СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ ВИРУСОВ В ЖИДКОМ БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ И УСТРОЙСТВО ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ Российский патент 2004 года по МПК C12Q1/06 G01N15/06 

Изобретение относится к биотехнологии, вирусологии и медицине. Предлагаемый способ может применяться для определения концентрации вирусов в суспензиях, например, в крови человека и животных, во взвесях растительных и животных клеток, бактерий, а также в промышленном производстве для контроля чистоты технологических жидкостей.

Известен способ количественного определения вирусов [1] . Сущность предлагаемого способа заключается в том, что меченые антитела взаимодействуют непосредственно с определяемым вирусом в растворе. Образующийся полиэлектролитный комплекс антитело-вирус переводится в нерастворимое состояние последовательным добавлением полианиона и поликатиона. Образующийся полиэлектролитный комплекс полианион-поликатион является осадителем комплекса вирус-поликатион. Концентрацию метки можно определить непосредственно в растворе или в образовавшемся поликомплексе после его растворения. Определяемая концентрация метки пропорциональна начальной концентрации определяемого вируса и служит характеристикой его содержания в исследуемом растворе.

Недостатком этого способа является высокая трудоемкость и длительность проведения анализа и получения исходных материалов.

Наиболее близким аналогом (прототипом) по достигаемому результату является способ определения концентрации вирусов в суспензии, суть которого заключается в следующем. В нескольких культиваторах на питательной среде выращивают монослой клеток, имеющих рецепторные участки на мембране, обеспечивающие специфическую адсорбцию тестируемого вида вирусов (вирусчувствительные клетки). Далее в каждый культиватор вносят известное количество исследуемой вирусной суспензии с различным известным разведением. После заданной временной экспозиции производят подсчет количества вирусных бляшек на клеточном монослое. Концентрация вирусов в исходной пробе рассчитывается по известной степени ее разведения и количеству бляшек на клеточном монослое [2].

Недостатками указанных аналогов являются длительный период тестирования (от 1 до 7 суток), высокая трудоемкость, необходимость применения широкой номенклатуры различных ингредиентов, поддержания специальных условий в течение длительного времени.

Наиболее близким аналогом (прототипом) устройства для определения концентрации вирусов в жидком биологическом материале является электрооптическое средство для идентификации и подсчета микроорганизмов [3]. Указанное устройство включает прозрачную измерительную кювету, в которой расположены электроды, соединенные с источником электропитания, а также измерительный блок. Измерительный блок содержит лазерный источник света, луч которого проходит через участок кюветы между электродами и детектор рассеянного частицами (микроорганизмами) света, связанного с системой регистрации данных.

Недостатком данного устройства является то, что оно не обеспечивает измерение концентрации вирусов в жидких образцах.

Техническим результатом предлагаемых изобретений является обеспечение возможности определения концентрации вирусов в жидких биологических материалах за более короткое время, с меньшей трудоемкостью за счет регистрации подвижности интактных и инфицированных вирусчувствительных тест-клеток, а также автоматизации процесса измерения.

Указанный технический результат достигается тем, что в способе определения концентрации С_в вирусов в жидком биологическом материале, включающем отбор проб исследуемого материала в жидкой форме на наличие вирусов, разведение их с заданным коэффициентом k, смешение разведенных проб с тестовой клеточной суспензией в учетной лунке с заданной концентрацией клеток С_к с последующим определением концентрации вирусов С_в, согласно изобретению предварительно отбирают тестовые клетки, обладающие высокой специфичностью к исследуемому виду вируса и определяют среднее количество β вирусов, обеспечивающих инфицирование указанных клеток, одним из известных методов, например методом электронной микроскопии, а концентрацию вирусов С_в определяют путем переноса смеси исследуемых проб материала с заданной концентрацией клеток С_к в измерительную кювету, формирования в кювете неоднородного переменного электрического поля с частотой от 10 кГц до 500 МГц, измерения средней скорости движения каждой клетки в суспензии и определения доли неподвижных клеток по формуле

где А - количество неподвижных клеток, скорость которых меньше или равна скорости броуновского движения;
В - общее количество клеток, попавших в поле измерения, с последующим определением концентрации вирусов по формуле
С_в=С_к• α•β•k.

Указанный технический результат достигается также тем, что в устройстве для определения концентрации С_в вирусов в жидком биологическом материале, включающем прозрачную измерительную кювету, в которой расположены электроды, соединенные с источником электропитания, а также измерительный блок, согласно изобретению источник электропитания представляет собой генератор переменного электрического напряжения, а измерительный блок содержит микроскоп, оптически связанный с измерительной кюветой, и систему анализа изображения для измерения скорости движения тест-клеток, содержащую видеокамеру, оптически связанную с микроскопом, и компьютер, соединенный с видеокамерой. Причем электроды в измерительной кювете установлены с зазором, достаточным для формирования в нем средней напряженности электрического поля в пределах от 10⁴ до 10⁶ вольт/м.

В условиях неоднородного переменного электрического поля (НПЭП) тестируется подвижность вирусчувствительных клеток в суспензии. Проведенные эксперименты показали, что интактные клетки обладают значительной подвижностью в условиях переменного неоднородного электрического поля. В слабоэлектропроводящем растворе глюкозы интактные клетки поступательно движутся в область с высокой напряженностью электрического поля при высокой частоте (≈1-500 МГц) электрического поля. При более низкой частоте электрического поля (≈10-100 кГц) интактные клетки движутся в область с низкой напряженностью электрического поля. Кроме того, установлено, что инфицированные клетки уже на стадии адсорбции вируса на клеточной мембране теряют свою способность движения в НПЭП. Принципиальная разница в подвижности интактной и инфицированной клетки в НПЭП положена в основу изобретения. Количество неподвижных и движущихся клеток в НПЭП связывается с концентрацией вируса в клеточной суспензии.

Изобретения иллюстрируются следующими графическими материалами. На фиг.1 приведена блок-схема автоматизированной установки для реализации предлагаемого способа определения концентрации вирусов в жидком биологическом материале. На фиг.2 представлена конструкция измерительной ячейки.

Устройство для определения концентрации С_в вирусов в жидком биологическом материале включает разборную оптически прозрачную измерительную кювету 1, в которой расположены металлические электроды 2 и 3, соединенные с источником электропитания 4, а также измерительный блок. Источник электропитания 4 представляет собой генератор переменного электрического напряжения, а измерительный блок содержит микроскоп 5, оптически связанный с измерительной кюветой 1, и систему анализа изображения для измерения скорости движения тест-клеток, содержащую видеокамеру 6, оптически связанную с микроскопом 5, и компьютер 7, соединенный с видеокамерой 6. Компьютер 7 содержит специализированную программу обработки изображений. Измерительная кювета 1 размещена на подвижном столе 8 микроскопа 5.

Причем электроды 2 и 3 в измерительной кювете 1 установлены с зазором, достаточным для формирования в нем средней напряженности электрического поля в пределах от 10⁴ до 10⁶ вольт/м. Зазор между электродами 2 и 3 в экспериментальных конструкциях устанавливают в пределах 50-100 мкм, а толщина указанных электродов составляет 0,2-2 мкм.

Устройство функционирует следующим образом. Измерительную кювету 1 устанавливают на подвижный стол 8 микроскопа 5 и фиксируют на нем указанную кювету 1. В измерительную кювету 1 вносят пробу вирусклеточной суспензии с известной степенью разведения. На электроды 2 и 3 измерительной кюветы 1 подают напряжение (не более 10 вольт) от источника 4 (генератора) переменного напряжения, между которыми формируется средняя напряженность электрического поля в пределах от 10⁴ до 10⁶ вольт/м. С помощью видеокамеры 6 регистрируют динамику движения отдельных клеток в измерительной кювете 1. С видеокамеры 6 видеосигнал динамики движения клеток подают на компьютер 7 (со специализированной программой обработки изображений), где обрабатываются данные и вычисляется концентрация С_в вирусов в жидком биологическом материале.

Способ определения концентрации С_в вирусов в клеточной суспензии, реализуют следующим образом. Вначале предварительно отбирают тестовые клеток, обладающие высокой специфичностью к исследуемому виду вируса и определяют среднее количество β вирусов, обеспечивающих инфицирование указанных клеток, одним из известных методов, например методом электронной микроскопии. Далее проводят отбор проб исследуемого материала в жидкой форме на наличие вирусов. Пробы разводят с заданным коэффициентом k, смешивают разведенные пробы с тестовой клеточной суспензией в учетной лунке с заданной концентрацией клеток С_к и переносят смесь исследуемых проб материала с заданной концентрацией клеток С_к в измерительную кювету 1. В кювете 1 формируют неоднородное переменное электрическое поле с частотой от 10 кГц до 500 МГц и средней напряженностью электрического поля в зазоре между электродами в пределах от 10⁴ до 10⁶ вольт/м путем подачи напряжения (не более 10 вольт) на электроды 2 и 3 от источника 4 (генератора) электропитания. В результате контакта вирусов с тест-клетками часть из них инфицируется и подвижность этих инфицированных клеток изменяется. При этом измеряют среднюю скорость движения каждой клетки в суспензии и определение доли неподвижных клеток по формуле

где А - количество неподвижных клеток, скорость которых меньше или равна скорости броуновского движения;
В - общее количество клеток, попавших в поле измерения, с последующим определением концентрации вирусов С_в по формуле
С_в=С_к•α•β•k.

Пример конкретного выполнения способа определения концентрации вирусов в жидком биоматериале на экспериментальной установке.

В данном примере в качестве исследуемого вируса использован вирус краснухи (rubella), а в качестве вирусчувствительных клеток, обеспечивающих специфическую адсорбцию тестируемого вида вирусов отобраны клетки эритроцитов гуся. На плашке формируют непрерывный ряд лунок в количестве от 5 до 15. Количество лунок выбирают исходя из априорной концентрации вируса. Чем выше исходная концентрация вирусов, тем больше количество лунок в ряду. В каждую лунку вносят по 100 мкл клеточной суспензии эритроцитов гуся с концентрацией, например, 1 млн/мл. Далее в первую лунку в ряду вносят 100 мкл вирусной суспензии краснухи. Концентрацию вирусов, начиная от первой лунки, изменяют (титруют) с заранее выбранным шагом разведения, например в (2, 10) раз. Через (2-5) минут экспозиции вируса в клеточной суспензии вирусклеточную суспензию пипеткой перемешивают и вносят в измерительную кювету 1. После того как клеточная суспензия придет в состояния покоя, на металлические электроды 2 и 3 измерительной кюветы 1 подают переменное напряжение (не более 10 В). Определение количества неподвижных и движущихся клеток под действием переменного электрического поля осуществляют с помощью компьютера 7 и специализированной программы обработки изображений по формуле
С_в=С_к•α•β•k,
где С_в - концентрация вирусов в исследуемой суспензии;
С_к - концентрация клеток в учетной лунке;
α - доля неподвижных клеток;

где А - количество неподвижных клеток, скорость которых меньше или равна скорости броуновского движения;
В - общее количество клеток, попавших в поле измерения.

β - среднее количество вирусов, при адсорбции которых на мембране существенно изменяются электрические характеристики клетки. Используя метод электронной микроскопии было показано, что β приблизительно равно 1.

k - коэффициент разведения исследуемой суспензии вирусов в учетных лунках (k в разных учетных лунках равен 40; 80; 160; 320; 640; 1280 соответственно.

Подсчет осуществляют для всего ряда лунок. Концентрацию вируса краснухи определяют по учетной лунке, в которой отношение количества подвижных и неподвижных клеток равно единице. Начальную концентрацию вируса в первой лунке определяют с учетом степени разведения.

В таблице приведено сравнение экспериментальных данных определения концентрации вируса краснухи (rubella) методом бляшкообразующих единиц [1, прототип] и предлагаемым методом. Из этого сравнения следует, что в среднем одна вирусная частица при адсорбции на мембране существенно изменяет электрические характеристики клетки. Данная таблица служит примером калибровочной зависимости для определения концентрации вирусов методом подсчета концентрации неподвижных клеток-мишеней в суспензии при воздействии неоднородного переменного электрического поля.

Из таблицы видно, что преимущество предложенного способа определения концентрации вирусов в суспензии по сравнению с существующими способами заключается в том, что он обеспечивает определение концентрации вирусов в суспензии в счетном режиме со значительной экономией временных и материальных затрат. Время для анализа концентрации вирусов сокращается до 3 мин, что более чем в 100 раз меньше по сравнению с методом бляшкообразующих единиц.

Предлагаемое устройство может быть изготовлено в условиях малого предприятия и промышленного производства с использованием стандартного оборудования, современных материалов и технологии.

Источники информации
1. Авт.свид. СССР 1394708, кл. C 12 Q 1/00, G 01 N 33/53, 1991.

2. Заявка Франции 2156325, кл. G 01 N 15/00, 1972 (прототип способа).

3. Патент США 4576916, НКИ 435-289, опубл. 18.03.86 (прототип устройства).

Изобретение относится к биотехнологии, вирусологии и медицине. Предложенный способ определения концентрации вирусов предусматривает отбор проб исследуемого материала в жидкой форме, дальнейшее разведение проб с заданным коэффициентом k, последующий отбор тестовых клеток, обладающих высокой специфичностью к исследуемому виду вируса, и определение среднего количества вирусов β, обеспечивающих инфицирование указанных клеток, дальнейшее разведение проб с тестовой клеточной суспензией в учетной лунке с заданной концентрацией клеток С_к, последующее определение концентрации вирусов С_в путем переноса смеси исследуемых проб материала с заданной концентрацией клеток С_к в измерительную кювету. При этом в кювете формируют неоднородное переменное электрическое поле и проводят измерение средней скорости движения каждой клетки суспензии. Далее определяют долю неподвижных клеток по формуле α=А/В с последующим определением концентрации вирусов по формуле С_в=С_k•α•β•k. Также предложено устройство для определения концентрации вирусов. Устройство включает прозрачную измерительную кювету, в которой расположены электроды, соединенные с источником электропитания, а также измерительный блок. Источник электропитания представляет собой генератор переменного электрического напряжения. Измерительный блок содержит микроскоп, оптически связанный с измерительной кюветой, и систему анализа изображения, содержащую видеокамеру, оптически связанную с микроскопом, и компьютер, соединенный с видеокамерой. Предложенные способ и устройство позволяют определять концентрацию вирусов за более короткое время, уменьшить трудоемкость процесса, а также автоматизировать процесс измерения. Изобретения могут быть использованы для определения концентрации вирусов в суспензиях, а также в промышленном производстве для контроля чистоты технологических жидкостей. 2 с. и 2 з.п. ф-лы, 2 ил., 1 табл.

1. Способ определения концентрации С_в вирусов в жидком биологическом материале, включающий отбор проб исследуемого материала в жидкой форме на наличие вирусов, разведение их с заданным коэффициентом k, смешение разведенных проб с тестовой клеточной суспензией в учетной лунке с заданной концентрацией клеток С_к с последующим определением концентрации вирусов С_в, отличающийся тем, что предварительно отбирают тестовые клетки, обладающие высокой специфичностью к исследуемому виду вируса и определяют среднее количество β вирусов, обеспечивающих инфицирование указанных клеток, одним из известных методов, например, методом электронной микроскопии, а концентрацию вирусов С_в определяют путем переноса смеси исследуемых проб материала с заданной концентрацией клеток С_к в измерительную кювету, формирования в кювете неоднородного переменного электрического поля, измерения средней скорости движения каждой клетки в суспензии и определения доли неподвижных клеток по формуле

где А - количество неподвижных клеток, скорость которых меньше или равна скорости броуновского движения;

В - общее количество клеток, попавших в поле измерения, с последующим определением концентрации вирусов по формуле

С_в=С_к·α·β·k.