Способ количественного определения вирусов Советский патент 1991 года по МПК C12Q1/00 G01N33/53 C12Q1/00 C12R1/91 

оэ со |;ь

Изобретение относится к области иммунохимии вирусов и может быть использовано в различных областях ме- даци№1, сельского хозяйства для высо кочувствительного экспресс-анадтиза

материала, содержащего вирусы.

Целью изобретения- является упрощение способа.

Пример 1, Анализ х-вируса картофеля (ХВК) с использованием в качестве по ли электролитов полимет- акриловой кислоты (ШАК) и пoли -N этил-А-винил-пиридиний бромида (ПВП)

В качестве антител используют

v-глобулиновую фракцию кроличьей ан- тисыворотки к ХВК. у глобулинову10 фракцию сыворотки крови выделяют дву крат1шм осаждением 20% -ным водным раствором пол1 этиленгликоля (М. В.

400-6000) с последу1о 51м диализом против 0,01 М К-фосфатного буфера (0,1 М NaCl) рН 7.4.

Перед использованием иммуноглобуЛИНЫ термостатируют при в те- .ение 30 мин. В качестве фермента используют пероксидазу хрена (ИХ) с ,,0 (производство НПО Био химреактив, г. Олайнсэ Латвийская ССР) (ЕС .П.1.7). Коньюгат иммуно- глобулинов с пероксидазой (АТ-ПХ) получают методом окисления углеводного компонента фермента периодатом натрия.

В качестве антигена используют агсокоочищенный вирусный препарат ХВК. Препаративное выделение очищенных экстрактов ХВК, его очистку и концентрирование проводят по стандартной методике, используя несколь- . ко циклов дифференицального центрифугирования .

Полиметакриловую кислоту (ПМАК) получают свободнорадикальной поли- ме изацией метакриловой кисЛоты с последующим выделением из метанола фракщш с МВу 200000-300000 добавлением ацетоуксусног-о эфира,

Поли-Н этил-4-винил-пиридиний бромид (ПВП) получают алкилирова- кием поли-4-винилпиридина избытком бромистого этила при в течение 30 ч с последуимцим высаживанием в эфир. В работе используют ПВП с MB «АОООО-100000.

Экстракты вирусов из растительного материала получают, растирая материал в фарфоровой с добавлением 0,01 М К-фосфатного буфера

(0,1 М NaCl) , 0,7, тритон Х-100) рН 7,4 в соотношении 1:5 (растительная масса: объем буфера). Полученные экстракты осветляют дентрифугирова- }шем 5 мин при 8000 об/мин. После центрифугирования надосадок подвергают дальнейшему осветлению встряхи- еанием с хлороформом (1/3 часть от объема экстракта) .в течение 3 мин с интенсивностью около 100 качаний в минуту. Далее, эмульсию центрифугируют 5 мин при 8000 о.б/мин. Hcnolib зуют водную фазу, В пробирку, содержащую 0,1 мл исследуемого образца (растительный сок, экстракт И ли очи- щашштй препарат ХВК), добавляют 0,05 мл раствора коньюгата АТ-ПХ (100 нг/мл по Г1Х).в 0,01 М К.- фос- .фатном буфере (0,1 М NaCl 0,1% тритон Х-100) рН 7,8 (ТФБ). После чего последовательно добавляют по 0,025 мл раствора ПМАК (0,2 мг/мл) и ПВП (0,5 мг/мл) в том же буфере. Осадок отделяют центрифугированием 5 мин при 2500 об./мин на центрифуге TT.-6R (Back-man, Австрия). Осадок отмывают трижд л по 0,25 мл ТФБ. От№1- Готй осадок растворяют в 0,05 М трис- шдетатном буфере ,(1 М ИаС1 0,1% тритон Х-100) рП 7,8 в течение 1 мин при комнатной температуре. Добавляют 0,15 мл субстратной смеси (o-фeнилeндиaIviин 0,53 иг/мл, 0,008% в 0,1 М К-цитратном буфере рН 5,2), инкубируют 10 мин при ком натной температуре. Реакцию останавливают, добав.пяя О, мл 4 М и определяют оптическую плотность продукта ферментативной реакции при 490 нм. Пересчет оптической плотное- тй продукта ферментативной реакции в концентрацию ХВК производят по калибровочному графику, полученному при измерении стандартного препарата ХВК, внесенного в сок здорового растения. Чувствительность метода - 8 нг/мл ХВК, время одного анализа 15 мин. Метод дает возможность выявлять ХВК в проростказ4, листьях растений на различных стадиях вегетации, а также проводить контроль растений оздоровленных методом культуры меристем..

П р и м.е р 2, Определение вируса гепатита В с использованием ПМАК и ПВП. К 0,1 мл исследуемого образца (сыворотка или очищенный препарат поверхностного антигена вируса гепатита В) добавляют 0,05 мл раствора меченых ферментом антител (АО нг/мл по ферменту) и ТФБ инкубируют 5 мин при комнатной температуре и перемешивании. Затем последовательно добавляют по 0,025 мл раствора ПМАК (0,2 мг/мл) и ПВП (0,5 мг/мл). Осадок отделяют центрифугированием 5 ми при 2500 об/мин. К 0,05 мл надосадка добавляют О,15 мл субстратной смеси (о-фенилендиамин 0,53 мг/мл, 0, . в О,1 М К-цитратном буфере рН 5, .). Инкубируют 5 мин при комнатной температуре. Реакцию оста- навливают, добавляя 0,1 мл AMHjSO , и определяют оптическую плотность продукта ферментативной реакции при 490 им. Чувствительность метода - 0,5 нг/мл вируса, время анализа -

15 мин.

По сравнению с разработанным на Сегодняшний день медицинской диагностикой иммуноферментным твердофазным методом анализа гепатита В, предлагаемый способ позволяет сократить время анализа с 5 ч до 15 мин при

двухкратной увеличении чувствитель- ности детекции. Экспресс- метод де-г текции вируса гепатита В представляет большой интерес для примененяя на станциях переливания крови, где в настоящее время используется метод встречного иммуноэлектрофореза, позволяющий определить в течение суток до I мкг антигена.

Формула изобретения

Способ количественного определения вирусов, включающий образование комплекса исследуе1 1х вирусов с мечеными специфическиьш антителами и осаждение его под действием поликатиона и полианиона, отмывание осадка, добавление субстратй и определение концентрации вирусов по концентрации метки, отличающий с я тем, что, с целью упрощения способа, меченые антитела добавляют непосредственно к вирусам, а поликатион и полианион вводят последовательно к полученному комплексу виру сы-меченые антитела.