СПОСОБ ИММОБИЛИЗАЦИИ ОБРАЗЦОВ ДНК Российский патент 2009 года по МПК C12N15/10 

Изобретение относится к области молекулярно-генетических исследований при создании генетических коллекций для длительного хранения наследственного материала различного происхождения.

В настоящее время наиболее распространенным способом ведения коллекций материалов для молекулярно-генетического анализа является хранение ДНК содержащих тканей. Степень сохранности ДНК при разных вариантах этого способа значительно варьирует.

Охлаждение проб, содержащих нуклеиновые кислоты, до +4°С может лишь приостановить процессы биодеградации. Для более длительного хранения используют низкие температуры от -20°С до -195,8°С, например, в условиях промышленных холодильных установок или в жидком азоте.

Критическим моментом в организации хранения замораживаемых биологических проб является необходимость поддержания оптимального температурного режима криоконсервации. В идеальном случае, при хранении проб в жидком азоте температура постоянно поддерживается на уровне точки кипения жидкого азота -195,8°С. Этот режим позволяет осуществлять быстрое замораживание ткани в максимально щадящем режиме, не ограничивать срок хранения без каких-либо потерь биологических свойств материала.

В промышленных холодильных установках при относительно высоких температурах (до -30°С) процесс замораживания образцов намного более растянут во времени по сравнению с условиями в жидком азоте. Это приводит к тому, что в биологических пробах формируются относительно крупные кристаллы льда и лакуны, наполненные большими концентрациями электролитов, вымороженных из тканей в процессе постепенного охлаждения. Сформированная таким образом структура ткани ведет к появлению относительно большего количества повреждений молекул ДНК, более того, количество повреждений впоследствии может увеличиваться при неправильно подобранном температурном режиме хранения.

Биологические ткани в отличие от воды содержат большое количество электролитов и органических веществ, существенно понижающих температуру замерзания растворов. Это приводит к тому, что образцы ткани при температуре хранения -20°С и выше претерпевают многократные циклы замораживания-оттаивания (специфика работы любой холодильной установки заключается в том, что для поддержания заданной температуры компрессор холодильника периодически включается и выключается, вызывая колебания температуры относительно заданной точки). Многократное замораживание-оттаивание приводит к разрушению микрокристаллами льда внутриклеточных структур и больших молекул, что значительно ускоряет биодеградацию размороженных проб, если оперативно не приступить к экстракции ДНК с сопутствующей инактивацией внутритканевых ДНК-аз. Учитывая данные по реологическим свойствам биологических тканей при замораживании, оптимальным для их хранения следует признать температурный режим не ниже -40°С (Корниенко И.В. и др. Подготовка биологического материала для молекулярно-генетических идентификационных исследований при массовом поступлении неопознанных тел. - Ростов н/Д. 2001).

К недостаткам метода криоконсервации следует отнести также потенциальную возможность сохранения патогенных возбудителей вместе с образцом, необходимость постоянного поддержания бесперебойной работы холодильного оборудования и обязательной организации фиксации терморежимов хранения и бесперебойного энергоснабжения (если речь идет о холодильных установках). Кроме того, по мнению ряда исследователей в замороженном состоянии повреждающее действие свободных радикалов может сохраняться.

Возможна консервация ДНК-содержащих образцов этиловым спиртом, формалином или их сочетанием, которые обезвоживают ткани и обладают антимикробным, антиферментным и антиокислительным действием. В случае сбора объемных фрагментов тканей в полевых условиях проникновение этанола на всю толщу образца может занять некоторое время и деструктивные автолитические процессы могут затронуть значительную часть ДНК. Поэтому при сборе материала необходимо точно выдерживать подобранное соотношение проба - фиксатор и наиболее предпочтительно использовать двойную фиксацию в этаноле с последующим замораживанием. Выбор вида консервируемой ткани также определяет процедуру подготовки и возможный период хранения (см. Воинова Н.В., Чистяков В.А., Тимошкина Н.Н. и др. ДНКазная активность гомогенатов метаболически активных тканей русского осетра Acipenser gueldenstaedtii (Acipernseridae) как показатель пригодности тканей для генетического коллекционирования. / Вопросы ихтиологии, 2001, Т.41, №6, с.842-845).

Предполагаемое расширение объемов действующих генетических коллекций в случае подготовки и хранения материалов вышеперечисленными способами обусловливает особые требования к занимаемой площади, дорогому, крупногабаритному оборудованию.

Известен способ хранения методом FTA Gene Guard (IsoCode производства Schleicer & Schuell, Germany) (4, 54. Hide G, Hughes JM, McNuff R. A rapid and simple method of detection of Blepharisma japonicum using PCR and immobilization on FTA paper.5. Comprasion of IsoCode STIX and FTA Gene Guard Collection Matrices as Whole-Blood Storage and Processing Devices for Diagnosis of Malaria by PCR). Метод FTA Gene Guard предполагает нанесение проб биологических жидкостей на фильтровальную бумагу, обработанную буфером, содержащим мощные денатурирующие вещества, которые также предотвращают рост бактерий и других микроорганизмов. Клеточные элементы биологической пробы на FTA-бумаге подвергаются лизису. ДНК высвобождается из ядер лейкоцитов и иммобилизуется на матриксе бумаги. Связанная таким образом ДНК может быть освобождена от гема или других ингибиторов ПЦР отмыванием, после чего FTA-бумага с иммобилизованной на ней ДНК может вводиться непосредственно в соответствующую амплификационную смесь. Указанный прототип имеет ряд ограничений. Во-первых, методы предназначены для работы с узким перечнем тканей (кровь и биологические жидкости). Во-вторых, количество иммобилизуемой ткани (10 мкл крови человека), а значит, и нуклеиновых кислот невелико. В-третьих, сохраняются, по сути, не чистые препараты ДНК, а ее конгломерат с остатками фиксируемых тканей и реагентов. В-четвертых, качество получаемых препаратов ДНК ограничивает их применение в исследованиях молекулярно-генетическими методами, предъявляющими жесткие требования к чистоте матрицы (RAPD, AFLP).

Наиболее близким является способ длительного хранения молекул ДНК, подготовка к которому заключается в осуществлении после выделения и очистки ДНК любым подходящим способом, обычным или необычным, инкапсулирования молекул ДНК, предварительно обезвоженных, в герметичную нержавеющую металлическую капсулу в атмосфере, состоящей из одного или нескольких инертных газов и имеющей степень влажности меньше или равную 1 млн^-1 воды, или перед заключением в металлическую капсулу дополнительно проводят химическое инкапсулирование путем помещения в защитную оболочку из соответствующего полимера (см. патент РФ 2228358 C12N 5/10 А61К 9/48, 1998 г). Затем ДНК помещают в металлическую капсулу и хранят.

Данный способ имеет ряд существенных преимуществ по сравнению с предыдущими, однако он значительно дорог и требует больших затрат времени и наличия специального оборудования для обезвоживания.

Технической задачей заявленного способа является обеспечение длительного хранения после выделения и очистки молекул ДНК в условиях лаборатории при комнатной температуре, при этом обеспечивается доступность материала для исследователя; единообразие характеристик ДНК, используемой в разное время и для разных методик; возможность точного количественного и качественного контроля сохранности проб, удобный и экономный способ коллекционирования большого количества проб. Качество иммобилизованной ДНК позволяет использовать такие препараты для методов молекулярно-генетического анализа как митохондриального, так и ядерного генома.

Практическое значение изобретения определяется его преимуществами по сравнению с вышеприведенными способами подготовки ДНК к хранению и сводится к следующему:

- дает возможность создавать представительные репрезентативные коллекции генетических ресурсов растений и животных. Основная задача таких коллекций - сохранение целостности наследственного материала в количестве, достаточном для проведения молекулярно-генетических манипуляций, в частности ДНК-идентификации при определении географического и видового происхождения, продуктов промышленной переработки, в оценке популяционно-генетических характеристик видов, болезней и др.;

- позволяет надежно хранить препараты ДНК, выделенных из любых образцов тканей, без использования холодильного оборудования и дорогостоящих консервантов.

Стоимость холодильников низких температур, которые на сегодняшний день используются для хранения коллекций генетических ресурсов, превышает 20 тыс. евро, стоимость жидкого азота (требующего дополнительных энергоемких установок) постоянно растет, а существующие консерванты не всегда гарантируют эффективную сохранность ДНК, в частности защиту от повреждающего эффекта активных форм кислорода. Предлагаемый способ позволяет по мере необходимости постоянно наращивать объемы коллекций при относительно небольших материальных затратах, связанных с приобретением минимального комплекта реактивов, необходимых для выделения ДНК.

- обеспечивает легкость обмена между заинтересованными организациями, дешевизной транспортировки и отсутствием карантинных препятствий, при этом сохраняемая ДНК в любой момент доступна для молекулярного анализа без предварительных манипуляций по выделению.

Поставленная задача достигается путем осуществления в способе иммобилизации образцов ДНК, предусматривающем выделение, очистку и заключение в защитную оболочку, при этом иммобилизацию проводят двойным объемом 96°-ого этанола на бумажный носитель, а защитную оболочку наносят путем ламинирования, режим холодного ламинирования или при температуре не более плюс 80°С, пленка 80-150 мкм, а образцы ДНК берут в водном растворе.

Способ осуществляется следующим образом.

Для обеспечения длительного хранения образцов после выделения и очистки одним из методов органической экстракции образец ДНК в виде 100-500 мкл водного раствора наносят на обеззоленную фильтровальную бумагу размером 3×3-10×10 см, аккуратно промывают двойным объемом 96°-ного этанола. Полученные носители с ДНК в течение 30 минут подсушивают в термостате при температуре 50°С и ламинируют, поместив последовательно между листами стандартной офисной бумаги (например, SVETOCOPY, плотностью 80 г/м²) и ламинатной пленкой (толщина 80-150 мкм). Условия и режим ламинирования: режим холодного ламинирования или при температуре не более плюс 80°С, пленка 80-150 мкм. Условия приведенны в табл.1.

После периода хранения фильтровальную бумагу с образцом ДНК извлекают из пленки, измельчают ножницами бумажный носитель с ДНК, которую экстрагируют в 600 мкл ТЕ-буфера в течение одного часа при 36°С, периодически встряхивая на вортексе.

Способ прост в исполнении, имеет низкую себестоимость и при этом длительное время хранения, не влияет на качество иммобилизованной ДНК, что позволяет использовать такие препараты для методов молекулярно-генетического анализа, основанных на амплификации как митохондриальной, так и ядерной ДНК.

Таблица 1Рекомендуемые условия ламинирования препаратов иммобилизованной ДНКРежим ламинированияТип пленки, составМатериал изоляцииЛаминаторГорячее двустороннее ламинирование с температурой нагрева 80°СКонвертная толщиной 100-150 мкн, основа - полиэстер PET >50%, LDPE - полиэтилен низкой плотности, клеящий слой EVA - этиленвинилацетатБумага от 80 г/м²Конвертный с горячими валамиКонвертная толщиной 75-150 мкн, основа - поливинилхлорид PVC, клеящий слой, EVA - этиленвинилацетатБумага от 80 г/м²Конвертный с горячими валамиДвойное ламинирование:   - холодное двустороннее ламинирование с температурой нагрева до 30°СКонвертная толщиной 75/80 мкн, основа - полиэстер PET >50%, LDPE - полиэтилен низкой плотности, клеящий слой EVA - этиленвинилацетатБумага от 80 г/м²Конвертный с валами- горячее двустороннее ламинирование с температурой нагрева до 80°СКонвертная толщиной 100-150 мкн, основа РЕТ >50% или PVC-Конвертный с горячими валами

Пример осуществления способа

Для иммобилизации на твердом носителе нами были взята ДНК, выделенная из коллекционных образцов русского осетра, отобранных в разные годы с 1999 по 2005. Образцы с каталожными номерами №1555-1565 в нашей генетической коллекции представлены разными тканями (икра, плавник, печень, селезенка). ДНК выделяли из всех имеющихся тканей для сравнительного анализа ее сохранности.

Иммобилизацию и ламинирование ДНК (выделенной из каталожных проб) на фильтре проводили в три этапа:

I этап. Выделение ДНК из образцов соматических тканей русского осетра фенол-хлороформным способом (3).

II этап. Спектрофотометрический анализ качества и количества выделенной ДНК.

III этап. Иммобилизация ДНК, растворенной в бидистиллированной воде, на фильтр и ламинирование.

Таблица 2Сравнительная характеристика проб ДНК русского осетра до и после иммобилизации№ п/пВид тканиD₂₆₀/D₂₈₀ до иммобилизацииКонцентрация ДНК мкг/млD₂₆₀/D₂₈₀ после иммобилизацииКонцентрация ДНК, мкг/млВыход ДНК после хранения, %1плавник1,9611101,891020922плавник1,7910501,751020973плавник1,85401,65420784плавник1,9512301,951200985плавник1,7813801,641125826плавник1,747051,74495707плавник1,8310951,81990908плавник1,7615451,661480969плавник1,815701,84207410плавник1,820551,7815457511икра2,1616501,9113508212икра1,757201,66308813икра1,815151,8915009914икра1,88851,748109215икра1,693301,673009129печень1,7833101,7630509130печень1,7521001,7520109631печень1,7132101,728909033печень1,7325651,7118757334печень1,7524451,7521508835селезенка1,7519651,7317508937селезенка1,7525651,7523409139селезенка1,7621151,7520259642селезенка1,7114101,6711508251селезенка1,7814851,76102569

Раствор ДНК разделили пополам. Первую часть водного препарата ДНК иммобилизовали на бумажном носителе, как описано выше. Вторую - осадили 96°-ным этиловым спиртом в присутствии 0,01 М NaCl, промыли 70° и оставили в 96°-ном этаноле при -62°С в качестве контроля.

По истечении 12 месяцев проверили сохранность ДНК, иммобилизованной на твердом носителе. Качественная и количественная характеристика проб ДНК на основании спектрофотометрических измерений приведена в табл.2.

В среднем выход иммобилизованной на твердый носитель ДНК после хранения составил 87%. При этом сохранилось качество ее очистки, что подтверждает спектрофотометрический анализ. Степень фрагментации препаратов ДНК продемонстрирована на электрофореграмме (чертеже). Препараты содержат как низкомолекулярный шлейф фрагментов тотальной ДНК, так и тяжелые фракции более 1000 пар нуклеотидов (пн). Изображение было проанализировано с помощью программы Biotest (Biokom). Для каждой дорожки был построен линейный профиль светимости (S), оцифрованный в условных единицах. Для количественной характеристики степени фрагментации пробы ДНК был вычислен коэффициент, равный отношению S_h области высокомолекулярной ДНК (≥225 пн) к S₁ области низкомолекулярной. В табл.3 приведены значения этого коэффициента для проб ДНК до и после иммобилизации. Достоверных различий опыта от контроля не обнаружено (Р<0.01).

Таблица 3Коэффициент степени фрагментации ДНК (S_h/S₁)Номер пробыS_h/S₁ до иммобилизацииS_h/S₁ после иммобилизации11,651,6021,931,8031,881,8941,801,6850,810,71

Приведенные данные свидетельствуют о сохранности иммобилизованной ДНК и ее пригодности для молекулярно-генетического анализа с использованием методов, чувствительных к качеству матрицы.

Практическое значение изобретения состоит в том, что оно дает возможность предварительной подготовки представительных коллекций препаратов ДНК, выделенных из любых образцов тканей, для надежного бессрочного хранения.

Изобретение относится к области молекулярной биологии. Предложен способ иммобилизации ДНК, где очищенную ДНК иммобилизируют 96°-ным спиртом на бумажный носитель, а защитную оболочку наносят путем ламинирования. Способ позволяет обеспечить длительное хранение ДНК при комнатной температуре. Изобретение можно использовать при создании генетических коллекций для длительного хранения наследственного материала. 3 табл., 1 ил.

Способ иммобилизации образцов ДНК, предусматривающий выделение, очистку и заключение в защитную оболочку, отличающийся тем, что иммобилизацию проводят двойным объемом 96°-ного этанола на бумажный носитель, а защитную оболочку наносят путем ламинирования, режим холодного ламинирования или при температуре не более плюс 80°С, пленка 80-150 мкм, а образцы ДНК берут в водном растворе.