СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СТРЕССА ОРГАНИЗМА ЧЕЛОВЕКА Российский патент 2004 года по МПК G01N33/48 

Предлагаемое изобретение относится к медицине и может быть использовано при диагностике и лечении различных заболеваний, сопровождающихся окислительным стрессом.

Окислительный стресс является распространенным патобиохимическим состоянием, широко встречающимся при различных экстремальных физиологических и патологических состояниях [Кулинский В.И. //Соросовский образовательный журнал, 1999, №1, с. 2-8]. Развитие окислительного стресса обусловлено дефицитом или несостоятельностью антиоксидантных факторов и/или избытком прооксидантных факторов, что проявляется дисбалансом анти-/прооксидантных систем [Е.Е.Дубинина, С.О.Бурмистров, Д.А.Ходов, И.Г.Поротое //Вопросы медицинской химии, 1995, №1, с. 24-26, Dean R.T., Hunt I.V., Grant A.J. et al. //Free Radical Biol. Med., 1991, v. 11, № 12, p. 161-165]. Окислительный стресс является причиной развития мембранных патологий обратимого или необратимого характера, что зависит от интенсивности повреждающих факторов и длительности окислительной нагрузки на организм [Ю.А.Владимиров. //Соросовский образовательный журнал, 2000, №12, с. 13-19]. Диагностика окислительного стресса и мониторинг эффективности антиоксидантной терапии, направленной на купирование его основных проявлений, требуют четко обоснованных критериев, разграничивающих повышенную напряженность антиоксидантных систем организма и сформировавшийся окислительный стресс.

Известен способ выявления дисбаланса системы анти-/прооксиданты (окислительного стресса) - “Антиоксидантный индекс эритроцитов” [Мальцев Г.Ю., Васильев А.В. //Вопросы питания, 1999, №2, с. 41-43], основанный на определении активности супероксиддисмутазы, каталазы, глутатионредуктазы и глутатионпероксидазы как показателей антиоксидантной системы и уровня диеновых конъюгатов (ДК) и малонового диальдегида (МДА) как показателей прооксидантной системы, с последующим вычислением разности между компонентами антиоксидантной системы и прооксидантными показателями с использованием нормирующих коэффициентов при расчете.

Ход определения: активность СОД эритроцитов определяют на основе метода М. Niashikimi и соавт. в модификации Г.Ю.Мальцева, А.В.Васильева [Niashikimi М., Rao N.A., Jagi К. Biochem Biophys Res Commun, 1972; 46: 849-854., Мальцев Г.Ю., Васильев А.В. Способ определения активности каталазы и супероксиддисмутазы эритроцитов на анализаторе открытого типа. Вопросы медицинской химии, 1994, № 2, с. 56-58.]; активность каталазы - в модификации Г.Ю.Мальцева, А.В.Васильева [Мальцев Г.Ю., Васильев А.В. Способ определения активности каталазы и супероксиддисмутазы эритроцитов на анализаторе открытого типа./Вопросы медицинской химии, 1994, № 2, с. 56-58] методом Oshino и соавт. [Oshino N., Chance В. Arch Niochem 1973; 154: 117-131.]; активность глутатионпероксидазы и глутатионредуктазы - на основе метода G. Мillе [Мille G. The purification and properties of glutatione peroxidase of erythrocytes. J Biol Chem 1959; 244: 502-506.] и J.Tilbotson и соавт. [Tilbotsen J.A., Sauberlich H.S. J Nutrition 1971; 101: 1459.] соответственно. Все ферментные методы были адаптированы для полуавтоматического анализатора открытого типа ФП-901 фирмы "Лабсистемс" (Финляндия).

Содержание МДА в эритроцитах оценивают на основе метода L.Emster и соавт. [Emster L., Nordenbrandt К. In "Methods in Enzymology" Estabrook R.W., Pullman M.E., eds. 1967; 10: 575.], ДК в эритроцитах - методом Z.Placer [Placer Z. Nahrung 1968; 12: 679.] в модификации Ю.А.Владимирова и соавт. [Владимиров Ю.А., Арчаков А.И. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. - М.: Наука, 1972, с. 237-238.].

Антиоксидантный индекс эритроцитов рассчитывают по формуле

АОИ=k₁(COД)+k₂(Каталаза)+k₃(ГП)+k₄(ГР)-k₅(MДAэp.)-k₆(ДКэр.),

где АОИ - антиоксидантный индекс, в скобках - абсолютные значения параметров; k₁...k₆ - нормирующие, или взвешивающие, коэффициенты, которые представляют собой обратные величины 1/Х; Х - среднее абсолютное значение параметра в контрольной клинической группе или в группе добровольцев.

Результаты оценивают следующим образом: среднестатистическая величина АОИ, полученная в контрольной группе, будет равна 2; состояние, при котором значения АОИ меньше 2, рассматривают как окислительный стресс.

Недостатки:

а) использование в способе “Антиоксидантный индекс” результатов исследования активности ферментов приводит к снижению его достоверности и затрудняет трактовку данного коэффициента, что связано с широкой вариабельностью изменения их активности как в сторону повышения, так и в сторону понижения, даже в условиях одной патологии;

б) значительная трудоемкость в сочетании с недостаточно высокой чувствительностью и специфичностью существующих методов определения активности ферментов, используемых в способе “Антиоксидантный индекс”, а также многообразие подходов, используемых в различных лабораториях, что может затруднять трактовку полученных результатов;

в) при расчете антиоксидантного индекса происходит оперирование несравнимыми с точки зрения размерности физических величин [величина активности ферментов (индекс ферментной защиты)] и химической кинетики реакций [количество продуктов других, преимущественно неферментативных реакций (индекс уровня продуктов ПОЛ)], что повышает вероятность получения недостаточно объективных или неверных результатов при использовании данного способа.

За прототип нами принят способ выявления дисбаланса системы анти-/прооксиданты (окислительного стресса) “Антиоксидантный коэффициент (АОК) эритроцитов” [Ф.А.Тугушева, А.И.Куликова, И.М.Зубина //Вопросы медицинской химии, 1993, т. 39, №3, с. 18-21], основанный на определении уровня токоферола, общих и небелковых SH-групп как показателей антиоксидантной системы эритроцита и малонового диальдегида (МДА) как показателя уровня продуктов ПОЛ эритроцита, с последующим делением антиоксидантных показателей на прооксидантные.

Объектом исследования служила свежевыпущенная кровь (эритроцитарная взвесь) здоровых и больных людей. Об интенсивности ПОЛ судят по уровню МДА, который определяют с помощью стандартной методики [Романова Л.А., Стальная И.Д. //Современные методы в биохимии. - М., 1977, с. 64-66]. Антиоксидантный потенциал оценивают по содержанию токоферолоподобных веществ (ТФ), общих и небелковых сульфгидрильных групп. ТФ определяют спектрофотометрически, взяв за основу стандартную методику [Рудакова-Жилина Н.К., Матюхова Н.П. //Лаб. дело, 1982, №1, с. 19-22] и несколько модифицировав ее применительно к плазме и эритроцитарной взвеси. Содержание сульфгидрильных групп (SH-групп) определяют методом [Sedlak/Lindsay R.Н. //Analyt. Biochem, 1968, v. 25, № 1-3, p. 192-205].

Расчет проводят по формуле

АОКэр.=(ТФ+общие SH-гр.+небелковые SH-гр.)/МДА.

Чем ниже было значение АОКэр. по сравнению с показателями донорской группы, принятой за 100%, тем более выраженным считают дисбаланс (окислительный стресс) в системе анти-/прооксиданты организма.

Недостатки:

а) из прооксидантных показателей учитывают только узкоспецифичный конечный продукт пероксидации липидов - МДА, что приводит к снижению достоверности данного метода;

б) отсутствует учет промежуточных продуктов окислительной модификации биологических молекул как липидной (диеновые конъюгаты и т.п.), так и другой природы (белковой, нуклеотидной, углеводной), что снижает чувствительность данного метода и приводит к неверному отражению уровня имеющегося окислительного стресса, а следовательно, неадекватному назначению терапии, направленной на его устранение;

в) используемые для расчета антиоксидантного коэффициента эритроцитов величины (токоферол и SH-группы) имеют неодинаковую размерность; подвергнуты некорректной обработке (суммирование показателей, значимость которых в составе антиоксидантной системы (АОС) несоизмерима: SH-группы - это обязательный и ключевой компонент АОС, а токоферол является одним из целого ряда липофильных антиоксидантов, регенерация которого, в свою очередь, зависит от SH-групп), что снижает достоверность полученных данных при оценке окислительного стресса у больного;

г) концентрация токоферола в тканях и биологических жидкостях организма определяется множеством разнообразных факторов, зачастую не связанных с наличием окислительного стресса (алиментарные, конституциональные, половые, возрастные, генетические и т.д.), а следовательно изменения его не всегда отражают дисбаланс в системе анти-/прооксиданты, что может приводит к несвоевременной диагностике окислительного стресса и/или назначению неадекватной антиоксидантной терапии при лечении больного.

Задача - создание достоверного, однозначно трактуемого способа комплексной оценки окислительного стресса с помощью коэффициента окислительной модификации биомолекул эритроцитов (КОМБэр.), основанного на использовании минимального количества дополнительных специальных лабораторных методов диагностики, позволяющего определять выраженность окислительного стресса, своевременно назначать антиоксидантную терапию в необходимом объеме и контролировать ее эффективность в процессе лечения; с последующей проверкой в практической медицине вышеизложенных предложений при диагностике и лечении окислительного стресса.

Сущностью изобретения является то, что в гемолизате определяют уровень тиоловых групп, по разнице между показателем среднего количества тиоловых групп гемолизата практически здоровых людей, равного 0,174± 0,004 оптических единиц, и количеством тиоловых групп гемолизата обследуемого человека определяют количество дисульфидных групп и при значении этой разницы, равной 0,000± 0,008 оптических единиц, определяют отсутствие окислительного стресса, а при положительном значении этой разницы дополнительно определяют количество промежуточных и минорных продуктов окислительной модификации биомолекул: белков, липидов, углеводов, нуклеиновых кислот, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой, дополнительно определяют количество продуктов окислительной модификации биомолекул после предварительной химической индукции Fе²⁺ процессов перекисного окисления по формуле

КОМБэр.=(ТБЧэр.+ТБЧэр. Ind)· (Е_д-sh-гр.-E_i-sh-гр.)· 100,

где КОМБэр. - коэффициент окислительной модификации биомолекул эритроцитов в окислительных единицах активности, ОЕА,

ТБЧэр. - количество в эритроцитах промежуточных и минорных продуктов окислительной модификации биомолекул: белков, липидов, углеводов, нуклеиновых кислот, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой, в оптических единицах, ОЕ,

ТБЧэр. Ind - количество в эритроцитах промежуточных и минорных продуктов окислительной модификации биомолекул: белков, липидов, углеводов, нуклеиновых кислот, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой, индуцированных Fe²⁺, оптические единицы, ОЕ,

Е_д-sh-гр. - показатель среднего количества тиоловых групп гемолизата у практически здоровых людей, выраженный в оптических единицах, ОЕ, равный 0,174±0,004 ОЕ,

E_i-sh-гр. - количество тиоловых групп гемолизата обследуемого человека, выраженное в оптических единицах, ОЕ,

100 - расчетный коэффициент,

определяют коэффициент окислительной модификации биомолекул эритроцитов, и чем выше положительное значение КОМБэр., тем выше уровень окислительного стресса организма.

Технической сущностью предложения является:

1) комплексная оценка состояния как прооксидантного, так и антиоксидантного звена одновременно, с использованием минимально необходимого количества показателей, что позволит уменьшить количество расходного материала, сократит время, необходимое для проведения анализа,

2) использование эритроцитов для определения выраженности дисбаланса анти-/прооксидантных систем, как показателя отражающего формирование окислительного стресса на клеточном уровне, что позволяет более достоверно оценивать состояние этих систем для организма человека в целом,

3) оценка окислительного стресса базируется на количественном определении всех продуктов окислительной модификации различной природы (липидной, белковой, нуклеотидной, углеводной), которые являются составными компонентами мембран и субклеточных структур, что позволит правильно оценить выраженность сформировавшегося окислительного стресса у больного,

4) исследуются универсальные показатели окислительного стресса, имеющие однозначную трактовку при его оценке, а также применяется приоритетный подход в дифференцированной оценке вклада каждой из составляющих уравнения в получаемый результат при расчете интегрального коэффициента окислительной модификации биомолекул (ведущее значение имеет значение нарастания количества окисленных тиоловых групп (-S-S-) с учетом повышения ТБЧэр. и ТБЧэр. Ind как продуктов окислительного стресса), что повысит достоверность применяемого метода, уменьшит количество неверных (в том числе ложноотрицательных) результатов,

5) исследование процессов пероксидации, основанное на определении как исходного количества окисленно-модифицированных продуктов, так и их прирост при индукции перекисного окисления химическими прооксидантами (Fe²⁺), позволит оценивать глубину повреждения защитных механизмов от окислительного стресса на клеточном уровне, рассчитать объем необходимой антиоксидантной терапии.

Способ осуществляют следующим образом.

Для диагностики окислительного стресса организма человека используют коэффициент окислительной модификации биомолекул эритроцитов (КОМБэр.). Объектом исследования служила кровь обследуемых людей, стабилизированная антикоагулянтами.

Количество SH-групп измеряют по методу [Романчук Л.А., Рубина X.М. Спектрофотометрический метод определения сульфгидрильных групп крови. //Вопр. мед. химии, 1961, вып.6, с. 652]. Определение основано на том, что парахлормеркурийбензоат образует со свободными сульфгидрильными группами меркаптидный комплекс. Полученный меркаптид обладает специфическим поглощением при длине волны 255 нм, что позволяет определять количество SH-групп в белках и пептидах. Реакционную смесь инкубируют в течение 15 мин при комнатной температуре и определяют оптическую плотность раствора на спектрофотометре при длине волны 255 нм. После определения уровня тиоловых групп находят разницу между показателем среднего количества тиоловых (-SH) групп гемолизата практически здоровых людей (63 практически здоровых человека, Е_д-sh-гр.=0,174± 0,004 ОЕ, получаемые данные обработаны в соответствии с принятыми методами вариационной статистики) и количеством тиоловых (-SH) групп гемолизата обследуемого человека и, таким образом, определяют количество окисленных тиоловых или дисульфидных групп (-S-S-).

Прооксидантную активность эритроцитов оценивают с использованием теста с тиобарбитуровой кислотой (ТБК) по количеству продуктов окислительной модификации биомолекул, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой (ТБК-активных продуктов), использовав основные принципы двух методов [В.Н.Ушкалова, Н.В.Иоанидис, Г.Д.Кадочникова, З.М.Деева /Контроль перекисного окисления липидов. Новосибирск. 1993; Современные методы в биохимии /Под ред. В.Н.Ореховича. М.: Медицина, 1977]. Данный подход позволяет определять не только перекисные продукты липидного происхождения, но и продукты окислительной модификации других биомолекул белкового, нуклеотидного, углеводного происхождения, реагирующие с ТБК, с образованием окрашенных продуктов реакции, которые можно определять спектрофотометрическими методами.

Количество эритроцитов в цельной крови определяют фотоколориметрически по методу Ресселя [Рессель Л.К., Тодоров И. Клинические лабораторные исследования в педиатрии. - София, 1961, с. 259]. Для этого эритроциты вносят в раствор Гоуэрса, где они приобретают сферическую форму. Оптическую плотность взвеси измеряют при красном светофильтре (λ =610 нм), при этом процент задержанного света пропорционален количеству эритроцитов.

Ход определения.

В пробирку с 10 мл реактива Гоуэрса вносят 0,02 мл крови, тщательно перемешивают и определяют с помощью фотоэлектроколориметрии (ФЭК-56М) или микрофотоколориметра экстинкцию полученной взвеси при красном светофильтре и толщине кюветы 2 мм. Контролем служит раствор Гоуэрса. Количество эритроцитов в мл пробы крови рассчитывают по формуле, используя коэффициент пересчета, найденный по калибровочному графику, построенному с использованием камеры Горяева.

Эритроциты/мл=26,00· Е· 10⁹.

Для определения количества продуктов окислительной модификации биомолекул (ОМБ) эритроцитов необходимо использовать стандартное количество эритроцитов (≈ 5 млрд). Для этого отбирают в центрифужную пробирку цельную гепаринизированную кровь объемом, рассчитываемым по формуле: Vэр.=(5· 10⁹×^{1)/X, где Vэр. - требуемый объем цельной крови, мл; Х - количество эритроцитов исследуемой крови, млрд; 1 - стандартный коэффициент, мл. После чего кровь центрифугируют при 1500 об/мин в течение 10 мин, затем отбирают плазму. Оставшуюся эритроцитарную массу перемешивают и инкубируют 90 мин в условиях жесткого окисления в термостате (t=37° С, с доступом О₂ воздуха). После инкубации к реакционной смеси прибавляют 1 мл 28% раствора трихлоруксусной кислоты (ТХУК), перемешивают и центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 мин. Завершив центрифугирование, супернатант переносят количественно в большую пробирку, в которую добавляют 1 мл 1% раствора ТБК. Полученный раствор термостатируют на кипящей водяной бане 15 мин, охлаждают пробирки в холодной воде и определяют оптическую плотность раствора на SF-46, λ =450 и 532 нм (где длина волны 450 нм соответствует максимуму оптической плотности промежуточных продуктов перекисного окисления -диеновые конъюгаты и др., а длина волны 532 нм - максимуму оптической плотности конечных продуктов перекисного окисления - малоновый диальдегид и др.). Тиобарбитуровое число эритроцитов (ТБЧэр.) рассчитывают по формуле}

ТБЧэр.=Iэр.-450+Iэр.-532 ОE,

где Iэр. - оптическая плотность раствора, измеренная при длине волны 450 и 532 нм, оптические единицы.

Для определения количества продуктов 0МБ эритроцитов после предварительной химической индукции Fe²⁺ необходимо использовать стандартное количество эритроцитов (≈ 5 млрд). Для этого отбирают в центрифужную пробирку цельную гепаринизированную кровь объемом, рассчитываемым по формуле: Vэр.=(5· 10⁹×^{1)/X, где Vэр. - требуемый объем цельной крови, мл; Х - количество эритроцитов исследуемой крови, млрд; 1 - стандартный коэффициент, мл. Затем кровь центрифугируют при 1500 об/мин в течение 10 мин, после чего отбирают плазму. К оставшейся эритроцитарной массе добавляют 200 мкл 10% раствора FeSO₄ для индукции перекисного окисления, перемешивают и инкубируют 90 мин в условиях жесткого окисления в термостате (t=37° С, с доступом O₂ воздуха). После инкубации к реакционной смеси прибавляют 1 мл 28% раствора ТХУК, перемешивают и центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 мин. Завершив центрифугирование, супернатант переносят количественно в большую пробирку, в которую добавляют 1 мл 1% раствора ТБК. Полученный раствор термостатируют на кипящей водяной бане 15 мин. После этого охлаждают пробирки в холодной воде и определяют оптическую плотность раствора на SF-46, λ =450 и 532 нм (где длина волны 450 нм соответствует максимуму оптической плотности промежуточных продуктов перекисного окисления - диеновые конъюгаты и др., а длина волны 532 нм - максимуму оптической плотности конечных продуктов перекисного окисления - малоновый диальдегид и др.). Тиобарбитуровое число эритроцитов после индукции перекисного окисления (ТБЧэр. Ind) рассчитывают по формуле}

ТБЧэр. Ind=Iэр. Ind-450+Iэр. Ind-532 OE,

где Iэр. Ind - оптическая плотность раствора, в котором проводилась предварительная химическая индукция перекисного окисления Fe²⁺, измеренная при длине волны 450 и 532 нм, оптические единицы.

Особенность исследования заключается в определении базального количества продуктов ОМБ эритроцитов (отражающих интенсивность течения свободнорадикальных процессов (СРП) у больных на данном этапе заболевания) и их количества после определенным образам проведенной индукции перекисного окисления (показатель возможного прироста этих продуктов при воздействии на организм дополнительных инициаторов СРП эндогенной и экзогенного природы). Антиоксидантный резерв эритроцитов исследуют по количеству накопившихся в них продуктов ОМБ после инициации процессов перекисного окисления добавлением к полученной эритроцитарной массе раствора сульфата железа (II) с последующей инкубацией получаемой смеси в течение 90 мин в условиях жесткого окисления (при температуре 37° С, с доступом кислорода воздуха). Гептанизопропиловая экстракция (согласно классической методике) не проводится, что позволяет оценить не только процессы перекисного окисления липидов, но и интенсивность окислительной модификации других биосубстратов, в частности белков и нуклеиновых кислот, продукты деградации которых образуются и накапливаются в опытном растворе при инкубации с химическими индукторами пероксидации и могут вступать в реакцию с ТБК, образуя окрашенные соединения. Измерения экстинкции растворов, содержащих продукты, реагирующие с ТБК, производят при длинах волн 532 и 450 нм с целью определения как промежуточных продуктов ОМБ (λ =450 нм), так и минорных производных (λ =532 нм), преимущественно продуктов липопероксидации.

Коэффициент окислительной модификации биомолекул эритроцитов рассчитывают по формуле

КОМБэр.=(ТБЧэр.+ИБЧэр. Ind)· (Е_д-sh-гр.-E_i-sh-гр.)· 100,

где КОМБэр. - коэффициент окислительной модификации биомолекул эритроцитов в окислительных единицах активности, ОЕА,

ТБЧэр. - количество в эритроцитах промежуточных и минорных продуктов окислительной модификации биомолекул: белков, липидов, углеводов, нуклеиновых кислот, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой, оптические единицы, ОЕ,

ТБЧэр. Ind - количество в эритроцитах промежуточных и минорных продуктов окислительной модификации биомолекул: белков, липидов, углеводов, нуклеиновых кислот, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой, индуцированных Fe²⁺ в оптических единицах, ОЕ,

Е_д-sh-гр. - показатель среднего количества тиоловых групп гемолизата у практически здоровых людей, выраженный в оптических единицах, ОE, равный 0,174±0,004 ОЕ,

E_i-sh-гр. - количество тиоловых групп гемолизата обследуемого человека, выраженное в оптических единицах, ОЕ,

100 - расчетный коэффициент.

Полученные результаты трактуют следующим образом:

1) Рассчитанный интегральный КОМБэр. является отрицательным числом меньше минус единицы (КОМБэр.<-1,0 ОЕА) - вероятно выявлен больной с гомоцистеинемией, теоретически возможно при нерациональном и длительном использовании инфузий с тиосодержащих препаратов (унитиол, липоевая кислота и др.).

2) Рассчитанный интегральный КОМБэр. равен нулю или находится в интервале от -1,0 до +1,0 (КОМБэр.=0± 1,0 ОЕА) - данный показатель характерен для практически здоровых людей в условиях баланса в системе анти-/прооксиданты, что определяет отсутствие окислительного стресса.

3) Рассчитанный интегральный КОМБэр. является положительным числом больше единицы (КОМБэр.>1,0 ОЕА) - у обследуемого человека имеется сформировавшийся окислительный стресс различной интенсивности.

4) Рассчитанный интегральный КОМБэр. имеет пределы нарастания при положительных (КОМБэр.>>0,0 ОЕА) значениях, что связано как с полной истощаемостью субстратов окисления, особенно при отсутствии регенерирующих систем или низкой их активности, так и с необратимостью деструктивных процессов, связанных с явлениями гиперкатаболизма, прежде всего денатурацией белковых структур.

Обоснование достигнутых результатов.

В качестве объекта исследования дисбаланса про-/антиоксидантных систем (окислительного стресса) на клеточном уровне нами были выбраны эритроциты, учитывая их способность гибко изменять свой обмен при меняющихся условиях жизнедеятельности и важную роль в формировании компенсаторно-адаптивных реакций организма. Изложенные факты позволяют рассматривать клетки крови как информативный объект оценки состояния биохимических механизмов адаптации и определения чувствительности организма к проводимой терапии на клеточном уровне.

Эритроцитарное звено первым реагирует на повышение активности свободнорадикального окисления и первым исчерпывает свои компенсаторные возможности [Е.В.Ройтман, И.И.Дементьева, О.А.Азизова и др. //Клиническая лабораторная диагностика, 2001, №3, с. 42-43].

Проводя анализ литературных данных [В.В.Костюшов //Патологическая физиология и экспериментальная терапия, 2002, №1, с. 20-23] и с учетом собственных результатов исследований на большой группе больных (n>300 человек) с различной патологией (ожоговая болезнь, почечная патология, эндокринная патология, отравления), нами сделан вывод об исключительной роли тиолового звена в диагностике окислительного стресса, так как этот показатель изменяется однонаправлено в сторону понижения количества SH-групп (восстановленных тиоловых, сульфгидрильных) при большинстве тяжелых патологических состояний (за исключением некоторой наследственной патологии, сопровождающейся накоплением в крови тиолсодержащих компонентов), для которых характерно развитие окислительного стресса. Дефицит SH-групп, как правило, сопровождается избыточной продукцией продуктов свободнорадикального окисления, большая часть которых относится к продуктам, реагирующим с тиобарбитуровой кислотой (ТБК). Таким образом, существует тесная взаимосвязь между снижением количества эритроцитарных SH-групп и избыточной продукцией прооксидантных факторов, которая и была положена в основу разработанного нами интегрального показателя окислительного стресса - коэффициента окислительной модификации биомолекул эритроцитов (КОМБэр.).

Проведены исследования состояния про-/антиоксидантных систем у различных категорий больных (n>300 чел.). Так у ожеговых больных с индексом Франка I (меньше 30) количество тиоловых SH-групп гемолизата было понижено в среднем на 23,3%, у больных с индексом Франка II (30-60) - на 39,3%, с индексом Франка III (61-120) - на 63,2%, у больных сахарным диабетом 1 типа - на 27,6%, у больных с сахарным диабетом 2 типа - на 22,3%, у больных сахарным диабетом с кетоацидозом - на 33,4%, у больных хронической почечной недостаточностью (ХПН) I-II (предтерминальная) - на 16,5%, у больных с ХПН III (терминальная, по классификации С.И.Рябова и Б.Б.Бондаренко, 1975 г.) - на 47,0%, у больных с острой почечной недостаточностью (ОПН) - на 46,0% по сравнению с контрольной группой практически здоровых людей (n=63 человека): Е_д-sh-гр.=0,174± 0,004(X± m) ОE. Повышение количества дисульфидных групп (-S-S-), превышающее удвоенное значение стандартной ошибки средней арифметической (2m) количества SH-групп у практически здоровых людей (патологическое количество -S-S->2m>2× 0,004 ОE>0,008 ОE), т.е. более 0,008 ОE, трактуется как окислительный стресс.

При этом средние значения интегрального коэффициента окислительной модификации биомолекул эритроцитов для каждой из обследованных категорий больных составили: у ожоговых больных с индексом Франка I КОМБэр.=5,8 ОEА; у больных с индексом Франка II КОМБэр.=9,8 ОEА; с индексом Франка III КОМБэр.=16,3 ОEА; у больных с сахарным диабетом 1 типа КОМБэр.=6,0 ОEА; у больных с сахарным диабетом 2 типа КОМБэр.=4,8 ОЕА; у больных сахарным диабетом с кетоацидозом КОМБэр.=7,2 ОЕА: у больных ХПН I-II (предтерминальная) КОМБэр.=4,0 ОЕА; у больных с ХПН III (терминальная) КОМБэр.=9,3 ОЕА; у больных с ОПН КОМБэр.=8,5 ОЕА по сравнению с контрольной группой (у практически здоровых людей КОМБэр.=0,0± 1,0 ОЕА).

Пример №1. В эндокринологическое отделение Краснодарского муниципального лечебно-диагностического объединения (КМЛДО, 2-ая Городская больница) в феврале 2001 года поступила больная Чегаева Л.П., возраст 53 года. Диагноз: сахарный диабет 2 типа, инсулинпотребный, тяжелая форма. Стаж заболевания составлял 9 лет. Проведено обследование с целью диагностирования возможного наличия окислительного стресса. Количество тиоловых групп (SH-групп) было снижено на 56,3% (по сравнению со средним показателем уровня тиоловых групп контрольной группы: Е_д-sh-гр.=0,174±0,004 ОЕ) и составило: E_i-sh-гр.=0,076 ОЕ. Количество базальных и индуцированных добавлением Fe²⁺ продуктов окислительной модификации биомолекул эритроцитов было повышено на 23,3% (по сравнению со средним показателем базальных и индуцированных добавлением Fe²⁺ продуктов окислительной модификации биомолекул эритроцитов контрольной группы) и составило: ТБЧэр.=0,489 ОЕ, ТБЧэр. Ind=0,623 ОЕ.

КОМБэр.=(0,489 ОЕ+0,623 ОЕ)· (0,174 ОЕ-0,076 ОЕ)· 100=10,9 ОЕА, что определяли как резко выраженный окислительный стресс.

Было проведено лечение в течение двух недель, в том числе с применением антиоксидантных препаратов (прежде всего липоевой кислоты в стандартной дозировке). Количество тиоловых групп (SH-групп) увеличилось по сравнению с показателями при поступлении (до лечения), но все равно отличалось от показателей контрольной группы и было снижено на 39,7% (по сравнению со средним показателем уровня тиоловых групп контрольной группы) и составило: E_i-sh-гр.=0,105 ОЕ. Количество базальных и индуцированных добавлением Fe²⁺ продуктов окислительной модификации биомолекул эритроцитов после проведенного лечения не было повышено (по сравнению со средним показателем базальных и индуцированных добавлением Fe²⁺ продуктов окислительной модификации биомолекул эритроцитов контрольной группы) и составило: ТБЧэр.=0,288 ОЕ, ТБЧэр. Ind=0,453 ОE.

КОМБэр.=(0,288 ОЕ+0,453 ОЕ)· (0,174 ОЕ-0,105 ОЕ)· 100=5,1 ОЕА, что определяли как значительное снижение (в 2,1 раза) явлений окислительного стресса на фоне проводимого лечения по сравнению с показателями при поступлении (до назначения антиоксидантной терапии).

Пример №2. В эндокринологическое отделение Краснодарского муниципального лечебно-диагностического объединения (КМЛДО, 2-ая Городская больница) в марте 2001 года поступил больной Гельварг П.В., возраст 61 год. Диагноз: сахарный диабет 2 типа, тяжелая форма. Стаж болезни 8 лет. Проведено обследование с целью диагностирования возможного наличия окислительного стресса. Количество тиоловых групп (SH-групп) было снижено на 65,5% (по сравнению со средним показателем уровня тиоловых групп контрольной группы: Е_д-sh-гр.=0,174±0,004 ОЕ) и составило: E_i-sh-гр.=0,060 ОЕ. Количество базальных и индуцированных добавлением Fe²⁺ продуктов окислительной модификации биомолекул эритроцитов при поступлении не было повышено (по сравнению со средним показателем базальных и индуцированных добавлением Fe²⁺ продуктов окислительной модификации биомолекул эритроцитов контрольной группы) и составило: ТБЧэр.=0,290 ОЕ, ТБЧэр. Ind=0,572 ОЕ.

КОМБэр.=(0,290 ОЕ+0,572 ОЕ)· (0,174 ОЕ-0,060 ОЕ)· 100=9,8 ОЕА, что определяли как выраженный окислительный стресс.

Было проведено лечение в течение двух недель, в том числе с применением антиоксидантных препаратов (прежде всего липоевой кислоты в стандартной дозировке). Количество тиоловых групп (SH-групп) после проведения лечения антиоксидантными препаратами вернулось к норме по сравнению со средними показателями уровня тиоловых групп контрольной группы: E_i-sh-гр.=0,181 ОЕ. Количество базальных и индуцированных добавлением Fe²⁺ продуктов окислительной модификации биомолекул эритроцитов после проведенного лечения не отличалось от средних показателей базальных и индуцированных добавлением Fe²⁺ продуктов окислительной модификации биомолекул эритроцитов контрольной группы: ТБЧэр.=0,328 ОЕ, ТБЧэр. Ind=0,542 ОЕ.

КОМБэр.=(0,328 ОЕ+0,542 ОЕ)· (0,174 ОЕ-0,181 ОЕ)· 100=-0,61 ОЕА, что определяли как полное купирование окислительного стресса у данного больного на фоне проводимой терапии (в том числе препаратами с антиоксидантной активностью).

Данное изобретение позволяет:

1. Оценить баланс прооксидантно-антиоксидантных систем эритроцитов как косвенного показателя, отражающего наличие окислительного стресса на клеточном уровне человеческого организма, и выявить наличие окислительного стресса в организме человека, что позволит своевременно провести адекватные мероприятия по его устранению, назначив необходимые препараты с антиоксидантными свойствами в соответствующих дозировках.

2. Провести оценку резерва антиоксидантных систем эритроцитов в условиях моделируемого окислительного стресса in vitro при индуцировании перекисного окисления, что при наличии достаточно низкого показателя коэффициента окислительной модификации биомолекул позволит сократить дозировки используемых препаратов с антиоксидантной активностью, уменьшая тем самым количество возможных побочных эффектов, с разной частотой встречающихся при применение различных препаратов, особенно в избыточных дозировках и при отсутствии необходимых показаний, а также снизить расходы на лечение окислительного стресса.

3. Позволяет разработать индивидуальные критерии к назначению антиоксидантной терапии у различных категорий больных, а также оценивать ее эффективность в процессе лечения с целью проведения коррекции в случае необходимости.

Практическим результатом предложения является своевременное выявление окислительного стресса у обследуемых больных, его стадии и интенсивности, что позволяет назначать эффективную антиоксидантную терапию, сократить время пребывания больных в стационарах, ограничить количество медикаментов, необходимых для лечения каждого больного, за счет коррекции патологического процесса на клеточном и субклеточном уровнях.

Изобретение относится к медицине и может быть использовано при диагностике и лечении заболеваний, сопровождающихся окислительным стрессом. В гемолизате определяют уровень тиоловых групп. По разнице между показателями среднего количества тиоловых групп гемолизата практически здоровых людей, равного 0,174±0,004 оптических единиц, и количеством тиоловых групп гемолизата обследуемого человека определяют количество дисульфидных групп. При значении этой разницы, равной 0,000±0,008 оптических единиц, определяют отсутствие окислительного стресса. При положительном значении этой разницы дополнительно определяют количество промежуточных и минорных продуктов окислительной модификации биомолекул: белков, липидов, углеводов, нуклеиновых кислот, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой. Дополнительно определяют количество продуктов модификации биомолекул после предварительной химической индукции Fe²⁺ процессов^{перекисного окисления. Определяют коэффициент окислительной модификации биомолекул эритротроцитов по формуле КОМБэр.=(ТБЧэр.+ТБЧэр.Ind)·(Е_д-sh-гр.-E_i-sh-гр.)·100, где КОМБэр. - коэффициент окислительной модификации биомолекул эритроцитов в окислительных единицах активности, ОЕА, ТБЧэр. - количество в эритроцитах промежуточных и минорных продуктов окислительной модификации биомолекул: белков, липидов, углеводов, нуклеиновых кислот, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой, в оптических единицах, ОЕ, ТБЧэр.Ind - количество в эритроцитах промежуточных и минорных продуктов окислительной модификации биомолекул: белков, липидов, углеводов, нуклеиновых кислот, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой, индуцированных Fe2+, в оптических единицах, ОЕ, Е_д-sh-гр. - показатель среднего количества тиоловых групп гемолизата у практически здоровых людей, выраженный в оптических единицах, ОЕ, равный 0,174±0,004 ОЕ, E_i-sh-гр. - количество тиоловых групп гемолизата обследуемого человека, выраженное в оптических единицах, ОЕ, 100 - расчетный коэффициент. Чем выше положительное значение КОМБэр., тем выше уровень окислительного стресса организма. Способ позволяет упростить и повысить точность диагностики.}

Способ диагностики окислительного стресса организма, включающий определение уровня белковых и небелковых серосодержащих компонентов анти/прооксидантной системы организма и малонового альдегида, отличающийся тем, что в гемолизате определяют уровень тиоловых групп, по разнице между показателями среднего количества тиоловых групп гемолизата практически здоровых людей, равного 0,174±0,004 оптической единицы, и количеством тиоловых групп гемолизата обследуемого человека определяют количество дисульфидных групп, и при значении этой разницы, равной 0,000±0,008 оптической единицы, определяют отсутствие окислительного стресса, а при положительном значении этой разницы дополнительно определяют количество промежуточных и минорных продуктов окислительной модификации биомолекул: белков, липидов, углеводов, нуклеиновых кислот, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой, и дополнительно определяют количество продуктов модификации биомолекул после предварительной химической индукции Fe²⁺ процессов^{перекисного окисления, определяют коэффициент окислительной модификации биомолекул эритротроцитов по формуле}

КОМБ_эр=(ТБЧ_эр+ТБЧ_эрInd)·(Е_д-sh-гр-E_i-sh-гр)·100,

где КОМБ_эр - коэффициент окислительной модификации биомолекул эритроцитов в окислительных единицах активности, ОЕА;

ТБЧ_эр - количество в эритроцитах промежуточных и минорных продуктов окислительной модификации биомолекул: белков, липидов, углеводов, нуклеиновых кислот, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой, в оптических единицах, ОE;

ТБЧ_эрInd - количество в эритроцитах промежуточных и минорных продуктов окислительной модификации биомолекул: белков, липидов, углеводов, нуклеиновых кислот, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой, индуцированных Fe²⁺ в оптических единицах, ОЕ;

Е_д-sh-гр - показатель среднего количества тиоловых групп гемолизата у практически здоровых людей, выраженный в оптических единицах, ОЕ, равный 0,174±0,004 ОЕ;

E_i-sh-гр - количество тиоловых групп гемолизата обследуемого человека, выраженное в оптических единицах, ОЕ;

100 - расчетный коэффициент,

и чем выше положительное значение КОМБ_эр, тем выше уровень окислительного стресса организма.