражения на корневую шейку и гипокотиль обеспечивает высокое качество и точность отбора.

В целом вся совокупность существенных признаков заявляемого изобретения обеспечивает упрощение и ускорение способа определения устойчивости подсолнечника к фузариозу и решение поставленной задачи - повышение эффективности заражения и качества отбора устойчивых к фузариозу растений, а следовательно, способствует осуществлению селекции подсолнечника на улучшение неспецифического иммунитета его корневой системы.

Изобретение предназначено для использования в области сельского хозяйства. Способ включает приготовление патогена, проращивание семян во влажной среде и высаживание двухдневных проростков на плоское основание с отверстиями, размещаемое на емкости с патогеном. Инокуляцию проводят путем выдерживания проростков в контакте с патогеном, затем осуществляют визуальную оценку иммунологической реакции растения. При этом в качестве патогена используют 15-дневную культуру гриба фузариума, выращенную в чашках Петри. В качестве плоского основания с отверстиями для высаживания в них двухдневных проростков используют отперфорированные чашки Петри. Инокуляции подвергают двухдневные проростки в течение 6 ч, после чего зараженные проростки выдерживают в контакте со стерильной водой во влажной камере в течение 3 дней. Визуальную оценку иммунологической реакции растения осуществляют по распространению поражения на корневую шейку и гипокотиль. Способ позволяет упростить операции приготовления патогена и заражения им проростков, защитить работников от вредного воздействия токсинов и снизить затраты.

Способ определения устойчивости подсолнечника к фузариозу, включающий приготовление патогена, проращивание семян во влажной среде, высаживание двухдневных проростков на плоское основание с отверстиями, размещаемое на емкости с патогеном, инокуляцию путем выдерживания проростков в контакте с патогеном и визуальную оценку иммунологической реакции растения, отличающийся тем, что в качестве патогена используют 15-дневную культуру гриба фузариума, выращенную в чашках Петри, в качестве плоского основания с отверстиями для высаживания в них двухдневных проростков используют отперфорированные чашки Петри, инокуляции подвергают двухдневные проростки в течение 6 ч, затем зараженные проростки выдерживают в контакте со стерильной водой во влажной камере в течение 3 дней, а визуальную оценку иммунологической реакции растения осуществляют по распространению поражения на корневую шейку и гипокотиль.