СПОСОБ ДЛИТЕЛЬНОГО ХРАНЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА Российский патент 2004 года по МПК A01N1/02 A61K35/12 C12Q1/68 C12N15/10 

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способам, использующим генетический материал животного или растительного происхождения, и может быть использовано, в частности, при идентификации человека, а также клонировании биологических объектов.

В рамках предлагаемого изобретения будут использованы следующие понятия и термины:

- биологический материал - любая ткань или жидкость живого организма (мышца, кусочек ногтя, волос, кожа, кость, капелька крови, слюна, иная биологическая жидкость, ткань растения, его сок и т.д.). Это понятие обобщает все виды материи биологического происхождения, из которой можно впоследствии выделить какую-либо информацию о биологическом существе, владельце данной ткани;

- генетический код - записанная в специальных обозначениях информация о последовательности аминокислот, составляющих ДНК биологического существа. Генетический код представляет собой систему зашифровки наследственной информации в молекулах нуклеиновых кислот, реализующейся у биологических организмов в виде последовательности нуклеотидов;

- генетический материал - дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК);

- ДНК - биополимер, состоящий из многих мономеров - дезоксирибонуклеотидов, соединенных через остатки фосфорной кислоты в определенной последовательности, специфичной для каждой индивидуальной ДНК. Уникальная последовательность дезоксирибонуклеотидов в данной молекуле ДНК представляет собой кодовую запись.

На сегодняшний день значительную сложность представляет идентификация неопознанных останков людей, возникающих в результате стихийных бедствий, техногенных происшествий, боевых действий и т.д. К сожалению, останки биологических объектов, которые могут быть идентифицированы как останки людей, зачастую находят в состоянии, практически не пригодном для опознания обычными методами. Останки могут представлять собой фрагменты тел, не содержащих особых примет, позволяющих с уверенностью опознать человека.

При этом опознание может быть проведено и по малейшим останкам человека с использованием генного анализа. Но для этого необходимо иметь материал сравнения, в качестве которого предпочтительно иметь образец тела человека.

Для профессий, связанных с повышенным риском, желательно заранее поместить на хранение в банк данных образец ткани, который будет использован для генного анализа при идентификации не опознаваемых другим способом останков.

В настоящее время известны различные способы сохранения образцов биологических материалов.

Для сохранения предложено использовать замораживание образца (SU, авторское свидетельство 395439), бальзамирование (SU, авторское свидетельство 1745765), заливку парафином (RU, патент 2031114), а также осаждение монослоя клеток ткани на носителе с последующим хранением образца в холодильнике (RU, патент 2014359).

Все вышеуказанные способы не обеспечивают длительность хранения образца биологического материала (в течение нескольких лет) из-за присутствия в образце влаги и кислорода, а также микроорганизмов, находящихся на поверхности образца и контейнера для ее хранения. Наличие в образце влаги и кислорода, а также его контакт с кислородом приводит в конечном счете к окислению биологического материала и непригодности его к использованию как источника генов организма, от которого взят образец.

Наиболее близким аналогом предложенного способа можно признать способ длительного хранения ДНК с последующим его использованием для проведения генетического анализа (WO 99/57264, 1999), включающий помещение обезвоженного образца в запаянную, не содержащую кислорода металлическую капсулу, причем перед капсулированием проводят изоляцию образца от внешней среды.

К недостаткам известного способа следует также отнести невозможность обеспечения длительности хранения из-за присутствия в образце значительных количеств влаги и кислорода.

Техническая задача, решаемая посредством предлагаемого изобретения, состоит в разработке способа длительного хранения образцов биологических материалов, позволяющего сохранить биологический материал, из которого можно будет получить впоследствии генетический код, сохранить биологический материал как можно дольше, без изменения его структуры и свойств, что позволит впоследствии выделить из него генетический материал или генетический код, сделать долговременное хранение надежным, долгим, при этом минимизировать затраты на это хранение.

Технический результат, получаемый в результате реализации изобретения, состоит в обеспечении возможности в течение длительного времени использовать генетический материал при минимизации затрат.

Для достижения указанного технического результата предложено использовать способ хранения биологического материала, включающий изоляцию образца биологического материала его от внешней среды с последующим выдерживанием его при низкой температуре, причем предварительно проводят сублимацию образца, помещенного в открытую емкость, до остаточного содержания влаги не свыше 6 мас.% и остаточного содержания кислорода не свыше 4 мас.% с последующей изоляцией образца и внутренней поверхности емкости от внешней среды, а выдерживание образца проводят при температуре, не превышающей +4°С. Обычно изоляцию от внешней среды осуществляют запаиванием емкости, последующим заполнением емкости инертным материалом, путем заполнения емкости инертным газом и герметизации или любым другим способом, не разрушающим ДНК. Хранение емкости могут осуществлять в термостатах, в отработанных соляных шахтах или любым другим способом, обеспечивающим сохранность образца. Для хранения образца используют преимущественно неметаллическую тару (стеклянную, полимерную, керамическую и т.д.). Емкость с биологическим материалом может быть помещена в более крупный контейнер. Одновременно емкость с биологическим материалом может быть промаркирована и/или содержать дополнительную информацию.

Экспериментально было установлено, что в процессе сублимации образца вместе с влагой из образца биологического материала удаляется и кислород, при этом на поверхности емкости погибают все микроорганизмы. По этой причине продолжительность хранения образца значительно увеличивается. Последующая изоляция образца и емкости от влаги и кислорода воздуха способствует длительному хранению. Использование для хранения термостатов или выработанных соляных шахт с их постоянством температуры и влажности позволяет неограниченно увеличить срок хранения образца биологического материала.

В общем случае изобретение реализуют следующим образом.

Образец биологического материала, помещенный в емкость, сублимируют с использованием стандартного оборудования, при этом устраняют микробиологические загрязнения, а также удаляют воду и кислород из образца. Емкость закрывают, предварительно создав вокруг образца биологического материала химически нейтральную среду. При этом в сосуде создают вакуум, или воздух в сосуде замещают инертным газом или инертной жидкостью, жидким полимером, парафином или иной инертной средой. После этого емкость с образцом герметизируют любым известным способом (запаивают, заклеивают, заваривают, завинчивают, закрывают притертой (плотной крышкой)). Это обеспечит невозможность попадания в емкость и контакта с образцом биологического материала микроорганизмов, окислителей и влаги. Емкость с образцом помещают на хранение при температуре, близкой к 0°С в условиях исключения возможности резких скачков (перепадов) температуры. Это обеспечит лучшее хранение, т.к. резкие перепады температуры влияют на состояние биологически активного материала. Это может быть обеспечено помещением емкости для длительного хранения в подвал, пещеру, шахту, под воду на глубину, где температура постоянно равна 4°С, а также в иные места хранения, где обеспечивается указанное требование. Место хранения должно быть защищено от солнечного (ультрафиолетового) излучения, а также радиоактивного излучения, кроме естественного радиационного фона. Емкости с биологическим материалом могут быть помещены в более крупные контейнеры (емкости). Это может обеспечивать большую защиту от внешних воздействий на сосуды (контейнеры), содержащие биологический материал. Это дополнительно обеспечит большую безопасность хранения и более легкий доступ к конкретным образцам (сосудам). Сосуды с биологическим материалом могут быть промаркированы, кроме того, в них может быть вложена дополнительная информация.

Экспериментально отмечено, что именно использование сублимации образца до остаточного содержания влаги не свыше 6 мас.% и остаточного содержания кислорода не свыше 4 мас.%, с последующим хранением его при температуре не свыше 4°С обеспечивает достижение указанного технического результата.

В дальнейшем изобретение будет раскрыто с использованием примеров реализации.

Образец мышечной ткани человека, работающего в условиях повышенной опасности, помещен в открытую стеклянную емкость с притертой крышкой. Предварительно были определены такие характеристики раствора ДНК, как оптическая плотность раствора, вязкость раствора, точка замерзания раствора, а также хроматограмма в тонком слое. Образец раствора ДНК был получен методом, аналогичным методу, охарактеризованному в патенте РФ 2011681. Открытую емкость с образцом помещают в камеру сублимации. После доведения остаточной влажности и кислорода в ткани до уровня 5 и 2 мас.% соответственно емкость вынимают из камеры сублимации. Емкость заливают под пробку предварительно прогретым до 120°С и охлажденным до комнатной температуры силиконовым маслом. Экспериментально установлено, что при используемых условиях сублимации на поверхности образца и емкости не остается живых микроорганизмов, как не остается влаги, кислорода и микроорганизмов в силиконовом масле. Заполненную силиконовым маслом емкость закрывают притертой пробкой. Маркируют емкость надписью, содержащей сведения о доноре ткани. Маркированную емкость помещают в пещеру, в которой отсутствуют перепады температуры и влажности, а средняя температура соответствует интервалу от +2 до +4°С. По истечении срока хранения 19 лет образец был извлечен из емкости и повторно проведен анализ ДНК. Полученные значения отличаются от ранее полученных в пределах ошибки эксперимента (0,02-0,07%). С учетом известных закономерностей изменения ДНК при хранении и на основании полученных экспериментальных данных путем экстраполяции срок хранения образца ДНК превышает 300 лет.

Образец ногтевой пластины летчика испытателя был помещен в полиэтиленовую емкость, выполненную с возможностью запаивания. Предварительно были определены такие характеристики раствора ДНК, как оптическая плотность раствора, вязкость раствора, точка замерзания раствора, а также термостойкость. Образец раствора ДНК был получен методом, аналогичным методу, охарактеризованному в патенте РФ 2011681. Емкость с образцом помещают в камеру сублимации, в которой доводят остаточную влажность образца до 4 мас.%, а содержание остаточного кислорода до 2 мас.%. Емкость заполняют обезвоженным диоксидом углерода и запаивают. На емкость наклеивают табличку, содержащую сведения о доноре ногтевой пластины. Емкость вместе с другими аналогичными емкостями помещают в контейнер, который выполнен из винипласта. Контейнер заполняют аргоном и заваривают. В дальнейшем контейнер помещают на морское дно на глубине примерно 100 м, где температура воды практически всегда равна +4°С. По истечении срока хранения 21 года образец был извлечен из емкости и повторно проведен анализ ДНК. Полученные значения отличаются от ранее полученных в пределах ошибки эксперимента (0,02-0,06%). С учетом известных закономерностей изменения ДНК при хранении и на основании полученных экспериментальных данных путем экстраполяции срок хранения образца составляет не менее 280 лет.

Образец древесины секвойи поместили в керамическую емкость. Предварительно были определены такие характеристики раствора ДНК, как оптическая плотность раствора, вязкость раствора, точка замерзания раствора, а также хроматограмма в тонком слое. Образец раствора ДНК был получен методом, аналогичным методу, охарактеризованному в патенте РФ 2011681. Емкость с образцом поместили в камеру сублимации. После обработки влажность древесины составила 5 мас.%, а содержание кислорода 3 мас.%. На поверхности емкости не осталось микроорганизмов. Внутреннюю полость емкости заполнили расплавленным парафином. На горячий парафин поместили керамическую крышку с герметизацией содержимого емкости. Емкость поместили в отработанную соляную шахту с неизменными условиями (температура +2°С и влажность 27%). По истечении срока хранения 19 лет образец был извлечен из емкости и повторно проведен анализ ДНК. Полученные значения отличаются от ранее полученных в пределах ошибки эксперимента (0,03-0,08%). С учетом известных закономерностей изменения ДНК при хранении и на основании полученных экспериментальных данных путем экстраполяции срок хранения образца превышает 500 лет.

Предложенный способ хранения биологического материала позволяет неограниченно долго хранить образцы, пригодные как для генного анализа, так и для клонирования.

Изобретение относится к области биотехнологии и касается способа длительного сохранения биологического материала. Сущность изобретения заключается в предварительной сублимации образца биологического материала, помещенного в открытую емкость, до остаточного содержания влаги не свыше 6 мас.% и остаточного содержания кислорода не свыше 4 мас.%, и выдерживания образца в емкости, не содержащей кислорода при температуре, не превышающей +4°С. Преимущество изобретения заключается в повышении длительности сохранения биологического материала. 9 з.п. ф-лы.

1. Способ длительного хранения биологического материала, включающий помещение обезвоженного образца в емкость, не содержащую кислорода, с последующим выдерживанием образца, причем перед капсулированием проводят изоляцию образца от внешней среды, отличающийся тем, что предварительно проводят сублимацию образца, помещенного в открытую емкость, до остаточного содержания влаги не свыше 6 мас.% и остаточного содержания кислорода не свыше 4 мас.%, а выдерживание образца проводят при температуре, не превышающей +4°С.2. Способ по п.1, отличающийся тем, что изоляцию от внешней среды осуществляют запаиванием емкости.3. Способ по п.1, отличающийся тем, что изоляцию от внешней среды осуществляют последующим заполнением емкости инертным материалом.4. Способ по п.1, отличающийся тем, что изоляцию от внешней среды осуществляют путем заполнения емкости инертным газом и герметизации.5. Способ по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что хранение осуществляют в термостатах.6. Способ по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что хранение осуществляют в отработанных соляных шахтах.7. Способ по любому из пп.1-6, отличающийся тем, что хранение осуществляют в стеклянной таре.8. Способ по любому из пп.1-6, отличающийся тем, что хранение осуществляют в полимерной таре.9. Способ по любому из пп.1-8, отличающийся тем, что емкость с биологическим материалом помещена в более крупный контейнер.10. Способ по любому из пп.1-8, отличающийся тем, что емкость с биологическим материалом промаркирована или содержит дополнительную информацию.