СПОСОБ ИНТЕГРАЛЬНОЙ ОЦЕНКИ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СТРЕССА ПРИ НЕОТЛОЖНЫХ СОСТОЯНИЯХ Российский патент 2004 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к медицине и может быть использовано в клинической биохимии для определения выраженности окислительного стресса и контроля за эффективностью его коррекции при неотложных состояниях.

Окислительный стресс - это нарушение баланса прооксидантантиоксидант в сторону прооксидантов, проводящее к потенциальному повреждению оснований ДНК, окислению белков и перекидному окислению липидов [1].

В настоящее время для оценки окислительного стресса используют определение отдельных показателей свободнорадикальных реакций и антиоксидантной системы (АОС). Интенсивность свободнорадикальных реакций в организме чаще всего оценивают по уровню продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) в сыворотке крови: диеновых конъюгатов, гидроперекисей липидов, степени окисленности липидов, ТБК - активных продуктов (малоновый диальдегид), Шиффовых оснований [2-7]. Для оценки состояния АОС используют определение в крови уровня эндогенных антиоксидантов (α-токоферол, окисленный и восстановленный глутатион, аскорбиновая кислота) и активности антиоксидантных ферментов (супероксиддисмутаза, глутатионпероксидаза, каталаза, церулоплазмин) [2-7]. Однако оценка выраженности окислительного стресса затрудняется отсутствием унифицированных методов определения продуктов ПОЛ и показателей АОС, что вызывает неадекватную оценку полученных данных, их интерпретацию и приводит к снижению ее точности.

Задачей данного изобретения является повышение точности и чувствительности метода за счет того, что оценка окислительного стресса не зависит от выбора метода определения показателей ПОЛ и АОС.

Поставленная задача решается тем, что в способе оценки окислительного стресса при неотложных состояниях, включающем определение в сыворотке крови показателей свободнорадикальных реакций и антиоксидантной системы, проводят интегральную оценку окислительного стресса по значению коэффициента окислительного стресса (К), определяемому по формуле

где ДКi - содержание диеновых конъюгатов в сыворотке крови больного;

МДАi - содержание малонового диальдегида в сыворотке крови больного;

COi - степень окисленности общих липидов сыворотки крови больного;

TФi - содержание α-токоферола в сыворотке крови больного;

ЦПi - содержание церулоплазмина в сыворотке крови больного;

ДКn - содержание диеновых конъюгатов в норме;

МДАn - содержание малонового диальдегида в норме;

СОn - степень окисленности общих липидов в норме;

ТФn - содержание α-токоферола в норме;

ЦПn - содержание церулоплазмина в норме,

и значение коэффициента К, превышающее 1,12, свидетельствует об усилении окислительного стресса и преобладании прооксидантных процессов над антиоксидантными.

Способ осуществляется следующим образом. У больного забирают кровь в пробирку без антикоагулянта и общепринятым методом получают сыворотку крови. В сыворотке крови определяют содержание диеновых конъюгатов, малонового диальдегида, степени окисленности общих липидов, α-токоферола, церулоплазмина. Для определения коэффициента окислительного стресса К используют математическое выражение, в одной части которого стоит произведение относительных значений (относительно нормы) показателей ПОЛ, а в другой - произведение относительных значений (относительно нормы) показателей АОС.

Для определения коэффициента окислительного стресса К в норме исследовали здоровых доноров. Производили забор крови и определяли основные показатели гомеостаза (клинические, биохимические и иммунологические), отбирали кровь доноров, у которых значения основных показателей гомеостаза находились в пределах верхней и нижней границы общепринятой нормы с учетом пола и возраста. Затем в сыворотке крови здоровых доноров определяли показатели ПОЛ - диеновые конъюгаты (ДК), малоновый диальдегид (МДА), степень окисленности общих липидов (СО) и показатели АОС - альфа-токоферол (ТФ), церулоплазмин (ЦП). По каждому из этих показателей определяли среднестатистическое значение, которое приняли за норму: ДКn=0,62±0,03, МДАn=1,24±0,07, СOn=0,54±0,02, ТФn=3,24±0,15, ЦПn=31,8±2,1 и по формуле

вычисляли значение коэффициента окислительного стресса К для каждого донора, где ДКд, МДАд, СOд, ТФд, ЦПд - конкретные значения индивидуальных показателей.

Находили среднестатистическое значение К, которое и приняли за норму. Величина коэффициента К составила 1,12 (Кп=1,12 у.е).

Для определения коэффициента окислительного стресса К у больного при неотложных состояниях забирали кровь в пробирку без антикоагулянта и общепринятым методом получали сыворотку крови, в которой определяли содержание ДК, МДА, СО, ТФ, ЦП, затем определяли коэффициент К по вышеуказанной формуле, числитель - показатели ПОЛ и АОС больного, а знаменатель - показатели ПОЛ и АОС в норме. Значение коэффициента К, превышающее величину 1,12 у.е., свидетельствует о преобладании прооксидантных процессов над антиоксидантными.

Пример расчета коэффициента К окислительного стресса.

У больного определено, что согласно используемым методикам содержание ДК составляет 1,16 (ΔD₂₃₃/мл·мг), МДА - 2,63 (нмоль/мл), СО - 0,73 (ΔD₂₃₃/ΔD₂₁₈), ТФ - 2,68 (мкг/мл·мг), ЦП - 22,3 (мг/100 мл). Нормальные значения показателей (единицы измерения те же): ДК=0,62, МДА=1,24, СО=0,54, ТФ=3,24, ЦП=31,8. Полученные значения показателей подставляем в формулу

В этом примере у больного коэффициент окислительного стресса К увеличен в 8,1 раза (9,19:1,12) по сравнению с нормой.

Преимуществом предлагаемого способа оценки окислительного стресса по коэффициенту К по сравнению с прототипом, в котором оценку окислительного стресса проводят по измерению отдельных показателей ПОЛ и АОС, заключается в том, что коэффициент К является более чувствительным показателем. Влияние терапии на отдельные показатели ПОЛ и АОС могут носить разнонаправленный характер, что затрудняет интерпретацию эффективности коррекции окислительного стресса при неотложных состояниях. Кроме того, отсутствуют унифицированные методы определения продуктов ПОЛ и показателей АОС, а относительные значения показателей ПОЛ и АОС, используемые при определении коэффициента К в предлагаемом способе, не зависят от методов определения продуктов ПОЛ и показателей АОС.

Авторы использовали в предлагаемом способе следующие методики для определения показателей ПОЛ и АОС:

ДК - спектрофотометрический метод в ультрафиолетовом диапазоне (233 нм),

МДА - спектрофлуорометрический метод (λ_возб=515 нм, λ_фл=545 нм),

СО - спектрофотометрический метод в ультрафиолетовом диапазоне (233 нм и 218 нм),

ТФ - спектрофлуорометрический метод (λ_вoзб=295 нм, λ_фл=330 нм),

ЦП - спектрофотометрический метод (540 нм).

На фиг. 1 представлена динамика окислительного стресса (коэффициент К) сыворотки крови больных с отравлением бледной поганкой при средней и тяжелой степени гепатопатии. Согласно данным фиг. 1 у больных с отравлением бледной поганкой наблюдается окислительный стресс, что проявляется увеличением выше нормы значений коэффициента К (статистическая достоверность выше нормы указана знаком "*"). У больных с тяжелой степенью гепатопатии значения коэффициента К превышают норму в большей мере, чем у больных со средней степенью гепатопатии, о чем свидетельствует статистическая достоверность (обозначение знаком "**") между сравниваемыми группами больных.

На фиг. 2 представлена динамика окислительного стресса (коэффициент К) у выживших и умерших пострадавших с огнестрельными изолированными и сочетанными ранениями груди. Согласно данным фиг. 2 у пострадавших с огнестрельными ранениями груди в тяжелых случаях, приводящих к летальному исходу, окислительный стресс, оцененный по коэффициенту К, проявляется в значительно большей мере, чем у выживших больных.

На фиг. 3 представлена динамика окислительного стресса (коэффициент К) у больных инфарктом миокарда при лечении антиоксидантами. Как видно из фиг. 3 у больных инфарктом миокарда при общепринятом лечении (обозначение "ИМ") выявляется значительное увеличение коэффициента К окислительного стресса в сыворотке крови относительно нормы. Включение в комплексное лечение больных инфарктом миокарда антиоксиданта эмоксипина (обозначение "ИМ+Э") или α-токоферола (обозначение "ИМ+ТФ") уменьшает выраженность окислительного стресса, что проявляется в уменьшении значений коэффициента К на фоне антиоксидантной терапии. Эти данные свидетельствуют о ценности определения коэффициента К для контроля за эффективностью коррекции окислительного стресса у больных с инфарктом миокарда.

На фиг. 4 представлена динамика окислительного стресса (коэффициент К) у больных гипертонической болезнью с кризовым течением по церебральному варианту при лечении антиоксидантом мексидолом.

Как видно из фиг. 4, у больных гипертонической болезнью с кризовым течением наблюдается окислительный стресс, что проявляется значительным увеличением значений коэффициента К окислительного стресса по сравнению с нормой (статистическая достоверность обозначена знаком "*"). Включение антиоксиданта мексидола в комплексную терапию больных гипертонической болезнью с кризовым течением снижает выраженность окислительного стресса, о чем свидетельствует снижение значений коэффициента К (статистическая достоверность показана знаком "**") по сравнению с его значениями у больных без антиоксидантной терапии мексидолом. Обозначения "до" и "после" на фиг. 4 соответствуют значениям коэффициента К окислительного стресса до и после купирования гипертонического криза антигипертензивными препаратами.

Клинические примеры.

Пример 1. Гипертонический криз.

А. Больная П., 55 лет, и/б 20084, поступила 25.11.99г. Диагноз: гипертоническая болезнь, осложненная гипертоническим кризом по церебральному варианту. В комплексное лечение антиоксидантная терапия не включалась.

У больной при поступлении определено, что согласно используемым методикам содержание ДК составляет 1,77 (ΔD₂₃₃/мл·мг), МДА - 3,01 (нмоль/мл), СО - 0,34 (ΔD₂₃₃/ΔD₂₁₈), ТФ - 4,07 (мкг/мл·мг), ЦП - 38,6 (мг/100 мл). Нормальные значения показателей (единицы измерения те же): ДК=0,62, МДА=1,24, СO=0,54, ТФ=3,24, ЦП=31,8. Полученные значения показателей подставляем в формулу

При поступлении значение коэффициента К (2,83 усл. ед.) превышало уровень нормы (1,12 усл. ед.) в 2,5 раза.

К 7 суткам после поступления содержание ДК составляло 1,30, МДА - 3,44, СО - 0,57, ТФ - 3,46, ЦП - 44,4. Полученные значения показателей подставляем в формулу

т.е. коэффициент К возрастал до значения 4,12, а к 14 суткам содержание ДК составило 2,22, МДА - 1,81, СО - 0,79, ТФ - 3,78, ЦП -34,0. Полученные значения показателей подставляем в формулу

т.е. коэффициент К в 5,4 раза превышал норму.

Приведенная динамика значений коэффициента К свидетельствует о выраженном окислительном стрессе у больной П., которой антиоксидантная терапия не применялась.

Б. Больная М. возраст 57 лет, и/б 21041, поступила 21.11.00г. Диагноз: гипертоническая болезнь, осложненная гипертоническим кризом по церебральному варианту, В комплексное лечение со 2-х суток после поступления включался антиоксидант мексидол. При поступлении содержание ДК составляло 1,63, МДА - 2,89, СО - 0,49, ТФ - 5,70, ЦП - 29,1. Полученные значения показателей подставляем в формулу

т.е. значение коэффициента К (3,44 усл. ед.) превышало уровень нормы (1,12 усл. ед.) в 3,1 раза. После начала лечения мексидолом значение коэффициента К уменьшалось и к 14 суткам содержание ДК составляло 1,35, МДА - 1,93, СО - 0,42, ТФ - 4,40, ЦП - 34,1. Полученные значения показателей подставляем в формулу

что превышало уровень нормы только в 1,6 раза.

Приведенная динамика значений коэффициента К у больной М. свидетельствует о коррекции окислительного стресса антиоксидантом мексидолом, сопровождающейся нормализацией артериального давления.

Пример 2. Инфаркт миокарда.

А. Больной М. возраст 47 лет, и/б 11953, поступил 21.08.86 г. Выписан 26.09.86 г. Диагноз: ишемическая болезнь сердца, острый трансмуральный инфаркт миокарда переднеперегородочной области, верхушки с переходом на боковую стенку левого желудочка. В комплексном лечении антиоксидантная терапия не назначалась. При поступлении содержание ДК составляло 0,96, МДА - 1,46, СО - 1,11, ТФ - 4,49, ЦП - 37,5. Полученные значения показателей подставляем в формулу

т.е. значение коэффициента К (2,3 усл. ед.) превышало уровень нормы (1,12 усл. ед.) в 2,1 раза. В последующие сроки наблюдения коэффициент К окислительного стресса возрастал в еще большей степени и к 20 суткам после поступления содержание ДК составляло 1,42, МДА - 2,03, СО - 1,20, ТФ - 1,65, ЦП - 52,3. Полученные значения показателей подставляем в формулу

что в 8,9 раза превышало значение нормы. Высокие значения коэффициента К у больного М. отражают существенное повышение уровня окислительного стресса.

Б. Больной Е., возраст 54 года, и/б 914, поступил 15.01.87г. Выписан 13.02.87. Диагноз: крупноочаговый, трансмуральный инфаркт миокарда передней стенки левого желудочка. В комплексное лечение с 1-х суток после поступления назначалась антиоксидантная терапия эмоксипином. При поступлении содержание ДК составляло 1,28, МДА - 1,48, СО - 0,59, ТФ - 2,21, ЦП - 38,0. Полученные значения показателей подставляем в формулу

т.е. значение коэффициента К (3,30 усл. ед.) в 2,9 раза превышало значение нормы (1,12 усл. ед.). Лечение эмоксипином предупреждало повышение коэффициента К. К 20 суткам после поступления содержание ДК составляло 0,75, МДА - 1,64, СО - 0,54, ТФ - 1,73, ЦП - 42,1. Полученные значения показателей подставляем в формулу

т.е. значение коэффициента К к 20 суткам после поступления (2,28 усл. ед.) превышало норму лишь в 2,0 раза. Снижение уровня окислительного стресса, оцененное по коэффициенту К, сопровождалось улучшением клинического состояния больного Е.

Пример 3. Огнестрельные ранения груди и живота.

А. Больной Я., возраст 37 лет, и/б 8990, поступил 30.05.95г. Диагноз: множественные огнестрельные ранения грудной клетки и живота, ранение правого легкого, толстой кишки, сквозное ранение левого предплечья. Смерть 13.06.95 (на 14 день после поступления). У больного Я. при поступлении содержание ДК составляло 0,40, МДА - 2,28, СО - 0,38, ТФ - 4,38, ЦП - 14,7. Полученные значения показателей подставляем в формулу

т.е. значение коэффициента К окислительного стресса при поступлении равнялось 1,35 усл. ед. (в 1,2 раза выше нормы). К 7 суткам после поступления содержание ДК составляло 0,97, МДА - 5,32, СО - 0,32, ТФ - 1,89, ЦП - 18,6. Полученные значения показателей подставляем в формулу

т.е. коэффициент К возрастал до 11,8 усл. ед. (в 10,5 раза выше нормы), а при терминальном состоянии на 14 сутки содержание ДК составляло 2,18, МДА - 2,77, СО - 0,47, ТФ - 1,54, ЦП - 21,8. Полученные значения показателей подставляем в формулу

что в 18,8 раз выше нормы. Приведенная динамика свидетельствует о стремительном нарастании выраженности окислительного стресса у умершего больного Я.

Б. Больной И., возраст 30 лет, и/б 9698, поступил 26.06.96г. Диагноз: огнестрельное ранение брюшной полости со сквозным ранением правой доли печени. Выздоровление. Выписан 26.07.96г. При поступлении содержание ДК составляло 0,70, МДА - 2,33, СО - 0,70, ТФ - 2,60, ЦП - 30,9. Полученные значения показателей подставляем в формулу

т.е. значение коэффициента К окислительного стресса превышало уровень нормы в 3,2 раза. На 7 сутки содержание ДК составляло 0,63, МДА - 3,54, СО - 0,73, ТФ - 2,94, ЦП - 51,4. Полученные значения показателей подставляем в формулу

что в 2,4 раза выше нормы. К 14 суткам после поступления содержание ДК составляло 0,73, МДА - 3,14, СО - 0,58, ТФ - 3,15, ЦП - 58,1. Полученные значения показателей подставляем в формулу

что лишь в 1,6 раза выше нормы. Уменьшение выраженности окислительного стресса у больного И. сопровождалось улучшением клинической симптоматики.

Следовательно, коэффициент К окислительного стресса сыворотки крови является чувствительным параметром для оценки выраженности и эффективности коррекции окислительного стресса при неотложных состояниях. Коэффициент К рекомендуется включать в комплексную биохимическую оценку нарушений гомеостаза при неотложных состояниях, что позволит корригировать проводимую терапию.

ЛИТЕРАТУРА

1. Sies. Oxidative stress. - 1991, P. XV - XVI.

2. Cross C.E., Forte Т., Stocker R. et al. Oxidative stress and abnormal cholesterol metabolism in patients with abult respiratory distress syndrome. J.Lab. Clin. Med, 1990. Vol. 115, №4, P.396-404.

3. Erel O., Kocygit A., Avci S. et al. Oxidative stress and antioxidative status of plasma and erythrocytes in patients with Vivax Malaria. Clin. Biochem, 1997, Vol. 30, №8, P.631-639.

4. Lawson D.L., Chen L., Mehta J.L. Effects of exercise-induced oxidative stress on nitric oxide release and antioxidant activity. Amer. J. Cardiol, 1997, Vol. 80, P.1640-1642.

5. Muntane J., Puig-Parellada P., Mitjavila M.T. Iron metabolism and oxidative stress during acute and chronic phases of experimental infammation: Effect of iron-dextran and deferoxamine. J.Lab. Clin. Med, 1995, Vol. 126, №5, P.435-443.

6. Paolisso G., Gambardella A., Tagliamonte M.R. et al. Does free fatty acid infusion impair insulin action also through an increase in oxidative stress? J. Clin. Endocrinol. Metab, 1996, Vol. 81, №12, P.4244-4248.

7. Turi S., Nemeth I., Torkos A. et al. Oxidative stress and antioxidant defense mechanism in glomerular diseases. J Free Radic Biol Med, 1997, Vol. 22, №1-2, P.161-168.

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано в клинической биохимии для определения выраженности окислительного стресса и контроля за эффективностью его коррекции при неотложных состояниях. Сущность изобретения состоит в определении показателей свободнорадикальных реакций (диеновых конъюгатов, малонового диальдегида, степени окисленности общих липидов) и уровня эндогенных антиоксидантов (α-токоферола, церулоплазмина) с последующим вычислением интегрального показателя (К), при этом увеличение К более 1,12 свидетельствует об усилении окислительного стресса. Техническим результатом является повышение точности и чувствительности способа. 4 ил.

Способ оценки окислительного стресса при неотложных состояниях, включающий определение в сыворотке крови показателей свободнорадикальных реакций и антиоксидантной системы, отличающийся тем, что проводят интегральную оценку окислительного стресса по значению коэффициента окислительного стресса (К), определяемому по формуле

где ДКi - содержание диеновых конъюгатов в сыворотке крови больного;

МДАi - содержание малонового диальдегида в сыворотке крови больного;

COi - степень окисленности общих липидов сыворотки крови больного;

ТФi - содержание α-токоферола в сыворотке крови больного;

ЦПi - содержание церулоплазмина в сыворотке крови больного;

ДКn - содержание диеновых конъюгатов в норме;

МДАn - содержание малонового диальдегида в норме;

СОn - степень окисленности общих липидов в норме;

ТФn - содержание α-токоферола в норме;

ЦПn - содержание церулоплазмина в норме,

и значение коэффициента К, превышающее 1,12 свидетельствует об усилении окислительного стресса и преобладании прооксидантных процессов над антиоксидантными.