ПОЛИМЕРНАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ МАКРОПОРИСТОГО АГАРОЗНОГО ГЕЛЯ И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ Российский патент 2004 года по МПК C08L5/12 C08J3/02 

Изобретение относится к технологии высокомолекулярных соединений, а именно к полимерным гелям и способам их получения.

Более конкретно изобретение касается макропористых гелей на основе агарозы - нейтрального полисахарида, входящего в состав агар-агара. Наиболее эффективно заявляемые материалы могут быть использованы в биотехнологии в качестве гелевой матрицы для получения хроматографических носителей, предназначенных для работы с биологическими наночастацами, или для приготовления плотных сред для культивирования растительных и животных клеток.

Агароза и гидрогели на ее основе широко используются в прикладной биохимии и биотехнологии. Известны агарозные гели биотехнологического назначения, которые находят применение в качестве гелевой основы хроматографических носителей [Каталог фирмы "Amersham Pharmacia Biotech" (Швеция), 1998. С. 185. ], сред для электрофореза или иммунодиффузии [Л.А. Остерман. "Методы исследования белков и нуклеиновых кислот" М.: Наука, 1981. С.16] и др. Эти гелевые материалы получают охлаждением горячих (60-98^oС) 0,3-6% водных растворов агарозы до 40-20^oС. При этом исходные растворы гелеобразующего полимера могут содержать растворимые добавки типа буферных солей, детергентов и др. [Л. А. Остерман. "Методы исследования белков и нуклеиновых кислот" М.: Наука, 1981. С. 16]. После охлаждения таких растворов данного полисахарида получаются гели с размером пор, позволяющим диффундировать в них макромолекулам с массой порядка 10⁶-10⁸ дальтон и размерами не более 10 нм [Каталог фирмы "Amersham Pharmacia Biotech" (Швеция), 1998. С.185; Л.А. Остерман. "Методы исследования белков и нуклеиновых кислот" М.: Наука, 1981. С.16]. Однако более крупные объекты, например биологические наночастицы типа крупных плазмид, белковых мицелл, вирусов или даже целых клеток из-за своих больших размеров (100-1000 нм) практически не проникают в подобные агарозные гели (далее "обычные" агарозные гели). Поэтому такие гели только с низкой эффективностью могут быть использованы для работы с биологическими наночастицами.

Известны хроматографические носители на основе "обычных" гелей агарозы для биоаффинного разделения клеток [Каталог фирмы "Amersham Pharmacia Biotech" (Швеция), 1998. С.6]. Это - сферические гранулы (диаметр 250-350 мкм) агарозного геля с пришитыми к ним аффинными лигандами. Взаимодействие клеток и биоаффинных гуппировок таких биосорбентов происходит только по поверхности частиц носителя, емкость которого поэтому очень низкая, т.к. внутренние области гранул "обычного" агарозного геля не доступны для проникновения в них столь крупных сорбатов, как целые клетки.

Один из путей преодоления этого недостатка "обычных" агарозных гелей - придание им макропористой морфологии с взаимосвязанными крупными порами размером больше, чем размеры биологических наночастиц. В этом случае появляется возможность использовать для взаимодействия агарозного геля с указанными биологическими наночастицами не только поверхность гелевой матрицы, но и ее внутреннее пространство.

Известны так называемые "суперпористые" (superporous) агарозные гели и способ их получения, приводящий к формированию макропористой морфологии гелевых материалов на основе агарозы, обладающих крупными порами размерами 20-200 или 0,5-500 мкм [P.-O.Larsson, Super porous polysaccharide gels. // WO 93/19115 (1993); P.-E.Gustavsson, P.-O.Larsson, Continuous superporous agarose beds for chromatography and electrophoresis. // J. Chromatogr. A. V. 832. 1. Р. 29-39 (1999)]. Получения этих гелей включает следующие основные стадии:
а) приготовление водного раствора агарозы;
б) приготовление эмульсии типа "масло в воде" (стабилизированная детергентом фаза органического растворителя, диспергированная в водной фазе);
в) гелеобразование содержащей агарозу водной фазы при снижении температуры;
г) удаление органической фазы промывкой образовавшегося макропористого агарозного геля определенной системой растворителей.

Сначала готовят водный раствор агарозы (предпочтительно, 6%-ный) при 95-100^oС, который затем охлаждают до 60^oС. Далее проводят смешение (с контролируемой скоростью) этого горячего (60^oС) раствора с несовместимым с водой органическим растворителем (выбранным из группы: циклогексан, гептан, толуол) и неионным детергентом, например Tween 80 (смешанный триолеиновый и монодидекаэтиленгликольный эфир сорбита), при объемном соотношении указанных компонентов 100:100:6, с последующим перемешиванием в течение 4 мин при 1000 об/мин. Затем понижают температуру системы до 20-25^oС, что приводит к желированию агарозы. В итоге образуется двухфазный гель, крупные сообщающиеся поры которого заполнены раствором детергента в органическом растворителе (чаще всего используется циклогексан), выполняющего таким образом роль органического порообразователя. Для удаления органической фазы полученный гель промывают большим количеством 50%-ного спирта и окончательно - дегазированной водой. Полученный таким образом макропористый гелевый материал (он может быть приготовлен в виде гранул, диска или блока) обладает развитой системой макропор с размерами большими, чем биологические наночастицы, и поэтому может быть использован в качестве основы для приготовления сорбентов (например, биоаффинных), предназначенных для работы с указанными биологическими объектами.

Это техническое решение, как наиболее близкое к заявляемому по структуре конечного продукта, принято за прототип.

Данный прототип имеет следующие недостатки.

1. Исходная композиция для получения "суперпористых" агарозных гелей по способу-прототипу включает большой объем (равный объему раствора агарозы) легковоспламенящейся жидкости (ЛВЖ: циклогексан, гептан или толуол), которая к тому же является дорогим органическим растворителем, но фактически используется только однократно, т. к. после формирования целевого геля органический порообразователь вымывается 50%-ным спиртом. При этом органический растворитель сильно разбавляется, что делает его регенерацию абсолютно нецелесообразной. Наличие же в исходной композиции еще и значительных количеств детергента (6 об.% от объема раствора агарозы) требует использования больших объемов промывной жидкости для удаления поверхностно-активного вещества из геля. При этом дорогой детергент, как и органический порообразователь, используется однократно и не регенерируется. В целом присутствие в промывных водах органического растворителя и ПАВ превращает стоки производства прототипа - "суперпористого" агарозного геля - в экологически опасные, особенно в случае использования толуола в качестве органического порообразователя.

2. Способ-прототип сложен, многостадиен и малотехнологичен. Как показали проверочные эксперименты, наиболее плохо воспроизводимой стадией является процесс получения эмульсии органической фазы в растворе агарозы. В зависимости от объема и формы сосуда, в котором проводится высокоскоростное смешивание компонентов исходной композиции, а также формы и размеров мешалки, получаются различные по своим свойствам (размерам макропор) целевые агарозные гели. Поэтому в каждом конкретном случае необходимо проводить дополнительный трудоемкий подбор режимов перемешивания.

3. Способ-прототип характеризуется высокой пожаро- и взрывоопасностью, поскольку при скоростном перемешивании горячих (60^oС) жидкостей, одна из которых является горючим органическим растворителем, образуется много паров ЛВЖ. Так как для перемешивания обычно используются мешалки с электромоторами, то даже малейшего искрения движущихся частей электромотора достаточно для воспламенения этих паров.

Задачей предлагаемого изобретения является получение макропористого агарозного геля простым, технологичным, пожаробезопасным и экологически чистым способом.

Указанная задача решается тем, что композиция для получения макропористого агарозного геля содержит агарозу, воду и водорастворимую добавку, выбранную из группы: мочевина, N-метилмочевина, ацетамид, гуанидин-гидрохлорид, гидроксид щелочного металла или аммония, роданид щелочного металла или аммония, при следующем соотношении компонентов, мас.%: агароза 1-5; водорастворимая добавка 2-50; вода до 100. Способ получения макропористого агарозного геля заключается в том, что ингредиенты композиции растворяют в воде, полученный раствор замораживают при температуре -5...-50^oС, выдерживают в замороженном состоянии 1-24 ч и размораживают с последующей промывкой полученного макропористого агарозного геля водой.

Согласно заявляемому изобретению размораживание проводится с использованием общепринятых методик размораживания. Единственным ограничением является то, что температура, при которой проводится оттаивание образцов, не должна превышать температуру плавления самих агарозных криогелей, т.е. быть не выше 70-75^oС, в противном случае не достигается необходимый технический результат - образуется раствор агарозы, а не макропористый криогель.

Получаемый макропористый агарозный гель имеет макропоры размером от 0,01 до 1 мм (10-1000 мкм). Согласно заявляемому способу макропористый агарозный гель может быть приготовлен любой геометрической формы: в виде блоков, пластин, дисков, гранул, частиц неправильной формы (получаются измельчением блока), трубок и др. Промывные воды, в случае применения щелочной водорастворимой добавки в составе исходной композиции, могут быть нейтрализованы прибавлением водного раствора минеральной кислоты (например, соляной, азотной или серной).

Конкретные примеры заявляемых составов и режимов получения целевых макропористых агарозных гелей приведены в таблице.

Заявляемое техническое решение имеет следующие преимущества перед прототипом.

1. Композиция для получения макропористого агарозного геля не содержит ЛВЖ и ПАВ, поэтому состав композиции существенно проще, чем в прототипе, т. е. в заявляемом техническом решении достигается цель упрощения состава исходной композиции. Кроме того, для получения целевого продукта - "суперпористого" агарозного геля - в способе прототипе требуется проведение специальной стадии тщательно контролируемого смешения исходных ингредиентов, тогда как в заявляемом техническом решении исходная композиция представляет собой просто раствор ингредиентов, для получения которого необходимы самые простые операции, не требующие соблюдения каких-то строго детерминированных режимов перемешивания.

2. Поскольку исходная композиция в заявляемом техническом решении не содержит органических растворителей, плохо совместимых с водной средой, и ПАВ, то для промывки получаемых макропористых агарозных гелей от применяемых добавок, хорошо растворимых в воде, не требуется использования больших объемов промывной жидкости. Таким образом достигается упрощение стадии промывки целевого продукта. Используемые в заявляемом техническом решении водорастворимые добавки являются биоразлагаемыми, с которыми легко справляются существующие системы очистки сточных вод. В случае добавок щелочной природы последние перед сливом в очистные сооружения разбавляются и нейтрализуются добавлением минеральной кислоты, поэтому сточные промывные воды в этом случае представляют собой просто разбавленные водные растворы биогенных солей.

3. Заявляемый способ включает меньшее число стадий по сравнению со способом-прототипом. Фактически новый способ включает только три стадии: приготовление водного раствора исходных ингредиентов, его замораживание в заявляемых режимах и промывку после оттаивания. Роль порообразователя в заявляемом техническом решении выполняют кристаллы льда, образующиеся при замораживании исходного раствора, а не специально привносимый большой объем органического порообразователя, как в способе-прототипе. Поэтому заявляемый способ по сравнению со способом-прототипом более технологичен.

4. Заявляемый способ характеризуется практически полной пожаро- и взрывобезопасностью, поскольку не предусматривает использования ЛВЖ ни на одной из стадий процесса.

Наиболее эффективно заявляемые материалы могут быть использованы в биотехнологии в качестве хроматографических или адсорбционных матриц, предназначенных для работы с биологическими наночастицами, а также для приготовления плотных сред для культивирования растительных и животных клеток.

Изобретение относится к технологии высокомолекулярных соединений, а именно к полимерным гелям и способам их получения, и может быть использовано в биотехнологии в качестве гелевой матрицы для получения хроматографических носителей. Полимерная композиция для получения макропористого агарозного геля с размером пор 10-1000 мкм содержит агарозу, воду и добавку. Используют водорастворимую добавку, выбранную из группы: мочевина, N-метилмочевина, ацетамид, гуанидингидрохлорид, гидроксид щелочного металла или аммония, роданид щелочного металла или аммония, при следующем соотношении компонентов, мас. %: агароза 1-5, указанная водорастворимая добавка 2-50, вода остальное. Способ получения вышеуказанного геля заключается в том, что ингредиенты композиции растворяют в воде, полученный раствор замораживают при температуре (-5)÷(-50)^oС в течение 1-24 ч и размораживают с последующей промывкой полученного макропористого агарозного геля водой. Изобретение обеспечивает получение геля простым, технологическим, пожаробезопасным и экологически чистым способом. Способ уменьшает стадии процесса. 2 с.п.ф-лы., 1 табл.

1. Полимерная композиция для получения макропористого агарозного геля с размером пор 10-1000 мкм, содержащая агарозу, воду и добавку, отличающаяся тем, что используют водорастворимую добавку, выбранную из группы: мочевина N-метилмочевина, ацетамид, гуанидингидрохлорид, гидроксид щелочного металла или аммония, роданид щелочного металла или аммония при следующем соотношении компонентов, мас.%

Агароза 1-5

Указанная водорастворимая добавка 2-50

Вода Остальное