СПОСОБ ВЫРАЩИВАНИЯ КРИСТАЛЛОВ КАЛЬЦИЙФОСФАТОВ Российский патент 2000 года по МПК C30B7/00 C30B29/14 

Изобретение относится к области биомедицины, конкретно к способам выращивания кристаллов кальцийфосфатов и может быть использовано в травматологии, ортопедии, стоматологии, клеточной инженерии, фармакологии.

Известен способ выращивания кристаллов в силикагелевой системе при 37^oC, pH 5-7 с добавлением калиофосфатного раствора брушита (дикальцийфосфат дигидрат CaHPO₄ + 2H₂O) в присутствии флюоридов (P₂O₇) (Racquel Z. Le Geros "Calium Phoshhates in Oral Biology and Medicine, с. 200.)
Однако данный способ обладает некоторыми недостатками, а именно не позволяет выращивать кристаллы из трудно растворимых кальцийфосфатных соединений, которые являются основным метаболитом костной и зубной тканей.

В качестве наиболее близкого аналога принят способ выращивания кристаллов кальцийфосфатов при 37^oC, pH 5-7 в солевом растворе (HOHL H. The crystallization of hydroxyapatite and dicalcium phospate dihydrate. I. Cryst. Growth. 1982, v. 57, N 2, p. 325-335).

Целью изобретения является устранение недостатков прототипа, а именно выращивание кристаллов из трудно растворимых кальцийфосфатных соединений.

Поставленная цель достигается тем, что выращивание кристаллов проводят при 37^oC, pH 5-7; причем процесс ведут 30-40 дней в сбалансированном солевом растворе, дополнительно содержащем насыщенный раствор порошка гидроксиапатита в органической кислоте.

Отличие заявляемого способа от известного состоит в том, что процесс ведут 30-40 дней в сбалансированном солевом растворе, дополнительно содержащем насыщенный раствор порошка гидроксиапатита, в органической кислоте.

Отличительные признаки в заявляемой совокупности проявили новый, неизвестный ранее положительный эффект, а именно выращивание кристаллов из трудно растворимых кальцийфосфатных соединений. С учетом изложенного следует считать заявляемое изобретение соответствующему критерию "существенные отличия".

Для лучшего понимания сущности способа предлагаем конкретные примеры его выполнения.

Пример 1.

Берут сбалансированный солевой раствор, например среду Дульбокко:
CaC₁₂ + 2H₂O - 0,133
MgC₁₂ + 6H₂O - 0,1
KCl - 0,2
NaHPO₄ - 0,15
NaCl - 8,0
NaH₂PO₄ - 1,15
MgSO₄ + 7H₂О - 0,2
Добавляют в нее насыщенный раствор порошка гидроксиапатита в лимонной кислоте, при pH 5, 37^oC ведут процесс 30 дней. Полученные кристаллы биосовместимы и обладают выраженными биологическими свойствами по отношению к костным клеткам.

Пример 2.

Берут сбалансированный солевой раствор, например Хенкса:
CaC₁₂ + 2H₂O - 0,185
KCl - 0,4
NaCl - 8,0
NaH₂PO₄ - 0,06
MgSO₄ + 7H₂O - 0,2
Na₂HCO₃ - 2,0
KHPO₄ - 0,06
Глюкоза - 1,0
Добавляют насыщенный раствор порошка гидроксиапатита в щавелевой кислоте, при pH 7, 37^oC ведут процесс 40 дней. Полученные кристаллы биосовместимы и обладают выраженными биологическими свойствами по отношению к костным клеткам.

Наличие у полученных кристаллов биологических свойств (остеоиндуктивность и остеокондуктивность) по отношению к костным клеткам было обнаружено следующим образом.

Имплантаты из титана и его сплавов с покрытием, содержащим выращенные заявляемым способом кристаллы, прошли испытания остеоиндуктивных и остеокондуктивных свойств. В качестве контроля использовали имплантаты с покрытием без кристаллов. Имплантаты были выполнены из титана марки ВТ 1-0 и его сплавов диаметром 12 мм, толщиной 1,1-1,2 мм.

Опыты проведены на самцах мышей линии Balb/c (лаборатория биомодулирования СО РАМН) массой 20-22 г, находящихся в стандартных условиях и диете с 07.04.99 по 20.05.99. Мышей предварительно выдерживали в течении 2-3 недель в карантине, больные и нестандартные животные выбраковывались.

Каждому животному после дачи эфирного наркоза подкожно вводили по 4 диска. Для определения остеокондуктивных свойств на диски предварительно наносили столбик костного мозга, выделенного из бедренной кости путем вымывания 1-2 мл среды Д-МЕМ с 5% эмбриональной телячьей сывороткой. Остеоиндуктивность исследовали без нанесения на диски костного мозга. Через один месяц животных забивали, определяли физическими методами силу сцепления дисков с окружающей тканью. Предварительную оценку размеров очагов костеобразования осуществляли с помощью бинокулярного микроскопа МВС-2, после чего делали гистологический, цитологический и цитохимический анализ (кислая, щелочная фосфотаза), для определения качественного состава костный и других клеток на поверхности имплантата и реакции на него окружающей ткани.

В результате проведения исследований было установлено, что признаки воспаления, нагноения, аллергических реакций со стороны окружающих тканей вокруг покрытий ни в одном случае не было (биосовместимость).

Результаты обрабатывали методом непараметрической статистики.

Биологические свойства поверхности на титане марки ВТ 1-0 и его сплавах, полученные на животных линии Balb/c.

Выводы:
1. Кальцийфосфатные материалы (без кристаллов) не вызывают образования вокруг себя костной ткани или ее проведения.

2. Биоактивные материалы, содержащие кристаллы, полученные заявляемым способом, вызывают образование вокруг себя костной ткани или ее проведения, не сопровождаются нагноением, воспалением, аллергическими реакциями, не образуют стромальной капсулы.

Способ выращивания кристаллов кальцийфосфатов относится к области биомедицины и может быть использован в травматологии, ортопедии, стоматологии, клеточной инженерии, фармакологии. Сущность способа заключается в выращивании кристаллов при 37°С, рН 5-7. Новизна способа состоит в том, что процесс ведут 30-40 дней в сбалансированном солевом растворе, дополнительно содержащем насыщенный раствор порошка гидроксиапатита в органической кислоте. Техническим результатом изобретения является выращивание кристаллов из трудно растворимых кальцийфосфатных соединений. 1 табл.

Способ выращивания кристаллов кальцийфосфатов при 37^oC, pH 5 - 7 в солевом растворе, отличающийся тем, что процесс ведут 30 - 40 дней, раствор используют сбалансированный, дополнительно содержащий насыщенный раствор порошка гидроксиапатита в лимонной или щавелевой кислоте.