Способ исследования биологических объектов с использованием тонкостенных армированных гелевых препаратов Российский патент 2025 года по МПК G01N21/25 G01N33/48 

Изобретение относится к области биотехнологии и предназначено для расширения возможностей аналитической спектрометрии при исследованиях биологических и биогенных объектов, находящихся в гелевых средах. Изобретение позволяет быстро оценивать восстановительную активность биологических объектов в отношении катионов на основании визуализации формирующихся в гелевых средах de novo металлических нанокристаллических структур.

Гелевые препараты широко используются при исследованиях самых разных биологических объектов. Так, в области микробиологии наиболее известен метод использования геля для двуслойного культивирования микроорганизмов с целью обнаружения и изучения бактериофагов и археофагов. По протоколу этого метода в чашках Петри поверх необходимой агаризованной среды формируют верхний полужидкий слой геля, во всём объёме которого клетки культуры-хозяина равномерно распространяются при делении, давая возможность вирусам обнаруживать своё присутствие формируя зоны лизиса клеток (так называемые негативные колонии). В агробиотехнологии более плотные гели альгината кальция применяют при приготовлении так называемых «умных семян» для создания вокруг зёрен сельскохозяйственных растений защитного слоя, содержащего живые клетки специально подобранных культур микроорганизмов, а также ростовые добавки, способствующие быстрому и надёжному укоренению растения в почве. В последние годы с развитием технологии 3D-биопринтинга расширяется использование питательных гелей как ростовой среды для культивирования клеток человека в процессе выращивания искусственных тканей [Vyazmin et al., 2021]. В медицине всё шире используют гелевые препараты для пролонгированного характера доставки лекарств к клеткам поверхностных слоёв тканей [Wang et al., 2024].

Оценка общей метаболической активности, а также скорости роста живых клеток требуется в большинстве исследований биологических объектов. Уровень метаболической активности клеток проявляется в способности поглощать из среды органические ростовые субстраты и выделять продукты метаболизма. Поскольку некоторые из секретируемых соединений способны выполнять функции доноров электронов, уровень метаболической активности клеток строго коррелирует с уровнем секреции ими биогенных восстановителей катионов [Zhou et al., 2013]. Ранее мы показали, что оценка метаболической активности исследуемых биологических объектов может проводиться на основании определения уровня метаболической восстановительной активности клеток, то есть по их способности восстанавливать катионы, искусственно внесённые в исследуемые пробы, что проявляется в способности генерировать de novo металлические наночастицы [Sorokin et al., 2013, Складнев, Сорокин, 2023]. Свежие суспензии метаболически активных клеток микроорганизмов способны быстро (за 15 минут) восстанавливая катионы серебра формировать сначала нанокластеры нуль-валентных атомов (размером порядка 0,5-1,5 нм), а затем и наночастицы, диаметром до 250-400 нм. Напротив, покоящиеся микробные клетки, суспензии спор или вирусных частиц в аналогичных условиях реакции восстановления катионов за то же время формируют биогенные наночастицы, диаметр которых редко превышает 10-15 нм. В стерильных образцах ростовых сред и иных жидкостей (даже в присутствии молекул-восстановителей) из искусственно внесённых катионов формируются только нанокластеры восстановленных нуль-валентных атомов. Ранее нами был разработан способ оценки присутствия метаболически активных клеток в исследуемых водных образцах, основанный на регистрации процесса формирования de novo биогенных наночастиц из искусственно внесённых в пробы стерильных растворов солей металлов [Складнев с соавт., 2016, Патент РФ 2641960].

Наночастицы разного состава и размеров всё шире используются при проведении исследований во многих областях науки и в технологических процессах. Кристаллическая структура наночастиц металлов позволяет использовать большое число аналитических методов для регистрации параметров их кристаллов. Для детекции металлических наночастиц широко используют их специфические оптические свойства, обусловленные явлением поверхностного плазмонного резонанса, высокоразвитой поверхностью, высокой емкостью двойного электрического слоя. При размерах нанокристаллов, соизмеримых с длиной волны Ферми для электронов, из-за дискретных электронных состояний, вызванных сильным квантовым удержанием свободных электронов, наночастицы металлов проявляют супрамолекулярные свойства. Одной из уникальных особенностей нанокластеров и малоразмерных наночастиц многих металлов (размером 2-5 нм) являются их выраженные флуоресцентные свойства. При формировании de novo по мере увеличения размера нанокристаллов соотношение поверхностных и глубинных атомов металлических наноструктур изменяется, что приводит к смещению излучения флуоресценции и даже её полному гашению.

Спектрометрия в видимом и ультрафиолетовом диапазоне длин волн один из важнейших методов исследования самых разных объектов в биологии и медицине. Спектрометрия гелевых препаратов, помещённых в стандартные кюветы, практически не отличается от спектрометрии водных растворов и суспензий. Однако механические свойства тонких полужидких гелевых препаратов существенно усложняют получение информации об оптических свойствах находящихся в них компонентов, что затрудняет проведение исследований (в частности - визуализацию процессов, происходящих в полужидких гелях во времени). Таким образом, потребность в разработке новых подходов для спектрометрии тонкослойных полужидких гелевых препаратов является актуальной. В заявляемом способе предлагается способ и приспособления, расширяющие возможности использования тонкослойных полужидких гелевых препаратов для аналитических исследований находящихся в них биологических и биогенных объектов с применением методов спектрометрии. Конкретной задачей заявляемого изобретения является разработка способа и приспособлений для получения возможности использования спектрометрических исследований тонкослойных полужидких гелевых препаратов, в которых проводится генерация de novo биогенных наночастиц металлов, что отражает уровень метаболической активности исследуемых биообъектов.

Гидрогели представляют собой систему с жидкой дисперсной средой и образуемой частицами пространственной структурой (сеткой). Такая сетка придает гелям пластичность, эластичность, а также тиксотропные механические свойства твердых тел. Поскольку визуализация металлических нанокристаллических структур, формирующихся de novo в гелевых средах, проводится с применением спектрометрии, предложено для сохранения формы исследуемых препаратов тонкослойных полужидких гелей армировать их путём нанесения на фрагменты нейлоновой ткани. Нейлоновая ткань из тонкой нейлоновой нити не деформируется при нанесении на неё расплавленного геля, сохраняет первоначальную форму под воздействием воды, по своим химическим свойствам нейтральна в отношении как катионов, так и органических соединений доноров электронов. Поскольку тонкослойные агарозные гели предназначаются для спектрометрических исследований в ультрафиолетовом и видимом диапазоне длин волн важно, что нейлоновые нити прозрачны и имеют глянцевую поверхность. В целом армирующая сеточка из нейлоновой ткани достаточно надёжно повышает стабильность формы тонкослойных полужидких гелей и позволяет свободно перемещать исследуемые гелевые препараты, что важно для проведения спектрометрии присутствующих в них биогенных нанокристаллических компонентов (Фиг. 1).

Заявляемое изобретение объединяет способ быстрой оценки восстановительной (общей метаболической) активность биологических объектов в отношении катионов на основании визуализации формирующихся de novo металлических нанокристаллических структур (при восстановлении источника катионов в присутствии биогенных молекул-восстановителей, происходящим в самом гелевом препарате), и приспособлений, позволяющих использовать тонкослойные гели для спектрометрических исследований в ультрафиолетовом и видимом диапазоне длин волн что достигается применением армирования тонкослойных гелевых препаратов (нейлоновая ткань как прозрачный инертный армирующий материал). В целом заявляемый способ реализуется при использовании армированных гелевых препаратов с источником катионов (в которых катионы являются фактическими сенсорами восстановителей), путём нанесения на поверхность геля исследуемых суспензий или растворов биологических объектов как источников молекул-восстановителей катионов для генерации нанокристаллов.

Для расширения использования армированных гелевых препаратах в исследованиях биологических и биогенных объектов, предлагается несколько вариантов введения в тонкослойные гелевые препараты с источниками катионов молекул-восстановителей катионов, секретируемых исследуемыми биологическими объектами. Так, для исследования концентрированных суспензий клеток микроорганизмов предлагается наносить их поверх накладываемых на гель стерилизующих фильтров, которые пропускают секретируемые молекулы-восстановители, и которые позволяют полностью удалить все нанесённые клетки перед спектрометрическим исследованием гелевого препарата. Для исследования химических восстановителей предлагается использовать накладываемые на гель силиконовые кольцеобразные ограничители (шайбы), позволяющие наносить точные объёмы исследуемых растворов молекул-восстановителей именно на тот участок поверхности гелевых препаратов с источником катионов, в котором позже проводят спектрометрическое определение присутствия нанокристаллических продуктов восстановления катионов. Предложена конструкция разборного держателя армированных гелевых препаратов для возможности проведения спектрометрических исследований компонентов тонкослойных гелей в ультрафиолетовом и видимом диапазоне длин волн. Разборный держатель тонкослойного армированного гелевого препарата своими размерами повторяет размеры кюветодержателей стандартных кювет для спектрометров. Конструкция держателя (Фиг. 2), принципиально аналогична конструкции держателя для образцов, применяемого для просвечивающей электронной микроскопии. Держатель представляет собой две пластины, обеспечивающие надёжное удержание тонкослойного армированного гелевого препарата между ними. Возможность помещения армированного гелевого препарата между пластинами держателя обеспечивается шарнирным соединением пластин у основания. Общие размеры двух пластин, сложенных вместе, соответствуют размерам стандартных кювет для спектрометров (12 × 12 × 45 мм). В обеих пластинах держателя имеются соосные сквозные отверстия для прохождения светового потока через исследуемую среду тонкослойного армированного гелевого препарата. Отверстия пластин держателя диаметром не менее 7-8 мм расположены на стандартном расстоянии от основания кюветодержателя (10-12 мм). Армированный нейлоновой тканью тонкослойный гелевый препарат помещают между пластинами держателя так, чтобы часть геля, подлежащая спектрометрическому исследованию, находилась между отверстий обеих пластин на пути светового потока. Держатель с исследуемым армированным гелевым препаратом помещается либо в кюветодержатель кюветного отделения спектрофотометра, либо в держатель образца интегрирующей сферы Ульбрихта.

В качестве прототипа наиболее близким по решению технической задачи с заявляемым изобретением нами выбран Патент РФ 2793821 «Способ применения биополимерных композитов, армированных углеродными нанотрубками для повышения нефтеотдачи пластов» [Макарова с соавт., 2023]. Техническим результатом данного изобретения является повышение механической прочности гидрогеля, закачиваемого в пласт для повышения эффективности вытеснения нефти, путём введения в его состав геля препарата многостенных углеродных нанотрубок (УНТ) в качестве армирующей добавки. Проведенные авторами исследования физико-химических и реологических свойств гидрогелей высокомолекулярных биополимеров в чистом виде, и в комбинации с нанотрубками, показали существенное влияние УНТ на морфологию, гелеобразование и реологические характеристики гидрогелей при высоких сдвиговых напряжениях. Кроме того, авторы отмечают, что добавка УНТ в гидрогель ускоряет процесс отверждения образца, благодаря интенсивному росту поперечных связей при образовании трехмерной структуры геля, что в целом увеличивает прочность биополимерных комплексов гелеобразных систем [Jiao et al., 2009].

Существенные преимущества заявляемого нами способа в сравнении с прототипом следующие.

1. В заявляемом способе для сохранения формы тонкослойных агарозных гелей в качестве армирующего материала используют прозрачную, химически нейтральную нейлоновую ткань.

2. Для спектрометрического исследования тонкослойного армированного геля препарат помещают в разборный держатель, своими размерами повторяющий размеры стандартных кювет для спектрометров, после чего держатель с препаратом располагают в кюветодержателе спектрофотометра на пути светового потока.

3. Для спектрометрического исследования тонкослойного геля с применением интегрирующей сферы Ульбрихта держатель с армированным препаратом располагают в держателе образца.

4. Спектрометрия препаратов тонкослойных армированных гелей не требует использования стеклянных или кварцевых кювет и позволяет измерение флюоресценции нанокристаллов непосредственно в гелевых препаратах.

5. Спектрометрия препаратов тонкослойных армированных гелей проста в исполнении, не требует использования дорогостоящих реагентов, не снижает высокой точности используемого аналитического оборудования.

6. К недостаткам прототипа можно отнести изменение распределения пор по размеру (от мезо- до макропор) в зависимости от присутствия армирующих УНТ в слабосвязанной биополимерной сетке волокон гидрогеля, что существенно при исследовании распределения параметров нанокристаллических структур, формирующихся непосредственно в гидрогеле.

Техническим результатом заявленного нами изобретения является возможность проведения быстрого и малозатратного определения уровня формирования de novo металлических нанокристаллических структур в полужидких гелевых средах, что позволяет оценивать восстановительную активность исследуемых биологических объектов в отношении катионов, введённых в эти «сенсорные» гели. Указанный технический результат достигается тем, что приготовленные армированные тонкослойные препараты полужидких гелей, содержащие источник катионов (серебра), приводят в соприкосновение с препаратом исследуемого биологического объекта (это могут быть суспензии клеток чистых культур микроорганизмов, микробных сообществ, колоний микроорганизмов, фрагментов тканей и т.п.). Проникновение в гель с катионами раствора биогенных молекул-восстановителей мгновенно запускает реакцию восстановления катионов, из-за чего в гелевой среде начинается формирование de novo сначала нанокластеров восстановленных нуль-валентных атомов, а затем из них путём самосборки и более крупных биогенных нанокристаллических структур. Применение методов спектрометрии или визуальной колориметрической оценки позволяет быстро и точно детектировать нанокристаллические структуры непосредственно в тонкослойных армированных гелевых препаратах. Для проведения различных типов спектрометрических исследований тонкослойных гелевых препаратов может быть использована заявленная нами ранее новая модификация устройства интегрирующей сферы Ульбрихта [Складнев с соавт., Патент РФ 2797775, 2023].

Эффективность заявляемого способа достигается тем, что приготовленные армированные тонкослойные препараты полужидких гелей содержат источник катионов серебра в концентрации, обеспечивающей быстрое (за несколько минут) формирование de novo металлических нанокристаллических структур, параметры которых отражают уровень биосинтеза биогенных молекул-восстановителей катионов в исследуемом препарате биологического объекта.

Малозатратность предлагаемого процесса определяется низкой ценой используемых реактивов и широкой распространённостью спектрометрических приборов в целевых лабораториях (эколого-аналитических и санитарно-эпидемиологических лабораториях медицинских учреждений, а также в химических, оптических, биологических лабораториях промышленных предприятий, научно-исследовательских и учебных институтов). Предлагаемый разборный держатель тонкослойных армированных гелей прост в изготовлении, его размеры соответствует размерам кюветодержателей стандартных кювет для спектрометров.

Основной целью разработки предлагаемого изобретения является создание метода и приспособлений для получения возможности спектрометрии тонкослойных полужидких гелей, в которых при взаимодействии источника катионов и молекул-восстановителей, секретируемых живыми клетками, происходит генерация de novo биогенных наночастиц металлов.

Дополнительный поиск известных решений показал, что заявленное изобретение не вытекает для специалиста явным образом из известного уровня техники, следовательно, данное изобретение соответствует условию «изобретательский уровень».

Осуществление заявляемого изобретения иллюстрируется следующими примерами и фигурами:

На фиг. 1 представлены готовые тонкослойные армированные гелевые препараты - исходное состояние гелевого препарата, содержащего источник катионов серебра (А), гелевый препарат после проведения восстановления катионов и генерации de novo нанокристаллических продуктов (В).

На фиг. 2 представлена конструкция держателя тонкослойного армированного гелевого препарата для проведения спектрометрических исследований объектов, присутствующих в геле.

На фиг. 3 представлен вид тонкослойного гелевого препарата с оконтуренной армирующей подложкой.

На фиг. 4 представлена палитра с контрольными цветовыми стандартами для визуального определения восстановительной активности исследуемых биологических объектов на основании сравнения цветовой характеристики гелевых препаратов с цветом гелевых препаратов, полученных при нанесении серии известных концентраций химического восстановителя катионов.

На фиг. 5 представлено размещение силиконовой шайбы на поверхности тонкослойного армированного геля для нанесения образца исследуемой жидкости.

На фиг. 6 представлена схема использования армированного тонкослойного геля для оценки восстановительной активности суспензии клеток микроорганизмов.

Пример 1

Для приготовления армированных тонкослойных препаратов навеску гелевого загустителя помещают в стеклянную пробирку, добавляют необходимое количество дистиллированной воды и растворяют с кипячением для получения геля. Для поддержания жидкого состояния гелей стеклянные пробирки с препаратами помещают в водяную баню при температуре не ниже 42°С. Необходимые добавки вносят в жидкий гель до его армирования. Для получения армированных препаратов необходимый объём жидкого геля (при температуре не ниже 42°С) наносят на фрагмент нейлоновой ткани размером 9 × 12 мм, расположенный горизонтально на стеклянной поверхности. Нагретый жидкий гель распространяется тонким слоем по ткани, пропитывает её и застывает после охлаждения до комнатной температуры в течение минуты (Фиг. 1, А). Полученный таким способом тонкослойный армированный гелевый препарат переносят с помощью пинцета.

Пример 2

Для спектрометрического исследования тонкослойного армированный препарат геля помещают в разборный держатель, своими размерами повторяющий размеры кюветодержателей стандартных кювет для спектрометров (Фиг. 2). Чтобы исключить влияние оптических свойств нейлоновой ткани, армирующей тонкослойный гелевый препарат, для спектрометрического исследования готовят контрольный тонкослойный армированный гелевый препарат без каких-либо добавок в гель.

Пример 3

При получении армированных тонкослойных препаратов геля, предназначенных для оценки восстановительной активности в отношении катионов серебра в необходимый объём жидкого геля (при температуре не ниже 42°С) вносят стерильный раствор реактива Толленса Ag(NH₃)₂NO₃ как источника катионов. Пробирки с жидким гелем тщательно перемешивают после чего приготавливают гелевый препарат как описано в примере 1. Полученный таким способом тонкослойный армированный гелевый препарат, содержащий катионы серебра, используют как индикатор восстановительной активности. При нанесении на такой гелевый препарат раствора восстановителя в толще геля мгновенно начинается реакция восстановления катионов серебра, что приводит к формированию de novo нанокристаллических структур, окрашивающих гелевый препарат в тот или иной оттенок от жёлтого до тёмно-коричневого или тёмно-серого (Фиг 1, В). Для измерения спектральных характеристик или цветности полученного препарата тонкослойного армированного геля его с помощью пинцета помещают в держатель для спектрометрического исследования или оценивают визуально.

Пример 4

Для получения оконтуренной армирующей подложки круглой формы диаметром не менее отверстий в пластинах держателя гелей (7-9 мм) на фрагмент нейлоновой ткани накладывается петля тонкой медной проволоки в изоляции из ПВХ (из отдельной жилы телефонного провода), предварительно нагретой около пламени горелки до 130-170°С. Нагретая ПВХ-изоляция проволочной петли при прижатии сплавляется с нитями нейлоновой ткани и образует бортик округлой формы (Фиг. 3). Для получения оконтуренного армированного гелевого препарата необходимый объём жидкого геля наносят на нейлоновую ткань, расположенную горизонтально на стеклянной поверхности. После охлаждения до комнатной температуры в течение минуты в центр поверхности оконтуренного армированного геля наносят образец суспензии исследуемых клеток микроорганизмов для оценки уровня метаболической активности на основании визуальной или спектрометрической регистрации процесса формирования de novo биогенных нанокристаллов из катионов (для серебра при специфических длинах волн λ₂₅₀ и λ₄₀₀ нм).

Пример 5

Для определения уровня метаболической активности биологических объектов на основании визуальной оценки цветности армированных гелей использовали приготовленную серию контрольных цветовых стандартных препаратов гелей, содержащих биогенные нанокристаллы серебра, сформировашиеся de novo при взаимодействии в геле катионов серебра и восстановителя катионов (аскорбиновой кислоты), взятого в различных концентрациях. Основой для приготовления таких стандартов являлись армированные препараты 0,7%-ного геля ЕЕО-агарозы с добавлением раствора реактива Толленса Ag(NH₃)₂NO₃ в качестве источника катионов серебра. Серия идентичных препаратов геля (с источником катионов серебра) размещали на горизонтальной поверхности после чего на них наносили вторым слоем равные объёмы геля, с добавлением различных разведений раствора аскорбиновой кислоты в качестве восстановителя катионов. Концентрация раствора восстановителя катионов в серии ступенчато уменьшалась в 3,2 раза. Контрольный образец армированного агарозного геля готовили без добавления раствора аскорбиновой кислоты. Полученные двуслойные препараты армированных гелей при инкубации (5 минут при комнатной температуре) изменяли окраску от слабо жёлтых до тёмно-коричневых пропорционально повышению концентрации восстановителя (что соответствует цветам формирующих в гелях de novo нанокластеров или наночастиц серебра, соответственно). Препараты гелей были сфотографированы для получения палитры (серии) цветных тест-образцов, соответствующих различным концентрациям восстановителя при фиксированной концентрации катионов серебра (Фиг. 4).

Пример 6

На поверхность серии идентичных армированных препаратов 0,7%-ного геля ЕЕО-агарозы с добавлением раствора реактива Толленса Ag(NH₃)₂NO₃ в качестве источника катионов серебра помещали силиконовые «шайбы» (внешний Ø 12 мм, внутренний ∅ 9 мм, Фиг. 5) наносили равные объёмы из серии ступенчатых разведений раствора аскорбиновой кислоты (концентрация уменьшалась каждый раз в 3,2^Х). Контрольный образец армированного агарозного геля готовили без нанесения раствора аскорбиновой кислоты. Полученные препараты армированных гелей инкубировали (5 минут при комнатной температуре) после чего спектрометрировали каждый препарат с применением держателя. Для получения палитры цветных тест-образцов (от слабо жёлтых до тёмно-коричневых и чёрных), соответствующих различным концентрациям восстановителя при фиксированной концентрации катионов серебра, препараты гелей были сфотографированы (Фиг. 4).

Пример 7

Армированные препараты геля использовали для сравнения уровня метаболической активности клеток отдельных колоний бактерий на твёрдой среде. Готовили серию армированных препаратов геля, включающего реактив Толленса в качестве источника катионов серебра. Сравнивали уровни восстановительной активности отдельных колоний бактерий, постоянно находившихся при оптимальной температуре, с контрольными колониями, которые для остановки метаболических процессов и подавления восстановительной активности клеток выдерживали 3 часа в холодильнике при температуре 8°С. Армированные препараты геля, помещённые на свежие отдельные колонии, постоянно находящиеся при оптимальной для роста температуре, изменяли свою окраску. На контрольных колониях, восстановительная активность клеток которых была подавлена охлаждением, гели оставались бесцветными и прозрачными. Также бесцветными и прозрачными оставались контрольные препараты геля, помещённые на поверхность агара без колоний.

Пример 8

Армированные препараты геля использовали для сравнения уровня метаболической активности суспензии клеток микроорганизмов. На поверхность армированного геля, включающего реактив Толленса в качестве источника катионов серебра, накладывали стерилизующий фильтр (с размером пор 0,22 мкм) на который наносили суспензию исследуемых клеток (Фиг. 6). Ростовая среда микроорганизмов переносит биогенные восстановители катионов от клеток сквозь поры на поверхность геля, где мгновенно начинается реакция восстановления катионов и генерация нанокристаллов. Для приготовления контрольного бесклеточного препарата на фильтр наносят культуральную жидкость, освобождённую от клеток микроорганизмов механическим способом.

Используемая литература

Макарова А.О., Зуев Ю.Ф., Зуева О.С., Сальников В.В., Зиганшина С.А., Кадыйров А.И. Способ применения биополимерных композитов, армированных углеродными нанотрубками для повышения нефтеотдачи пластов. Патент РФ № 2793821, 2023.

Складнев Д.А., Сорокин В.В., Кураков В.В. Способ обнаружения микробной и вирусной контаминации растворов. Патент РФ №2641960, 2016.

Складнев Д.А., Сорокин В.В., Саакян С.В., Карлов С.П., Погосян С.И. Способ использования интегрирующей сферы для фотометрической регистрации формирования de novo биогенных наночастиц металлов. Патент РФ №2797775, 2023.

Складнев Д.А., Сорокин В.В. Генерация биогенных наночастиц металлов de novo как индикатор метаболической активности клеток. Российские нанотехнологии, 2023, том 18, № 3, с. 1-16.

Jiao L.Y., Zhang L., Wang X.R., Diankov G., Dai H.J. Narrow graphene nanoribbons from carbon nanotubes. Nature, 2009, 458, 877-880.

Vyazmin A.V., Pokusaev B.G., Karlov S.P., Skladnev D.A., Shumova N.V., Volkova E.D. Features of biogenic nanoparticle formation in agarose gels and their effect on cell growth during bulk cultivation. Chemical Engineering Transactions, 2021, 84, 73-78.

Wang Y., Zhang M., Yan Z., Ji S., Xiao S., Gao J. Metal nanoparticle hybrid hydrogels: the state-of-the-art of combining hard and soft materials to promote wound healing. Theranostics, 2024, 14(4), 1534-1560.

Zhou Y., Wang H., Lin W., Lin L., Gao Y., Yang F., Du M., Fang W., Huang J., Sun D., Li Q. Quantitative nucleation and growth kinetics of gold nanoparticles via model-assisted dynamic spectroscopic approach. J. Colloid Interface Sci., 2013, 407, 8-16.

Изобретение относится к области измерительной техники и касается способа исследования биологических объектов с использованием тонкостенных армированных гелевых препаратов. Способ, заключающийся в том, что в гель вводят стерильный раствор, содержащий катионы серебра, способные в случае контакта с молекулами-восстановителями привести к генерации металлических нанокристаллических структур. Находящийся в жидком состоянии гель армируют путем нанесения геля на фрагмент прозрачной, инертной нейлоновой ткани, расположенный горизонтально на стеклянной поверхности. Для начала реакции восстановления катионов источники биогенных молекул-восстановителей катионов приводят в соприкосновение с поверхностью армированного гелевого препарата и проводят оценку восстановительной активности исследуемых биологических объектов по их способности секретировать молекулы-восстановители катионов, что регистрируется по изменению спектральных характеристик или цвета армированного гелевого препарата, происходящему при генерации нанокристаллических продуктов восстановления катионов. 7 з.п. ф-лы, 6 ил.

1. Способ исследования биологических объектов с использованием тонкостенных армированных гелевых препаратов, заключающийся в том, что в гель вводят стерильный раствор, содержащий катионы серебра, способные в случае контакта с молекулами-восстановителями привести к генерации металлических нанокристаллических структур, находящийся в жидком состоянии гель армируют путем нанесения геля на фрагмент прозрачной, инертной нейлоновой ткани, расположенный горизонтально на стеклянной поверхности, для начала реакции восстановления катионов источники биогенных молекул-восстановителей катионов приводят в соприкосновение с поверхностью армированного гелевого препарата и проводят оценку восстановительной активности исследуемых биологических объектов по их способности секретировать молекулы-восстановители катионов, что регистрируется по изменению спектральных характеристик или цвета армированного гелевого препарата, происходящему при генерации нанокристаллических продуктов восстановления катионов.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что находящийся в жидком состоянии гель наносят на фрагмент прозрачной, инертной нейлоновой ткани размером 9 × 12 мм.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что для осуществления реакции восстановления катионов, содержащихся в гелевом препарате, используют суспензии клеток, колонии микроорганизмов, тканевые структуры, служащие источниками биогенных молекул-восстановителей катионов.

4. Способ по п. 3, отличающийся тем, что для оценки восстановительной активности микроорганизмов суспензию исследуемых клеток наносят на стерилизующий фильтр, помещённый на поверхность тонкослойного армированного гелевого препарата, содержащего источник катионов, что позволяет секретируемым молекулам-восстановителям катионов запускать генерацию металлических нанокристаллических продуктов восстановления, которые регистрируются после удаления фильтра с клетками.

5. Способ по п. 3, отличающийся тем, что для оценки восстановительной активности исследуемых растворов их наносят в центр силиконовой шайбы, помещаемой на поверхность тонкослойного армированного гелевого препарата, содержащего источник катионов, что позволяет молекулам-восстановителям катионов запускать генерацию металлических нанокристаллических продуктов восстановления в зоне спектрометрического исследования препарата.

6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что тонкослойные армированные гелевые препараты после проведения в них генерации нанокристаллических продуктов восстановления катионов исследуют методами спектрометрии в ультрафиолетовом и видимом диапазоне длин волн или визуально.

7. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве контрольных вариантов для спектрометрических измерений тонкослойных армированных гелевых препаратов используют гели без добавок компонентов восстановительной реакции.

8. Способ по п. 1, отличающийся тем, что проведение оценки восстановительной активности исследуемых биологических объектов по их способности генерировать нанокристаллические продукты осуществляют за фиксированное, до 10 минут, время реакции.