КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ФОРМИРОВАНИЯ МАКРОПОРИСТОГО НОСИТЕЛЯ, ИСПОЛЬЗУЕМОГО ПРИ ТРЕХМЕРНОМ КУЛЬТИВИРОВАНИИ КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ ИЛИ ЧЕЛОВЕКА, И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ УКАЗАННОГО НОСИТЕЛЯ Российский патент 2016 года по МПК C12N5/02 C09H7/00 

Изобретение относится к технологии высокомолекулярных соединений, а именно к полимерным гелям и способам их получения. Более конкретно изобретение касается макропористых гелей на основе желатина - полимера белковой природы, получаемого из коллагенсодержащего сырья [А. Вейс, Макромолекулярная химия желатина// М: Пищевая пром-сть, пер. с англ.,. 1971, сс.152-255]. Наиболее эффективно заявляемые материалы могут быть использованы в биотехнологии, клеточной технологии и тканевой инженерии в качестве гелевых носителей для трехмерного (объемного) культивирования клеток животных или человека.

Желатин и гидрогели на его основе широко применяются в пищевой промышленности, прикладной биохимии, биотехнологии, медицине, в производстве фотоматериалов, лекарственных форм и др. [R.T. Jones, Gelatin: manufacture and physico-chemical properties // In: Pharmaceutical Capsules. Eds. F. Podczeck, B.E. Jones. London: Pharmaceutical Press, 2004, pp.23-60. V.B. Djiagny, Z. Wang, S. Xu, Gelatin: a valuable protein for food and pharmaceutical industries // Crit. Revs. Food Sci. Nutr., 2001, V.41, P.481-492; В.Г. Кузнецов, Т.М. Бобикова, О.Е. Заболотная, Э.А. Фахрутдинов, Н.Ш. Корень, Способ получения желатина для фотоэмульсий // А.С. СССР №925972 (1980), Б.И. №17 (1982)]. В последние годы в связи с интенсивным развитием клеточных технологий и тканевой инженерии разрабатываются специальные полимерные материалы на основе желатина с целью их использования в качестве носителей (подложек; англоязычное название - scaffolds) для культивировании клеток животных и человека [J. Jagur-Grodzinski, Polymers for tissue engineering, medical devices, and regenerative medicine // Polym. Adv. Technol., 2006, V.17, P.395-418; S. Van Vlierberghe, P. Dubruel, E. Schacht, Biopolymer-based hydrogels for tissue engineering applications // Biomacromolecules, 2011, V.12, P.1387-1408]. Интерес к таким материалам обусловлен хорошей биосовместимостью желатина, его нетоксичностью, невысокой стоимостью, а также тем, что высоко очищенный желатин относится к веществам, разрешенным большинством современных фармакопей к применению in vivo [J.B. Rose, S. Pacelli, A.J. El-Haj, H.S. Dua, A. Hopkinson, L.J. White, F.R.A.J. Rose, Gelatin-based materials in ocular tissue engineering // Materials, 2014, V. 7, P. 3106-3135]. Поскольку одним из важным качеств, которым должны обладать носители для культивирования клеток, является наличие крупных взаимосвязанных пор в материале полимерной подложки, чтобы обеспечить стерически незатрудненное проникновение клеток в ее объем, для приготовления подобных носителей используют различные приемы порообразования [M.S. Shoichet, Polymer scaffolds for bio-materials applications // Macromolecules, 2010, V. 43, P. 581-591]. Одним из таких подходов является так называемое криотропное гелеобразование, при котором трехмерная полимерная сетка гелевой фазы (т.е. стенок макропор) формируется в неглубоко замороженной среде, а кристаллы замороженного растворителя выполняют функцию порогена [В.И. Лозинский. Криогели на основе природных и синтетических полимеров: получение, свойства и области применения // Усп. химии, 2002, Т.71, С.559-585]. Полимерные материалы, получаемые этим способом, получили название криогелей, т.е. гелей, образование которых протекало в замороженной среде [V.I. Lozinsky, A brief history of polymeric cryogels // Adv. Polym. Sci., 2014, V.263, Р.1-48].

Например, известны макропористые желатиновые криогели, сформированные из полимерных композиций состава: желатин - 0.2-2.0 мас. %, вода - остальное [S.Van Vlierberghe, P. Dubruel, E. Schacht, Effect of cryogenic treatment on the rheological properties of gelatin hydrogels // J. Bioactive Compat. Polym., 2010, V. 25, Р. 498-512]. Согласно этому известному техническому решению после растворения желатина при 40°С полученный раствор охлаждают до комнатной температуры, а затем замораживают при -30°С в течение 24 ч, после чего оттаивают 24 ч при 5°С.Хотя в результате такой последовательности операций получаются губчатые макропористые желатиновые криогели, их использование в качестве носителей для культивирования клеток животных и человека малоэффективно, т.к. эти криогели имеют недостаточную теплостойкость из-за низкой концентрации полимера, частично растворяясь уже при температуре 37°С, обычной для культивирования указанных клеток. Кроме того, в условиях приготовления исходного раствора желатины система прогревается лишь при 40°С, что абсолютно недостаточно для стерилизации препаратов, поэтому получаемые желатиновые криогели никак не защищены от микробной контаминации.

Известен макропористый желатиновый криогель с повышенной термостабильностью за счет химической сшивки белковых макромолекул, который затем используют в качестве носителя для трехмерного культивирования фибробластов и миобластов [L. Elowsson, H. Kirsebom, V. Carmignae, M. Durbeej, D. Mattiasson, Porous protein-based scaffolds prepared through freezing as potential scaffolds for tissue engineering // J. Mater. Sci., Mater. Med., 2012, V.23, P.2489-2498]. Этот гелевый материал получают из полимерной композиции следующего состава: 5 мл 4 мас. % водного раствора желатина +0.01 мл 50 мас. % водного раствора глутарового альдегида. Раствор такой смеси порциями по 0.5 мл замораживают при -12°С в течение 16 ч, далее оттаивают при комнатной температуре и промывают водой от растворимых примесей (т.е. от золь-фракции). Затем полученный криогель обрабатывают 0.05М раствором боргидрида натрия в 0.1М карбонатном буфере (рН 9.2) для восстановления альдиминных группировок в узлах сшивки, промывают образцы водой до нейтрального значения рН. При биотестировании полученного сшитого желатинового криогеля в качестве носителя культивируемых клеток полимерный материал нарезают на диски толщиной 1 мм, выдерживают 15 мин в изопропаноле для стерилизации и далее уравновешивают в течение 30 мин в пролиферативной среде, а затем инокулируют суспензией клеток и сверху наносят 1%-ный раствор агарозы, которая образует слой геля, удерживающего клетки в носителе. Анализ клеток на жизнеспособность и пролиферативную активность показывает, что лучшие результаты получаются при культивировании миоцитов по сравнению с культивированием фибробластов в таких же носителях. К недостаткам данного технического решения относятся экспериментальные трудности получения таких желатиновых криогелей с воспроизводимыми свойствами, что связано с гелеобразованием смеси желатина и сшивающего агента (глутаровый альдегид) уже при низких положительных температурах - хорошо известный факт желирования растворов желатины с концентрацией белка более 3-5 мас. % при их охлаждении, еще более ускоряющийся в присутствии химического сшивателя. В этом случае, если сшитый желатиновый гель образуется до замерзания образца, кристаллы замерзающего растворителя (здесь - кристаллы льда) будут разрушать уже сформированную первичную сетку. Именно поэтому данное технические решение пригодно для формирования препаратов желатиновых криогелей только малого объема (0.5 мл), которые в известных условиях замерзают быстро, т.е. раньше, чем успевает образоваться сетка первичного криогеля. Проверка этого способа для получения более объемных образцов выявила указанные выше его недостатки: уже при объеме замораживаемой композиции более 1.5 мл воспроизводимость методики резко падает, большинство сформированных гелей имеют неоднородную морфологию и механически непрочные. Также к недостаткам данного технического решения следуют отнести недостаточно жесткие условия стерилизации желатиновых носителей, поскольку 15-минутная инкубация образцов в изопропаноле абсолютно недостаточна для уничтожения споровых форм микроорганизмов, что сильно повышает риск микробной контаминации при культивировании клеток животных или человека в объеме таких носителей.

В некоторых случаях при биомедицинском применении желатиновых криогелей необходимо, чтобы материал помимо желатины содержал бы и определенные добавки и/или наполнители, целенаправленно корректирующие биологические свойства носителей и/или их физико-механические свойства, требуемые в конкретных вариантах использования соответствующих желатиновых матриц. Так, известны макропористые желатиновые криогели, дополнительно к желатину содержащие фибриноген, в качестве биофункциональной добавки, промотирующей рост клеток соединительной ткани в объеме полимерного носителя [M.B. Daniak, I.U. Allan, I.N. Savina, L. Cornelio, E.S. James, S.L. James, S.V. Mikhalovsky, H. Jungvid, I.Y. Galaev, Gelatin-fibrinogen cryogel dermal matrices for wound repair: preparation, optimization and in vitro study // Biomaterials, 2010, V.31, P.67-76], или ламинин, способствующий адгезии определенных клеток к поверхности стенок макропор носителя [M. Jugra, M.B. Dainiak, A. Saenowska, A. Jablonska, A. Tripathi, F.M. Plieva, I.N. Savina, L. Strojek, H. Jungvid, A. Kumar, B. Lukomska, K. Domanska-Janik, N. Forraz, CP. Mc Guckin, The performance of laminin-containing cryogel scaffolds in neural tissue regeneration // Biomaterials, 2011, V. 32, P. 3423-3434]. Эти материалы формируют из полимерных композиций, включающих или желатин и фибриноген в концентрации 4.3 и 0.03 мас. %, соответственно, 0.05-0.5 об.% глутарового альдегида и воду (остальное), или желатин и ламинин в концентрации 4.4 и 0.01 мас. %, соответственно, 0.1-0.5 об.% глутарового альдегида и воду (остальное). Сразу после приготовления раствор таких смесей порциями по 0.25 мл замораживают при -12°С в течение ночи, затем оттаивают при комнатной температуре, промывают водой от золь-фракции и далее обрабатывают раствором боргидрида натрия аналогично предыдущему техническому решению. Полученные образцы далее выдерживают в 20%-ном этаноле и хранят при 4°С в 70%-ном этаноле. При биотестировании желатин-фибриногеновых носителей их нарезают в виде дисков толщиной 2 мм, в которые после пропитки питательной средой инокулируют суспензией фибробластов, которые культивируют в объеме таких макропористых дисков. Полученные результаты показывают, что введение в состав носителя добавок фибриногена улучшает адгезию фибробластов и способствует лучшей пролиферации клеток, чем при использовании желатинового криогеля без добавок фибриногена. При биотестировании желатин-ламининовых носителей соответствующие макропористые диски заселяют стволовыми клетками пуповинной крови, которые после культивирования в объеме носителя дифференцируют в клетки нервной ткани. Полученные результаты показывают, что введение ламинина в состав матрицы желатинового криогеля способствует направленной дифференциации стволовых клеток. Однако, эти технические решения имеют тот же основной недостаток, что и предыдущее, а именно, возможность воспроизводимо получать носители только малого размера из-за быстрого гелеобразования реакционной смеси еще до ее замораживания, если объем исходной композиции превышает 1-2 мл. Таким образом, данный и предыдущий способы получения макропористых желатиновых носителей для культивирования клеток животных и человека характеризуются низкой технологичностью и трудны в масштабировании.

Еще одним вариантом пористых желатиновых носителей, которые потенциально могут быть использованы для культивирования клеток, являются композитные криогели, содержащие частицы дисперсного наполнителя, включенного в гелевую фазу стенок макропор. При этом дисперсный наполнитель может выполнять не только функцию физического повышения механической прочности материала в целом, но и действовать в качестве адсорбента (как, например, частицы активированного угля) или «депо» медленного высвобождения необходимых при культивировании клеток веществ (как, например, неорганические частицы, содержащие ионы фосфата и кальция, в частности, гидроксиапатит, фосфогипс, фосфатная глина). Так, известны композитные желатиновые криогели, в качестве наполнителя содержащие частицы монтмориллонита [С. Mu, X. Li, Y. Zhao, H. Zhang, L. Wang, D. Li, Freezing/thawing effects on the exfoliation of montmorillonite in gelatin-based bionanocomposite // J. Appl. Polym. Sci., 2013, V.128, P.3141-3148]. Согласно этому техническому решению для формирования соответствующих криогелей используют композицию, содержащую желатин (10 мас. %), пластификатор - формамид (2 мас. %), порошок кальцийфосфат-содержащей глины - монтмориллонита (0.01-1 мас. %) и воду (остальное). Такие композиции, т.е. суспензии монтмориллонита в растворе желатина, при 60°С разливают в тефлоновые формы и замораживают при -20°С в течение 24 ч, а затем оттаивают при комнатной температуре, получая в результате композитные желатиновые криогели с различным содержанием дисперсии нерастворимого наполнителя, включенного в стенки пор полимерного материала. При этом криогенная обработка исходной композиции приводит к механическому разделению слоев монтмориллонита и равномерному распределению отслоившихся фрагментов наполнителя в гелевой фазе, способствуя тем самым повышению прочности на разрыв полученного композита. Однако, вследствие довольно высокой концентрации гелеобразователя (желатин) в исходной композиции и медленного ее остывания при охлаждении от +60 до -20°С система желирует еще до начала замерзания, т.е. формирование собственно желатинового криогеля происходит на фоне механического разрушения физической сетки уже частично образовавшегося первичного гидрогеля. Поэтому получается криогель с мелкими порами (рис. 4 обсуждаемой статьи), размер которых (5-10 нм) существенно меньше, чем, как минимум 50-100 мкм [В.И. Лозинский, Новое семейство макропористых и сверхмакропористых материалов биотехнологического назначения - полимерные криогели // Известия РАН, Сер. хим., 2008, №5, С. 996-1013], необходимые для трехмерного культивирования клеток животных и человека во всем объеме носителя.

При создании макропористых носителей, имеющих так называемые градиентные поры, т.е. крупные поры, размер которых систематически (градиентно) изменяется от периферии вглубь материала, часто применяют лиофилизацию (сублимационное высушивание) набухшего геля. Например, известны макропористые желатиновые носители, приготовленные с использованием этой технологии из полимерной композиции состава: желатин - 10 мас. %, 1М NaOH в количестве, необходимом для доведения рН раствора желатина до значения 7.5 при 55°С, вода - остальное [S. Gorgieva, V. Kokol, Processing of gelatin-based cryogels with improved thermomechanical resistance, pore size gradient, and high potential for sustainable protein drug release // J. Biomed. Mater. Res., 2015, V.103A, P. 1119-1130]. Полученный таким образом раствор разливают порциями по 15 мл в пластиковые чашки Петри диаметром 60 мм и инкубируют в течение 50 мин при комнатной температуре, в результате чего образуется первичный желатиновый гидрогель. Далее его замораживают в течение 24 ч на охлаждаемой металлической плите либо при -12, либо при -16°С, благодаря чему обеспечивается градиентный рост кристаллов льда, выполняющих функцию порообразователя, а затем образцы высушивают лиофильно. Далее получающиеся в результате лиофилизации обладающие градиаентными макропорами образцы погружают в раствор сшивающего агента для химического дубления желатина, чтобы сделать материал нерастворимым в водных средах. В качестве сшивающего агента используют гидрохлорид N-(3-диметиламинопропил)-N'-этилкарбодиимида в смеси с N-гидроксисукцинимидом (4:1, моль/моль), обработку носителей проводят либо в PBS-буфере, либо в его смеси с этанолом (80:20 по объему) в течение 1-24 ч при комнатной температуре. Карбодиимидный компонент сшивающего агента вводят в количестве от 3- до 24-кратного мольного избытка по отношению к количеству свободных аминогрупп желатина. По окончании процесса приготовленные таким способом носители промывают водой. Эта методика позволяет получать макропористые желатиновые носители, выдерживающие нагревание до 73°С и значительно более устойчивые к действию гидролитических ферментов, чем аналогичные лиофилизованные препараты, не подвергавшиеся обработке сшивающим агентом. Основными недостатками данного технического решения является использование длительного, энергоемкого и дорогого (из-за высокой стоимости оборудования) сублимационного высушивания получаемых образцов, а также нежелательные процессы разрушения первичного желатинового гидрогеля кристаллами льда в ходе его замораживания перед лиофилизацией, что приводит к формированию большого числа неровных участков (изъязвлений) поверхности стенок макропор, тогда как для хорошей адгезии клеток к таким поверхностям и последующего культивирования биомассы необходимы ровные площадки стенок макропор.

Альтернативой сублимационному удалению замороженного растворителя является метод так называемой криоэкстракции, заключающийся в обработке замороженного образца без его оттаивания холодным растворителем, экстрагирующим кристаллическую фазу, но не растворяющим полимерные компоненты системы. В частности, известны макропористые желатиновые носители, сформированные с использованием этого подхода [Р.Х. Ма, X. Liu, Modified porous materials and method of forming the same // US Pat. 7993738 (2011)]. Это техническое решение как наиболее близкое к заявляемому по последовательности этапов приготовления целевого полимерного материала, выбрано в качестве прототипа. Согласно прототипу макропористые желатиновые носители, используемые при трехмерном культивировании клеток, получают из полимерной композиции, содержащей желатин (2-20 мас. %) и растворитель - остальное, причем в качестве растворителя используют или воду, или смеси воды либо с метанолом, либо с этанолом, либо с диоксаном, либо с ацетоном. Соотношение вода/органический растворитель составляет от 90:10 до 40:60. Схема получения желатиновых носителей по способу-прототипу включает следующие стадии: Исходную полимерную композицию готовят растворением желатина при 40-80°С (зависит от конкретного состава растворителя) (стадия 1) и затем порциями по 2 мл раствор расфасовывают в тефлоновые флаконы (стадия 2). Флаконы помещают в криостат с температурой -76°С или -18°С для замораживания раствора желатина в течение 1-6 ч (стадия 3). Далее препараты 24 ч обрабатывают холодным этанолом при -18°С для криоэкстракции льда (стадия 4), после чего замещают этанол на диоксан (стадия 5) и вновь замораживают образцы 12 ч при -18°С (стадия 6), а затем высушивают сублимационно при -5...-10°С в течение 1 недели (стадия 7). Электронные микрофотографии структуры образцов макропористого желатинового носителя, приготовленных по вышеописанной методике при разных температурах криогенного структурообразования, приведены на Фиг. 1. Для придания материалу водонерастворимости его далее обрабатывают раствором дубителя - смесью гидрохлорида N-(3-диметиламинопропил)-N'-этил-карбодиимида и N-гидроксисукцинимида (1:1, моль/моль) при рН 5.3 в течение 24 ч при 4°С в водно-диоксановом (1:9 по объему) буфере (стадия 8) с последующей промывкой водой при 37°С (стадия 9), замораживанием при -18°С в течение 12 ч (стадия 10) и лиофилизацией в течение 3 суток (стадия 11). Серию макропористых желатиновых матриц, полученных по способу-прототипу, перед тестированием в качестве носителей для трехмерного культвиро-вания остеобластов стерилизуют в атмосфере окиси этилена в течение 24 ч. Биотестирование подтверждает применимость таких носителей для заявляемого применения, причем предпочтительнее, когда размер пор полимерной матрицы более 50 мкм, как у образца, микрофотография структуры которого приведена на Фиг. 1а.

Хотя техническое решение по прототипу позволяет в достаточно широких пределах варьировать физико-химические свойства и пористую морфологию получаемых желатиновых материалов, в том числе и вводить в их структуру нерастворимый наполнитель (в частности, частицы гидроксиапатита, как в примере 25 прототипа), сами такие желатиновые носители и способ их получения имеют следующие недостатки:

1. Если полимерная композиция, которая используется для формирования макропористых желатиновых носителей, в качестве растворителя включает только воду, то возникают существенные ограничения в отношении концентрации желатина в исходном растворе, т.к. при содержании желатина более 3-5 мас. % в ходе охлаждения при замораживании системы желатиновый гель образуется уже до замерзания образца, и кристаллы образующего льда будут разрушать уже сформированную первичную сетку. Когда в качестве растворителя желатины в прототипе используются водно-органические смеси (вода/метанол, вода/этанол, вода/диоксан, вода/ацетон), то существенно снижается температура замерзания таких растворов, что приводит к образованию лишь мелких кристаллов льда. В результате размер пор в получающемся желатиновом носителе оказывается явно недостаточным, менее 10 мкм (см. Фиг. 1б), для последующего эффективного заселения носителя клетками во всем объеме полимерного материала.

2. Схема получения макропористых желатиновых носителей по способу-прототипу включает много стадий (только 11 основных, не учитывая минорные), а сам способ-прототип длителен по времени (более недели), т.е. он характеризуется недостаточной технологичностью. Часть процессуальных параметров этого способа трудно контролируема (например, полнота замещения этанола на диоксан - стадия 5), что существенно снижает универсальность способа в рамках этого известного технического решения.

3. Поскольку в качестве растворителя используются водно-органические смеси, температуры замерзания которых зависят как от типа конкретного органического растворителя (метанол, этанол, диоксан, ацетон), так и от его содержания в смеси, то наиболее подходящая для достижения конечной цели температура криогенной обработки является неопределенным параметром, что также снижает технологичность способа-прототипа в целом.

4. Для стерилизации полученных макропористых желатиновых носителей способ прототип предусматривает их длительную (24 ч) обработку газообразной окисью этилена. Однако, этот способ стерилизации в отношении веществ белковой природы (желатина, в частности) не является оптимальным, поскольку часто приводит к химической модификации белков за счет оксиэтилирования их аминогрупп, тем самым изменяя интегральные характеристики белкового материала, например, снижая его адсорбционную способность в отношении тех клеток, для трехмерного культивирования которых предназначается данный носитель.

В этой связи, задачей предлагаемого изобретения является как собственно целое семейство новых эффективных макропористых желатиновых носителей, предназначенных для трехмерного культивирования клеток животных или человека, так и разработка исходных композиций для получения таких носителей и более универсального по сравнению с аналогами и прототипом способа их формирования.

Указанная задача решается тем, что композиция для формирования макропористого носителя в качестве растворителя содержит диметилсульфоксид при соотношении компонентов (в мас. %): желатин - 5-10 и диметилсульфоксид - остальное; либо композиция дополнительно содержит полимерную добавку, представляющую собой растворимый в диметилсульфоксиде природный или синтетический полимер, выбранный из группы, включающей гиалуроновую кислоту, хондроитинсульфат, агарозу, поливиниловый спирт, поли(N-винилпирролидон) при соотношении компонентов (в мас. %): желатин - 5-10, полимерная добавка - 0.1-5 и диметилсульфоксид - остальное; либо композиция включает дисперсный наполнитель, в качестве которого используют нерастворимые в диметилсульфоксиде гидроксиапатит, трикальций-фосфат, измельченный коллаген, костную муку, при соотношении компонентов (в мас. %): желатин - 5-10, дисперсный наполнитель - 1-10 и диметилсульфоксид - остальное; либо композиция включает и полимерную добавку, и дисперсный наполнитель при соотношении компонентов (в мас. %): желатин - 5-10, полимерная добавка - 0.1-5, дисперсный наполнитель - 1-10 и диметилсулфоксид - остальное. Способ получения макропористого носителя заключается в том, что ингредиенты композиции растворяют в диметилсульфоксиде, при наличии дисперсного наполнителя его суспендируют в полученном растворе, далее раствор или суспензию замораживают в течение 1-24 ч при температуре на 15...40°С ниже точки кристаллизации диметилсульфоксида, затем замерзший растворитель экстрагируют этанолом при -15...-30°С, после чего полученный структурированный замораживанием полимерный продукт в течение 6-36 ч при 0...30°С обрабатывают 1-10 мас. % этанольным раствором дубителя, выбранного из группы, включающей глутаровый альдегид, формальдегид, дженипин, N,N-диизопропил-карбодиимид, гидрохлорид N-(3-диметиламинопропил)-N'-(3-этилкарбодиимида, N-циклогексил-3-(2-морфолиноэтил)-карбодиимид, а затем полученный макропористый желатиновый носитель промывают этанолом.

Получаемый макропористый желатиновый носитель может быть приготовлен любой геометрической формы: в виде блоков, пластин, дисков, гранул, частиц неправильной формы (получаются измельчением блока), трубок и др.

Конкретные параметры заявляемого технического решения определяются следующими факторами:

1). Состав исходной полимерной композиции

а) В качестве гелеобразующего полимера в заявляемом техническом решении используется желатин, к поверхностям гелей которого большинство известных линий клеток животных и человека в культуре имеют выраженное сродство, что обеспечивает их прикрепление к матрице соответствующего носителя и последующий рост биомассы. При этом, в противоположность известным аналогам и прототипу, где для получения желатиновых носителей криогелевого типа в состав исходного растворителя желатины всегда входит вода, в ходе разработки предлагаемого изобретения было обнаружено, что можно приготовить раствор желатина в диметилсульфоксиде с достаточной для криотропного гелеобразования концентрацией (что ранее не было известно из уровня техники), и при этом во время растворения полимера при повышенной температуре происходит стерилизация получаемой композиции. Заявляемый диапазон концентрации желатина в такой композиции найден экспериментально, он лежит в пределах от 5 до 10 мас. %, поскольку ниже 5%-ного содержания желатиновые криогели получаются механически слабыми, в при концентрации выше 10% сильно увеличивается вязкость исходного раствора полимера, что создает технические трудности манипуляций с ним и может приводить к образованию структурных неоднородностей в материале конечного продукта.

б) Для исходных композиций, включающих помимо желатина и диметилсульфоксида еще и полимерную добавку, представляющую собой растворимый в диметилсульфоксиде природный или синтетический полимер, природа этой добавки определяется, во-первых, ее растворимостью в диметилсульфоксиде и, во-вторых, положительным воздействием соответствующего полимера как на физико-химические свойства самого носителя, так и на тот или иной тип клеток животных или человека, для культивирования которых получают и затем применяют конкретный макропористый желатиновый носитель. К последнему виду воздействия относится улучшение адгезии клеток к стенок макропор поверхностям носителя, способствование направленной дифференцировки стволовых клеток и др. Заявляемое изобретение предусматривает использование для указанной цели таких природных и синтетических полимеров, как гиалуроновая кислота, хондроитинсульфат, агароза, поливиниловый спирт, поли(N-винилпирролидон, хотя и не ограничивает возможность включения в состав других полимерных добавок или их смесей, свойства которых отвечают указанным выше критериям. Заявляемые диапазоны концентраций полимерной добавки определены на основании экспериментов и лежат в пределах от 0.1 до 5 мас. %, поскольку при меньшем, чем нижняя граница содержании полимерной добавки в исходной композиции положительные эффекты, как правило, еще не проявляются в заметной степени, а при концентрациях выше 5 мас. % в ряде случаев имеет место подавление криотропного гелеобразования самого желатина.

в) В случае исходных композиций, содержащих дисперсный наполнитель помимо желатина и диметилсульфоксида, природа такого нерастворимого в диметилсульфоксиде наполнителя определяется, во-первых, его способностью улучшать физико-механические показатели носителя, т.е. выступать в роли так называемого «активного наполнителя» [Ю.С. Липатов, Физическая химия наполненных полимеров // М.: Химия, 1977, 304 с], и, во-вторых, промотировать развитие определенных типов клеток (как, например, кальций-фосфат-содержание дисперсии в отношении клеток костной и хрящевой тканей). В заявляемом техническом решении в качестве таких дисперсных наполнителей предусматривается использование нерастворимых в диметилсульфоксиде гидроксиапатита, трикальций-фосфата, измельченного коллагена, костной муки, но не ограничивает возможность включения в состав исходной полимерной композиции и других дисперсных наполнителей или их смесей, свойства которых отвечают указанным выше критериям. Концентрация дисперсного наполнителя определена экспериментально и лежит в пределах от 1 до 10 мас. %. При содержании наполнителя менее 1 мас. % оказываемый им положительный эффект, как правило, незначителен, а при содержании более 10 мас. % очень сильно возрастает вязкость и неоднородность исходной композиции, что отрицательно сказывается на структуре и свойствах (проявляется хрупкость материала) формируемых желатиновых носителей.

г) В отношении состава полимерной композиции, наряду с желатином и диметил-сульфоксидом, содержащей полимерную добавку и дисперсный наполнитель, обоснование типа и концентрации этих двух последних ингредиентов такое же, что и каждого из них в отдельности (пп. «1б» и «1в»). Заявляемое изобретение предусматривает следующее соотношение компонентов такой композиции (в мас. %): желатин - 5-10, полимерная добавка - 0.1-5, дисперсный наполнитель - 1-10 и диметилсульфоксид - остальное.

2) Режимы осуществления заявляемого технического решения

а) Весь процесс в целом состоит из следующих основных этапов: приготовление исходной полимерной композиции, т.е. раствора желатина в диметилсульфоксиде (стадия 1) с последующим введением в полученный раствор, когда это необходимо, полимерной добавки или/и дисперсного наполнителя (стадия 1'), замораживание приготовленной полимерной композиции (стадия 2), криоэкстакция кристаллов замороженного диметил-сульфоксида холодным этанолом (стадия 3), дубление полученного макропористого желатинового материала этанольным раствором дубителя и промывка конечного продукта этанолом (стадия 4), и, в случае необходимости, сушка желатинового носителя в асептических условиях (стадия 4'). Эта технологическая схема обеспечивает поддержание стерильности системы, т.к. все стадии процесса осуществляются в среде стерилизующих органических жидкостей - диметилсульфоксиде (стадии 1 и 2) и этанола (стадии 3 и 4). Как правило, при последующем использовании получаемых в результате макропористых желатиновых носителей для трехмерного культивирования клеток животных или человека стадию 4' можно не проводить, а просто заместить спиртовую среду на водную и далее инокулировать клетки в макропористую матрицу носителя.

б) Растворение желатины в диметилсульоксиде (стадия 1) проводят обычными известными приемами, предпочтительнее при нагревании до 60-80°С, что также способствует и надежной стерилизации системы. Растворимая в диметилсульфоксиде полимерная добавка или/и дисперсный наполнитель можно вводить либо непосредственно в полученный горячий раствор желатины, либо после его охлаждения до комнатной температуры, что зависит от термостойкости соответствующих добавок (например, дисперсию измельченного коллагена во избежание термоденатурации последнего следует добавлять в охлажденную жидкую композицию).

в) Температурные режимы замораживания исходной полимерной композиции на стадии 2 процесса формирования макропористых желатиновых носителей определены экспериментально. Поскольку температура кристаллизации диметилсульфоксида составляет +18.5°С [Химический энциклопедический словать, М.: Советская энциклопедия, 1983, С.171], его растворы замерзают уже при низких положительных (по шкале Цельсия) температурах, поэтому в предлагаемом изобретении температура криогенной обработки исходной полимерной композиции заявляется как разностная температура (ΔТ°) относительно точки кристаллизации диметилсульфоксида, а именно, на 15...40°С ниже этой точки. Верхний предел этого диапазона обусловлен тем, что при более высокой температуре из-за эффектов переохлаждения полимерные композиции заявляемого состава часто не замерзают, а ниже 40 градусов от точки замерзания диметилсульфоксида образуются очень мелкие его кристаллы, которые формируют недостаточно крупные поры в получаемом желатиновом носителе.

г) Условия проведения криоэкстрации кристаллов замороженного диметилсульфоксида холодным этанолом (стадия 3 заявляемого способа) определяются двумя факторами: объемом замороженного образца (чем препарат большее, тем более продолжительное время необходимо для такой экстракции) и его геометрией (чем тоньше замороженный слой, тем меньше длительность криоэкстрации). Основное требование к режиму этой стадии: не должно происходить оттаивание системы, чтобы не нарушить макропористую морфологию полимерной фазы. Поэтому заявляемым техническим решением предусматривается осуществление стадии 3 процесса при температурах в интервале от -15 до -30°С, что найдено экспериментально.

д) Стадия 4 заявляемого способа (дубление) проводится для придания желатиновому материалу водонерастворимости и закрепления (фиксации) его макропористой морфологии. Продолжительность такой обработки сшивающими агентами (1-10 мас. % этанольный раствор дубителя, выбранного из группы, включающей глутаровый альдегид, формальдегид, дженипин, N,N-диизопропилкарбодиимид, гидрохлорид N-(3-диметиламино-пропил)-N'-этилкарбодиимида, N-циклогексил-3-(2-морфолиноэтил)-карбодиимид) так же, как и длительность криоэкстракции, зависит от объема и геометрии образца, от концентрации конкретного дубителя и, в определенной степени, от его реакционной способности. Предлагаемым изобретением предусматривается осуществление стадии 4 способа в течение 6-36 ч при 0...30°С, что найдено экспериментально.

Заявляемая композиция для формирования макропористых носителей, используемых при трехмерном культивировании клеток животных или человека, способ получения указанных носителей, а также заявляемое сочетание признаков, ранее известны не были, то есть предлагаемое техническое решение отвечает критерию «новизна».

Ниже описываются типичные примеры реализации заявляемого технического решения, остальные примеры суммированы в таблицах 1 и 2, а приводимые ниже рисунки содержат следующую информацию:

Фиг. 1. Микрофотографии (сканирующий электронный микроскоп) макропористых желатиновых носителей, сформированных по способу-прототипу [Р.Х. Ма, X. Liu, Modified porous materials and method of forming the same // US Pat. 7993738 (2011)] из 2.5 мас. % растворов желатина в воде (а) замораживанием при -18°С, и в смеси воды с этанолом (60:40 по объему) (б) замораживанием при -76°С.

Фиг. 2. Микрофотографии (оптический микроскоп) макропористых желатиновых носителей, сформированных по примеру 1: (а) желатиновый материал в среде этанола до обработки дубителем; (б) конечный продукт заявляемого технического решения - макропористый химически сшитый желатиновый носитель в среде физиологического раствора; (в) клетки жировой ткани человека, дифференцированные из стволовых клеток после культивирования в объеме макропористого желатинового носителя (масштабная линейка 100 мкм).

Фиг. 3. Микрофотографии (оптический микроскоп) желатиновых носителей, сформированных по примеру 4 и обладающих градиентной морфологией пор: (а) нижняя поверхность образца; (б) верхняя поверхность макропористой желатиновой пластины; (в) парафиновый срез биоконструкции «клетки хрящевой ткани, выращенные в объеме макропористого желатинового носителя» (окрашивание альциановым синим для определения кислых мукополисахаридов (голубые тяжи) и сафранином (розовые включения) для выявления клеточных ядер) (масштабная линейка 100 мкм).

Фиг. 4. Микрофотографии (оптический микроскоп) макропористых желатиновых носителей, сформированных по примеру 9: (а) желатиновый материал (в среде этанола) с включенными в него частицами гидроксиапатита; (б) макропористый желатиновый носитель (в среде физиологического раствора) с включенными в него частицами гидроксиапатита; (в) остеобласты, выращенные в объеме макропористого желатинового носителя (окрашивание набором Phosphate Alkaline Solution kit №85 на наличие щелочной фосфатазы (темно-фиолетовые участки изображения) (масштабная линейка 100 мкм).

Фиг. 5. Фотография гранулированной формы макропористого желатинового носителя (а), сформированного по примеру 13, а также микрофотографии структуры носителя после набухания в физиологическом растворе (б) и биоконструкции «дермальные фибробласты, выращенные в объеме макропористого желатинового носителя» (окрашивание флуоресцеин-диацетатом) (в) (масштабная линейка 200 мкм).

Пример 1. Макропористый носитель, сформированный из композиции по п. 1 формулы заявляемого изобретения, для трехмерного культивирования мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани человека.

а) Получение макропористого желатинового носителя

Готовят 7.5 мас. % раствор желатина в диметилсульфоксиде, для чего навеску полимера суспендируют при комнатной температуре в известном объеме этого растворителя, выдерживают там для набухания сухих частиц полимера, а затем при постоянном перемешивании нагревают при 70°С до полного растворения желатина. Полученный прозрачный раствор охлаждают до комнатной температуры, разливают слоем толщиной 1.5 мм в чашки Петри с внутренним диаметром 36 мм и в течение 18 ч замораживают при -6.5°С (что на 25 градусов ниже точки кристаллизации диметилсульфоксида). Далее кристаллы замороженного диметилсульфоксида при -15°С экстрагируют холодным этанолом в течение 24 ч, 4 раза заменяя экстрагент на свежую порцию. Затем проэкстрагированные образцы получившегося макропористого полимерного материала (Фиг. 2а) помещают в 2.5 мас. % этанольный раствор глутарового альдегида, где при перемешивании на качалке инкубируют 15 ч при 25°С, после чего промывают этанолом, под слоем которого хранят до использования. Тест на водонерастворимость проводят в среде физиологического раствора при 40°С в течение 2 ч; в этих условиях полученный желатиновый носитель полностью сохраняет свою целостность и макропористую морфологию с взаимосвязанными крупными порами сечением 80-230 мкм (Фиг. 2б), тогда как желатиновый материал, не обработанный дубителем, т.е. образец, микроструктура которого показана на Фиг. 2а, растворяется без остатка за 10-15 мин с образованием прозрачного раствора.

б) Биотестирование полученного материала

Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (МСК) выделяют из жировой ткани человека после липоаспирации с использованием обработки коллагеназой и помещают в условия монослойного культивирования в среде альфа-MEM, дополненной 10% эмбриональной сыворотки (ЭС) крупного рогатого скота, L-глутамином (0,2 мМ) и антибиотиками. Клетки культивируют в течение 4-х пассажей, после чего их заселяют в макропористые желатиновые носители для объемного культивирования. Пролиферацию клеток оценивают по уровню восстановления РЕДОКС индикатора Alamar Blue (АВ), а распределение клеток в носителях с использованием МТТ теста. В результате трехмерного культивирования, наблюдалось повышение уровня восстановления АВ на 30-40%), что свидетельствовало о пролиферации клеток. МТТ тест показал, что МСК равномерно распределялись в объеме носителей. Для установления способности макропористых желатиновых носителей обеспечивать сохранность морфо-функциональных свойств жировых клеток, проводят направленную дифференцировку МСК в адипогенном направлении. Для этого трехмерные культуры клеток помещают в среды на основе альфа-MEM, содержащие 10% ЭС, дексаметазон (100 нМ), 3-изобутил-1-метил-ксантин (0,5 мМ), инсулин (10 мкг/мл), индометацин (100 мкМ) и антибиотики. После 21 суток культивирования оценивают морфологию и полноту адипогенной дифференцировки клеток с использованием окрашивания Oil Red О. В этих условиях макропористые желатиновые носители обеспечивают накопление клетками внутриклеточных липидов, что свидетельствует об успешной адипогенной дифференцировке МСК (Фиг. 2в).

Пример 4. Макропористый носитель, сформированный из композиции по п. 2 формулы заявляемого изобретения, для трехмерного культивирования клеток хрящевой ткани.

а) Получение макропористого желатинового носителя

Готовят 9 мас. % раствор желатина в диметилсульфоксиде, для чего навеску полимера суспендируют при комнатной температуре в известном объеме этого растворителя, выдерживают там для набухания сухих частиц полимера, а затем при постоянном перемешивании нагревают при 80°С до полного растворения желатина. В полученной жидкости растворяют гиалуроновую кислоту в количестве 1 мас. % к общей массе композиции, раствор слоем толщиной 3 мм наливают в квадратную форму размером 50×50 мм и в течение 1 ч замораживают при -31.5°С (что на 40 градусов ниже точки кристаллизации диметилсульфоксида) на охлаждаемой криостатом горизонтальной металлической плите, чтобы сформировать градиентные поры в получаемом материале. Далее кристаллы замороженного диметилсульфоксида экстрагируют при -30°С холодным этанолом в течение 48 ч, 6 раз заменяя экстрагент на свежую порцию. Затем проэкстрагированные образцы получившегося макропористого полимерного материала помещают в 10 мас. % этанольный раствор формальдегида, где при перемешивании на качалке инкубируют при 30°С в течение 6 ч, после чего промывают этанолом, под слоем которого хранят до использования. Тест на водонерастворимость проводят аналогично тесту по примеру 1; в этих условиях полученный желатиновый носитель полностью сохраняет свою целостность и градиентную макропористую морфологию (Фиг. 3а - верхняя поверхность пластины носителя с порами сечением 90-250 мкм; Фиг. 3б - нижняя поверхность пластины желатинового носителя с порами сечением 15-40 мкм).

б) Биотестирование полученного материала в качестве носителя для трехмерного культивирования клеток хрящевой ткани

Для подтверждения способности макропористых желатиновых носителей обеспечивать сохранность морфо-функциональных свойств клеток хряща, культуру МСК в трехмерные матрицы заселяют с повышенной плотностью посева (более 2×10⁶ клеток / носитель с диаметром 3 мм), после чего проводят направленную дифференцировку клеток в хондрогенном направлении. Для этого трехмерные культуры клеток помещают в среды на основе альфа-MEM, содержащие дексаметазон (1 мкМ), инсулин (10 мкг/мл), L-аскорбиновой кислоты-2-фосфат (0.2 мМ) пируват натрия (100 мкг/мл), антибиотики и TGF-P3 (10 нг/мл). Индикацию дифференцировки проводят путем окрашивания серийных парафиновых срезов полученных биоконструкций альциановым синим для определения кислых мукополисахаридов и сафранином для выявления клеточных ядер. В этих условиях макропористые желатиновые носители обеспечивают приобретение клетками морфо-функциональных свойств клеток хряща - значительное накопление внеклеточного матрикса, представленного, в основном, кислыми мукополисахаридами, что свидетельствует об успешной хондрогенной дифференцировке клеток (Фиг. 3в).

Пример 9. Макропористый носитель, сформированный из полимерной композиции по п. 3 формулы заявляемого изобретения, для трехмерного культивирования клеток костной ткани.

а) Получение макропористого желатинового носителя

Готовят 5 мас. % раствор желатина в диметилсульфоксиде, для чего навеску полимера суспендируют при комнатной температуре в известном объеме этого растворителя, выдерживают там для набухания сухих частиц, а затем при постоянном перемешивании нагревают при 60°С до полного растворения желатина. В полученной жидкости после ее охлаждения до 30-35°С суспендируют порошок гидроксиапатита (10 мас. % к общей массе композиции), а затем такую суспензию слоем толщиной 5 мм быстро заливают в лоток размерами 5×15×75 мм и в течение 24 ч замораживают при 3.5°С (что на 15 градусов ниже точки кристаллизации диметилсульфоксида). Далее кристаллы замороженного диметилсульфоксида экстрагируют при -20°С холодным этанолом в течение 36 ч, 9 раз заменяя экстрагент на свежую порцию. Затем проэкстрагированные образцы получившегося макропористого полимерного материала помещают в 4 мас. % этанольный раствор гидрохлорида N-(3-диметиламинопропил)-N'-этилкарбодиимида, где инкубируют на качалке при 20°С в течение 20 ч, после чего промывают этанолом, под слоем которого хранят до использования. Тест на водонерастворимость проводят аналогично тесту по примеру 1; в этих условиях полученный желатиновый носитель полностью сохраняет свою целостность и макропористую морфологию (Фиг. 4а - препарат желатинового носителя (в среде этанола) с включенными в него частицами гидроксиапатита; Фиг. 4б - препарат желатинового носителя (в среде физиологического раствора) с включенными в него частицами гидроксиапатита).

б) Биотестирование полученного материала в качестве носителя для трехмерного культивирования клеток костной ткани

Для подтверждения способности макропористых желатиновых носителей обеспечивать сохранность морфо-функциональных свойств костных клеток, культуру МСК заселяют в трехмерные матрицы, после чего проводят направленную дифференцировку клеток в остеогенном направлении. Для этого трехмерные культуры клеток помещают в среды на основе альфа-MEM, содержащие 10% ЭС, дексаметазон (100 нМ), β-глицерофосфат (10 мМ), L-аскорбиновой кислоты-2-фосфат (0,2 мМ) и антибиотики. Эффективность дифференцировки определяют по экспрессии щелочной фосфатазы с использованием набора Fast Blue RR Salt, Naphtol AS-MX Phosphate Alkaline Solution kit №85 (Sigma-Aldrich, США). Накопление внеклеточного кальция оценивают количественно, с использованием набора Са L 1 × 250 BIO LA TEST (PLIVA-Lachema, Чехия). В этих условиях макропористые желатиновые носители обеспечивают рост, распределение и приобретение клетками морфо-функциональных свойств остеобластов: экспрессию щелочной фосфатазы и способность к минерализации внеклеточного матрикса (Фиг. 4в). При этом, накопление внеклеточного кальция составляет 2.50±0.59 нмоль Са²⁺/нг ДНК.

Пример 13. Макропористый носитель, сформированный из полимерной композиции по п. 4 формулы заявляемого изобретения, для трехмерного культивирования дермальных фибробластов.

а) Получение макропористого желатинового носителя

Готовят 8 мас. %) раствор желатина в диметилсульфоксиде, для чего навеску полимера суспендируют при комнатной температуре в необходимом объеме этого растворителя, выдерживают там для набухания сухих частиц, а затем при постоянном перемешивании нагревают при 75°С до полного растворения желатина. В полученной жидкости растворяют хондроитин-сульфат в количестве 0.1 мас. % к общей массе композиции, охлаждают до комнатной температуры, а затем суспендируют порошок тонко измельченного коллагена (1 мас. % к общей массе композиции), после чего приготовленную таким образом полимерную композицию порциями по 0.1 мл помещают в имеющие сферическое дно ячейки тефлоновой формы и замораживают в течение 12 ч при -10°С (что на 28.5 градусов ниже точки кристаллизации диметилсульфоксида). Далее кристаллы замороженного диметилсульфоксида экстрагируют при -18°С холодным этанолом в течение 12 ч, 4 раза заменяя экстрагент на свежую порцию. Затем проэкстрагированные гранулы получившегося макропористого полимерного материала помещают в 1 мас. % этанольный раствор N,N-диизопропилкарбодиимида, где инкубируют на качалке при 0°С в течение 24 ч, после чего промывают этанолом, а затем высушивают в вакууме в стерильных условиях и хранят в стерильно укупоренном флаконе (Фиг. 5а). Тест на водонерастворимость проводят аналогично тесту по примеру 1; в этих условиях полученный желатиновый носитель полностью сохраняет свою целостность и макропористую морфологию с крупными порами сечением 100-290 мкм (Фиг. 5б).

б) Биотестирование полученного материала в качестве носителя для трехмерного культивирования дермальных фибробластов

Дермальные фибробласты выделяют из биоптатов (диаметр 3 мм) кожи свиньи с использованием метода эксплантации фрагментов. Для этого, кожные биоптаты дополнительно измельчают и распределяют по поверхности культурального пластика в минимальном количестве среды альфа-MEM, дополненной 10% эмбриональной сыворотки (ЭС) крупного рогатого скота, L-глутамином (0,2 мМ) и антибиотиками. После 7-10 суток культивирования, сопровождающегося значительным выселением фибробластов из биоптатов кожи, клетки трипсинизируют и расселяют в новые культуральные флаконы. Для установления способности макропористых желатиновых носителей обеспечивать адгезию и пролиферацию дермальных фибробластов при объемном культивировании, клетки заселяют в носители и культивируют в течение 7 суток. Жизнеспособность, морфологические свойства клеток оценивают путем окрашивания биоконструктов флуоресцеин-диацетатом (ФДА). Пролиферацию клеток оценивают с использованием индикатора метаболической активности Alamar Blue. В вышеуказанных условиях наблюдается эффективная адгезия и распластывание жизнеспособных дермальных фибробластов к внутренним поверхностям макропор желатиновых носителей (Фиг. 5в). Через 7 суток культивирования наблюдается более 40% повышение уровня восстановленности АВ, что свидетельствует о пролиферации клеток.

Заявляемое техническое решение имеет следующие преимущества перед аналогами и прототипом:

1. В противоположность аналогам и прототипу, где для получения желатиновых носителей используются водные растворы желатина, быстро превращающиеся в гель уже при положительных температурах, что не позволяет формировать макропористые носители крупных размеров из-за разрушающего действия кристаллизующего льда на пространственную полимерную сетку успевшего образоваться первичного гидрогеля, заявляемое техническое решение благодаря использованию диметилсульфоксида в качестве растворителя желатина позволяет формировать объемные препараты макропористых желатиновых носителей, поскольку растворы этого полимера в диметилсульфоксиде в заявляемых условиях не желируют до замерзания такой желатин-содержащей полимерной композиции. Таким образом, предлагаемое изобретение обладает существенно большей универсальностью в отношении размеров и формы конечных изделий - макропористых желатиновых носителей, используемых при трехмерном культивировании клеток животных или человека

2. Поскольку заявляемая полимерная композиция для формирования макропористого желатинового носителя, используемого при трехмерном культивировании клеток животных или человека, в качестве растворителя содержит (в противоположность водным растворам в известных аналогах и прототипе) только диметилсульфоксид, а при растворении в нем желатина осуществляется нагревание смеси до 60-80°С, то одновременно с растворением полимера протекает и эффективная стерилизация полимерной композиции, т.к. при такой обработке разрушается цитоплазматическая мембрана любых микроорганизмов. Так как все последующие операции по получению конечного продукта проводятся в среде этанола, стерильность не нарушается, т.е. далее не требуется, как в случае аналогов и прототипа, выполнения операций по дополнительной стерилизации полученных желатиновых носителей, что сокращает число стадий технологической цепочки и предотврщает нежелательую химическую модификацию желатина, как в случае способа-прототипа.

3. Заявляемое техническое решение позволяет в широких пределах варьировать состав исходной полимерной композиции для формирования макропористых желатиновых носителей как в отношении концентрации самого желатина, так и (когда это необходимо) типа и количества полимерной добавки и/или дисперсного наполнителя, вводимых в композицию. Это существенно расширяет спектр физико-химических характеристик и функциональности получаемых конечных продуктов.

4. Заявляемый способ включает меньшее число стадий по сравнению с аналогами и прототипом. Способ-прототип состоит из 11 стадий, а новый способ предусматривает только 4 основных стадии: приготовление исходной полимерной композиции, ее замораживание, криоэкстакцию кристаллов замороженного диметилсульфоксида, дубление полученного макропористого желатинового материала с окончательной промывкой конечного продукта этанолом. Поэтому заявляемый способ по сравнению с аналогами и прототипом более технологичен.

5. Большая часть этанола, применяемого на стадиях криоэкстракции, дубления и промывки полимерного материала, может быть легко регенерирована простой отгонкой из промывных жидкостей и использована повторно, что существенно снижает объем стоков и вследствие меньшего расхода этанола улучшает экономические показатели процесса получения макропористых желатиновых носителей.

Таким образом, техническим результатом заявляемого изобретения является: а) предотвращение разрушения первичного желатинового геля растущими кристаллами замерзающего растворителя; б) возможность получения более крупных по сравнению с известными макропористых желатиновых носителей, используемых для трехмерного культивирования клеток животных или человека; в) обеспечение высокой стерильности целевых материалов; г) существенное расширение их номенклатуры за счет возможности введения растворимых и нерастворимых добавок; д) значительное по сравнению с известными способами повышение технологичности заявляемого способа за счет резкого снижения числа его стадий.

Наиболее эффективно заявляемое техническое решение и получаемые согласно ему макропористые желатиновые носители могут быть использованы в биотехнологии, клеточной и тканевой инженерии, а также при разработке биоконструкций для создания искусственных органов.

Изобретение относится к полимерным гелям и способам их получения, а именно к макропористым носителям на основе желатина, которое может быть использовано в биотехнологии, клеточной технологии и тканевой инженерии. Композиция включает желатин и растворитель. В качестве растворителя используют диметилсульфоксид, дополнительно может содержать полимерную добавку, например гиалуроновую кислоту, хондроитинсульфат, агарозу, поливиниловый спирт, поли(N-винилпирролидон) или/и дисперсный наполнитель. Техническим результатом изобретения является предотвращение разрушения первичного желатинного геля, получение более крупных желатиновых носителей, высокая стерильность целевых материалов, повышение технологичности. 3 н. и 3 з.п. ф-лы, 14 ил., 2 табл.

1. Композиция для формирования макропористого носителя, используемого при трехмерном культивировании клеток животных или человека, содержащая желатин и растворитель, отличающаяся тем, что в качестве растворителя используют диметилсульфоксид при следующем соотношении компонентов, мас.%:
желатин 5-10 диметилсульфоксид остальное.

2. Композиция по п.1, дополнительно содержащая полимерную добавку, в качестве которой используют растворимый в диметилсульфоксиде природный или синтетический полимер, выбранный из группы, включающей гиалуроновую кислоту, хондроитинсульфат, агарозу, поливиниловый спирт, поли(N-винилпирролидон) при следующем соотношении компонентов, мас.%:
желатин 5-10 полимерная добавка 0,1-5 диметилсульфоксид остальное.

3. Композиция по п.1, дополнительно содержащая дисперсный наполнитель, в качестве которого используют нерастворимые в диметилсульфоксиде гидроксиапатит, трикальций-фосфат, измельченный коллаген, костную муку, при следующем соотношении компонентов, мас.%:
желатин 5-10 дисперсный наполнитель 1-10 диметилсульфоксид остальное.

4. Композиция по п.1, дополнительно содержащая полимерную добавку по п.2 и дисперсный наполнитель по п.3, при следующем соотношении компонентов, мас.%:
желатин 5-10 полимерная добавка 0,1-5 дисперсный наполнитель 1-10 диметилсульфоксид остальное.

5. Способ получения макропористого носителя из композиции по п.1 или 2, отличающийся тем, что ингредиенты композиции растворяют в диметилсульфоксиде, далее раствор замораживают в течение 1-24 ч при температуре на 15-40°С ниже точки кристаллизации диметилсульфоксида, затем замерзший растворитель экстрагируют этанолом при (-15)-(-30)°С, после чего полученный структурированный замораживанием полимерный продукт в течение 6-36 ч при 0-30°С обрабатывают 1-10 мас.% этанольным раствором дубителя, выбранного из группы, включающей глутаровый альдегид, формальдегид, дженипин, N,N-диизопропилкарбодиимид, гидрохлорид N-(3-диметиламинопропил)-N'-этилкарбодиимида, N-циклогексил-3-(2-морфолиноэтил)-карбодиимид, а затем полученный макропористый желатиновый носитель промывают этанолом.

6. Способ получения макропористого носителя из композиции по п.3 или 4, отличающийся тем, что ингредиенты композиции растворяют в диметилсульфоксиде, дисперсный наполнитель суспендируют в полученном растворе, а далее суспензию замораживают в течение 1-24 ч при температуре на 15-40°С ниже точки кристаллизации диметилсульфоксида, затем замерзший растворитель экстрагируют этанолом при (-15)-(-30)°С, после чего полученный структурированный замораживанием полимерный продукт в течение 6-36 ч при 0-30°С обрабатывают 1-10 мас.% этанольным раствором дубителя, выбранного из группы, включающей глутаровый альдегид, формальдегид, дженипин, N,N-диизопропилкарбодиимид, гидрохлорид N-(3-диметиламинопропил)-N'-этилкарбодиимида, N-циклогексил-3-(2-морфолиноэтил)-карбодиимид, а затем полученный макропористый желатиновый носитель промывают этанолом.